本文所述方案可通过单细胞质谱流式细胞术对肌肉干细胞和祖细胞进行鉴定和高维分析，并通过荧光激活细胞分选（FACS）对其进行纯化，以深入研究其功能。该方法可用于研究疾病模型中的再生动态，并评估药物干预的效果。
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本文内容
摘要
摘要
骨骼肌再生是由成体肌肉干细胞及其子代细胞驱动的动态过程。在稳态下，成体肌肉干细胞大多处于静息状态，但在肌肉损伤后会被激活。激活后，这些细胞开始增殖，其大部分子代细胞分化为具有融合能力的肌细胞，而其余部分则通过自我更新以补充干细胞库。尽管肌肉干细胞的身份早在十余年前即已通过细胞表面标志物的共表达得以确定，但肌源性前体细胞直到最近才借助高维单细胞技术被鉴定出来。本文介绍一种单细胞质谱流式技术（飞行时间质谱流式，CyTOF），用于分析急性肌肉损伤中的干细胞与前体细胞，以解析肌肉再生过程中发生的细胞与分子动态变化。该方法基于同时检测新型细胞表面标志物和关键的肌源性转录因子，这些因子的动态表达有助于识别处于激活状态的干细胞及前体细胞群体，从而揭示肌生成过程中的关键节点。尤为重要的是，本文描述了一种基于检测细胞表面标志物CD9和CD104的分选策略，可利用荧光激活细胞分选（FACS）对肌肉干细胞和前体细胞进行前瞻性分离，以便深入研究其功能。肌肉前体细胞为研究肌肉干细胞命运调控、发现肌肉疾病的新治疗靶点以及开发再生医学中的细胞治疗应用提供了关键的缺失环节。本文所提出的方法可用于研究肌肉干细胞与前体细胞 体内 在应对特定信号通路的药理学干预等扰动时，该方法可用于研究肌肉疾病动物模型中肌肉干细胞与前体细胞的动态变化，从而加深对干细胞相关疾病的理解，并加速治疗策略的开发。
引言
骨骼肌是人体中质量最大的组织，调控多种功能，从视力到呼吸，从姿势维持到运动，以及新陈代谢1。因此，维持骨骼肌的完整性和功能对健康至关重要。骨骼肌组织由紧密排列的多核肌纤维束构成，肌纤维周围分布着复杂的神经和血管网络，具有显著的再生潜能1,2。
骨骼肌再生的主要驱动因素是成体肌肉干细胞（MuSCs）。由于其独特的解剖位置位于肌纤维质膜旁且基底膜下方，这类细胞也被称为卫星细胞，于1961年首次被发现3。MuSCs表达一种独特的分子标志物——转录因子Pax7（paired box 7）4。在健康成人体内，这些细胞大多处于静息状态，但在肌肉损伤后会被激活，增殖并产生子代细胞，这些子代细胞将（i）分化为具有融合能力的肌细胞，形成新的肌纤维以修复肌肉损伤，或（ii）自我更新以补充干细胞库5。
在细胞和分子水平上，再生过程具有高度动态性，涉及细胞状态的转变，其特征是关键成肌转录因子（也称为成肌调节因子，MRFs）的协调表达。6,
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方案
动物实验已获得丹麦动物实验监察局批准（方案编号 # 2022-15-0201-01293），并按照奥胡斯大学的机构指南进行。在损伤前24小时，将镇痛药（布托啡诺）加入饮水中，使小鼠适应其味道。损伤后继续在饮水中提供布托啡诺24小时。在急性肌肉损伤时，联合皮下（s.c.）注射布托啡诺，并在注射竹节蛇毒蛋白（notexin）后继续通过饮水给予布托啡诺，可缓解与损伤相关的疼痛。尽管建议在急性肌肉损伤时给予皮下注射布托啡诺，随后通过饮水给予布托啡诺，但损伤前通过饮水给予布托啡诺为可选步骤。然而，研究人员必须遵守相应监管机构制定的动物福利标准和指南。
注意：对于受损后肢肌肉的单细胞质谱流式细胞术（CyTOF）实验，应从第1节开始：在肌肉损伤前24小时至损伤后24小时期间，通过饮水给予镇痛处理。对于从未受伤小鼠中分选肌肉干细胞和前体细胞，需执行第5和第6节：安乐死及骨骼肌的分离与解离，并继续进行第11节：使用荧光素偶联抗体进行FACS染色。 实验设计与操作流程的总体概述见图1。
1. 肌肉损伤前24小时至损伤后24小时期间在水中进行镇痛处理
- 向一个避光或用铝箔包裹的饮水瓶中加入 3 mL 丁丙诺啡（0.3 mg/mL），再用过滤水定容至 100 mL，使终浓度为 0.009 mg/mL，在损伤前 2....
