Rhodiola crenulata 的野外采集与实验室常规鉴定

摘要

本文介绍了红景天（Rhodiola Crenulata）的生境分布、植物形态、药用特性、显微特征及薄层色谱鉴别方法。

摘要

药材鉴定是保障用药安全的前提和基础。大多数科研人员必然倾向于选择简便、快速、有效且成本低廉的中药材鉴定方法。Rhodiola crenulata 是一种生长在高海拔地区的传统藏药，主要分布在中国西藏、云南和四川地区。Rhodiola crenulata 具有多种生物活性，如抗炎、抗缺氧和抗氧化作用，具有广阔的发展潜力。随着市场需求的增加和资源储量的迅速减少，大量混淆品给Rhodiola crenulata的鉴定带来了困扰。因此，本实验方案介绍了一种结合常规实验室检测的野外Rhodiola crenulata鉴定标准流程。通过生境特征、显微结构与薄层色谱相结合的方法，无疑能够快速、高效且经济地鉴定Rhodiola crenulata，从而促进藏药的可持续发展以及药材的质量控制。

引言

中药在中国具有悠久的历史和丰富的应用经验，最早在《神农本草经》中进行了系统记载¹。青蒿素的发现及其在疟疾治疗中的应用，推动了中药发展进入新阶段¹。利用现代科学技术揭示中药的确切作用机制，提高了中药的利用率和需求量，为其开拓了新的国际市场^2,3,4。然而，这也引发了一系列负面影响。非专业人士对中药特性的认识模糊，导致中药的使用面临巨大的安全风险⁵。

红景天，一种属于 红景天 物种主要分布于中国西藏、云南西北部和四川西部。图1)^6,7. 红景天 包含红景天苷、酪醇、没食子酸及其他化合物，通过其功能用于治疗缺氧相关疾病 "益气活血，通脉平喘"^8,9,10,11实地调查表明 红景天 可发现于海拔4,000–5,600 m的高山流石滩、冲沟坡地及岩缝中。其生长环境寒冷，阳光充足且辐射强烈，属于高山草甸生态系统。 红景天 可根据生长地形呈层状和点状分布，并通过异花授粉进行基因流动。

属的花粉败育 红景天，非法开采和退化的生态环境使得 红景天 濒危物种^6,12鉴于其较高的药用价值 红景天，假冒产品预计将流入市场。本文介绍了其栖息地 红景天 以及一些便捷的实验室鉴定方法。首先，我们观察了其生长环境。 红景天 及其药用特性。其次，通过显微镜观察药用粉末的微观结构。最后一步是关键环节。药物中的代表性成分 红景天 根据这些组分在特定物质中的吸附或溶解性质差异进行分离和鉴定。基于DNA的药材鉴定或代谢组学分析方法较为复杂且成本较高¹³这些基础、便捷且经济的方法可快速鉴定 红景天.

方案

Rhodiola crenulata 采自中国四川省甘孜藏族自治州甘孜县卓达雪山（北纬31.44570°，东经99.96086°，海拔4892米）。该植物由成都中医药大学民族医药学院张毅教授鉴定为正品。

1. 样品采集 红景天

1. 拍摄Rhodiola crenulata的生境图。
2. 拍摄Rhodiola crenulata的全株、叶片、花萼和根茎。
3. 使用铁锹清理Rhodiola crenulata周围1米范围内的杂草和碎石，以确保后续采挖顺利进行。
4. 用锄头挖掘土壤，直至整个根际区域显露，然后采集主根。
   注意：药用部位所用的Rhodiola crenulata根及根茎应在秋季采集，此时花茎已枯萎。

2. 特征鉴定

1. 用肉眼观察Rhodiola crenulata的外观特征：主根和根茎呈短圆柱形，表面为棕色，具膜质黄色表皮并带有粉红色纹理，断面呈橙红色或酒红色。
2. 通过气味鉴别：靠近鼻部闻时，具有芳香气味。
3. 通过味道鉴别：取少量根放入嘴中，先含化后咀嚼，味微苦，随后转甜。