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结果
本文介绍了采用该联合方法的实验设计概览，包括：（i）通过注射notexin构建急性损伤时间序列，利用高维CyTOF技术分析骨骼肌中干细胞与前体细胞的细胞及分子动态变化（图1，上图方案）；以及（ii）利用两种细胞表面标志物CD9和CD104对干细胞与前体细胞进行FACS分选，以分离这些细胞群体并深入研究其功能（图1，下图方案）。本研究所述实验均使用8至10周龄的雌性C57BL/6小鼠。
用于急性损伤过程中识别骨骼肌干细胞与祖细胞及其细胞与分子动态研究的CyTOF分析
我们重新分析了已公开发布的、通过注射notexin诱导急性损伤时间过程的CyTOF数据集，其中骨骼肌样本使用一组包含21种金属偶联的、适用于CyTOF的抗体进行染色19 (图2 和 图3
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讨论
骨骼肌再生是一个依赖成体干细胞功能的动态过程。尽管以往的研究主要关注肌肉干细胞在再生过程中的作用，但其子代细胞的功能 体内 由于缺乏用于识别和分离这些细胞群体的工具，该领域研究尚不充分15,16,17,18在此，我们介绍一种可同时鉴定并分离肌肉干细胞与前体细胞的方法 体内 在骨骼肌中，并解析其在急性肌肉损伤背景下的细胞与分子动态变化19.
本文介绍的方法结合了高维质谱流式细胞术（CyTOF）分析与细胞分选技术，为深入理解细胞状态转变如何驱动有效的组织再生提供了工具，并揭示了在衰老及肌肉疾病过程中干细胞功能的改变52。在遗传性小鼠模型中或药物干预后，不同细胞群体相对比例的变化可为肌生成过程提供机制性见.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢奥胡斯大学生物医学系FACS核心设施的成员提供的技术支持。感谢生物医学系质谱流式细胞术单元负责人Alexander Schmitz给予的讨论和帮助。科学插图使用Biorender.com制作。本研究由奥胡斯大学研究基金会（AUFF）启动资助以及诺和诺德基金会启动包资助（0071113）支持，资助对象为E.P。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 离心管 | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 20 G 针头 | KDM | KD-fine 900123 | |
| 28 G，0.5 mL 胰岛素注射器 | BD | 329461 | |
| 29 G，0.3 mL 胰岛素注射器 | BD | 324702 | |
| 3 mL 注射器 | 泰尔茂医疗 | MDSS03SE | |
| 40 µm细胞滤筛 | Fisher Scientific | 11587522 | |
| 5 mL聚丙烯管 | Fisher Scientific | 352002 | |
| 5 mL 聚苯乙烯试管，含 35 µm细胞滤筛 | Falcon | 352235 | |
| 5 mL 注射器 | 泰尔茂医疗 | SS05LE1 | |
| 50 mL 离心管 | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-碘-2-脱氧尿苷（IdU） | 默克 | I7125-5g | |
| 抗CD104 FITC（克隆号：346-11A） | Biolegend | 123605 | 储备液 = 0.5 mg/mL |
| 抗CD11b APC-Cy7（克隆：M1/70） | Biolegend | 101226 | 储备液 = 0.2 mg/mL |
| 抗CD31 APC-Cy7（克隆号：390） | Biolegend | 102440 | 储备液 = 0.2 mg/mL |
| 抗CD45 APC-Cy7（克隆：30-F11） | Biolegend | 103116 | 储备液 = 0.2 mg/mL |
| 抗CD9 APC（克隆：KMC8） | 赛默飞世尔科技 | 17-0091-82 | 储备液 = 0.2 mg/mL |
| 抗Sca1（Ly6A/E）APC-Cy7（克隆：D7） | Biolegend | 108126 | 储备液 = 0.2 mg/mL |
| 抗-α7整合素 PE（克隆：R2F2） | 不列颠哥伦比亚大学抗体实验室 | 67-0010-05 | 储备液 = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III（4 激光）仪器 | BD 生物科学 | N/A | 405、488、561 和 633 nm 激光器 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| 布托啡诺 0.3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104（克隆号：346-11A） | BD 生物科学 | 553745 | Dy162；实验室自制偶联物 |
| CD106/VCAM-1（克隆：429 MVCAM.A） | Biolegend | 105701 | Er170；实验室自制偶联物 |
| CD11b（克隆：M1/70） | BD 生物科学 | 553308 | Nd148；实验室内部偶联 |
| CD29/整合素 β1（克隆：9EG7） | BD 生物科学 | 553715 | Tm169；实验室内部偶联 |
| CD31（克隆：MEC 13.3） | BD 生物科学 | 557355 | Sm154；实验室内部偶联 |
| CD34（克隆：RAM34） | BD 生物科学 | 551387 | Lu175；实验室内部偶联 |
| CD44（克隆：IM7） | BD 生物科学 | 550538 | Yb171；实验室内部偶联 |
| CD45（克隆：MEC 30-F11） | BD 生物科学 | 550539 | Sm147；实验室自制偶联物 |
| CD9（克隆：KMC8） | 赛默飞世尔科技 | 14-0091-85 | Yb174；实验室内部偶联 |
| CD90.2/Thy1.2（克隆：30-H12） | BD 生物科学 | 553009 | Nd144；实验室自制偶联物 |
| CD98（克隆：H202-141） | BD 生物科学 | 557479 | Pr141；实验室内部偶联 |
| 细胞获取溶液/Maxpar CAS缓冲液 | 标准生物工具 | 201240 | |
| Cell-ID 插入剂-铱 | 标准生物工具 | 201192B | 阳离子核酸嵌入剂 |
| 顺铂 | 默克 | P4394 | Pt195 |
| 顺铂（cis-二氨合铂(II)二氯化物） | 默克 | P4394 | |
| 1.5 mL 透明离心管 | Fisher Scientific | 11926955 | |
| 胶原酶 II 型 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| 计数室 | 默克 | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1（克隆：2B11/CXCR4） | BD 生物科学 | 551852 | Gd158；实验室内部偶联 |
| DAPI（1 mg/mL） | BD 生物科学 | 564907 | |
| 暗色1.5 mL离心管 | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | 赛默飞世尔科技 | 17105041 | |
| 解剖剪 | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM（低糖，含丙酮酸钠） | 赛默飞世尔科技 | 11885-092 | |
| EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐） | 默克 | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ四元素校准微球（EQ微球） | 标准生物工具 | 201078 | 校准微球 |
| 胎牛血清，经鉴定，巴西来源 | 赛默飞世尔科技 | 10270106 | |
| Dumont #5SF 镊子 | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dumont #7 镊子 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| 山羊血清 | 赛默飞世尔科技 | 16210-072 | |
| Helios CyTOF 系统 | Standard Biotools | N/A | |
| 马血清，热灭活，新西兰来源 | 赛默飞世尔科技 | 26-050-088 | |
| IdU | 默克 | I7125 | I127 |
| 铱-嵌入剂 | 标准生物工具 | 201240 | Ir191/193 |
| 异氟烷/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5（克隆：C-20） | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173；实验室内部偶联 |
| MyoD（克隆号：5.8A） | BD 生物科学 | 554130 | Dy164；实验室自制偶联物 |
| MyoG（克隆：F5D） | BD 生物科学 | 556358 | Gd160；实验室内部偶联 |
| Nalgene 快速流速无菌一次性瓶顶滤器 0.20 μM PES 滤膜 | 赛默飞世尔科技 | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | 重悬至 50 µ微克/毫升，溶于无菌 PBS。保存储备液（如 50） µl) 在 -20 °C |
| 营养混合物 F-10（Ham's） | 赛默飞世尔科技 | 31550031 | |
| pAkt（克隆：D9E） | 标准生物工具 | 3152005A | Sm152 |
| Pax7（克隆：PAX7） | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153；实验室内部偶联 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL）（Pen/Strep） | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | |
| PES 滤器单元 0.20 μM | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES注射器滤器 | Fisher Scientific | 15206869 | |
| 培养皿 | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% 电镜级 | MP Biomedicals | 219998320 | |
| 氯化钾（KCl） | Fisher Scientific | 10375810 | |
| 磷酸二氢钾 无水（KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb（克隆：J112-906） | 标准生物工具 | 3166011A | Er166 |
| pS6激酶（克隆：N7-548） | 标准生物工具 | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1（克隆：E13-161.7） | BD 生物科学 | 553333 | Nd142；内部偶联 |
| 叠氮化钠 | Sigma Aldrich | S2002 | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher Scientific | 10553515 | |
| 磷酸氢二钠七水合物（Na2HPO4-6H2O | 默克 | S9390 | |
| 0.9% 无菌生理盐水溶液 | Fresenius | B306414/02 | |
| α7整合素（克隆号：3C12） | MBL国际 | K0046-3 | Ho165；实验室自制偶联物 |
参考文献
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462(2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A. Or....
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重印与许可
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