3. 药用粉末中淀粉粒的显微鉴定

1. 用刷子去除红景天（Rhodiola crenulata）表面的土壤，将其放入40 °C的烘箱中，并每隔24小时翻动药材一次。
   注意：以药材是否易于折断作为判断干燥程度的标准。
2. 使用粉碎机将干燥后的药材粉碎，并用3号药筛（见材料表）过滤药粉。
3. 取一洁净载玻片（见材料表），用解剖针挑取少量药粉（见材料表），均匀地置于载玻片前三分之一处，范围控制在2 mm以内。
4. 用玻璃滴管（见材料表）向药粉上滴加一滴去离子水。用镊子（见材料表）夹住盖玻片一端（见材料表），迅速接触液面，覆盖在药粉上。
   注意：用解剖针轻轻搅动水和药粉，确保样品混合均匀。载玻片、药粉与盖玻片之间不得有气泡。
5. 打开显微镜（见材料表），将步骤3.4中的载玻片放置于载物台上并固定。调节光源和粗调焦螺旋以观察到药粉，再调节细调焦螺旋直至组织结构清晰可见。切换至40倍物镜，观察淀粉粒。
   ​注意：淀粉粒呈单粒或复粒状，脐点呈人字形或裂缝状。

4. 药用粉末中导管、木栓细胞、纤维、木薄壁细胞及色素团块的显微鉴定

1. 取一干净载玻片（见材料表），用解剖针（见材料表）挑取粉末，并将其置于载玻片的三分之一处。
2. 使用玻璃滴管（见材料表）向粉末中加入一滴水合氯醛（见材料表）。用镊子（见材料表）夹持载玻片，在酒精灯上加热三次，每次1秒。
   注意：加热过程中应避免产生气泡。液体不流动时，表明透化已完成。
3. 使用玻璃滴管加入一滴甘油（见材料表）。用镊子夹住盖玻片一端，迅速接触液面，使其自然覆盖。
4. 打开显微镜，将载玻片放置于载物台上并固定。调节光源和粗调焦螺旋以观察粉末。调节细调焦螺旋直至组织清晰可见。切换至40倍物镜，观察导管、木栓细胞、纤维、木薄壁细胞及色素团块。
   ​注意：木栓细胞呈多边形或长多边形，螺纹导管具有明显的螺旋结构，木薄壁细胞中含有草酸钙砂晶，以及红色或红棕色的色素团块。

5. 红景天（Rhodiola crenulata）及其对照品薄层色谱（TLC）样品的制备

1. 将称量纸置于天平（见材料表）上，称取3 g Rhodiola crenulata粉末。
2. 将粉末转移至100 mL锥形瓶（见材料表）中，用大肚移液管加入25 mL甲醇（见材料表）。将锥形瓶放入超声仪中，设置功率为250 W，频率为40 kHz，时间为30 min（见材料表），然后启动仪器。
   注意：使用超声仪的目的是确保Rhodiola crenulata粉末完全溶解，同时不影响后续薄层色谱实验的结果。
3. 取出锥形瓶，用流动水冲洗瓶外壁至室温（RT）。
4. 用1 mL注射器吸取步骤5.3制备的液体800 µL，经0.22 µm微孔滤膜过滤（见材料表），收集400 µL Rhodiola crenulata中间段样品溶液至色谱样品瓶中。
5. 分别称取红景天苷、酪醇和没食子酸各2 mg（见材料表），加入3个独立的100 mL锥形瓶中。每个锥形瓶中用大肚移液管加入25 mL甲醇。
6. 将锥形瓶放入超声仪中，设置功率为250 W，频率为40 kHz，时间为30 min，并重复步骤5.3（见材料表）。
7. 用1 mL注射器吸取步骤5.6制备的液体800 µL，经0.22 µm微孔滤膜过滤（见材料表），分别收集400 µL中间段的红景天苷、酪醇和没食子酸标准溶液至相应的色谱样品瓶中。

6. 薄层色谱鉴定

1. 用移液器移取三氯甲烷（5 mL）、乙酸乙酯（4 mL）、甲醇（2 mL）和甲酸（0.5 mL）（见材料表）。加入双槽色谱缸的一侧（见材料表），振摇并混合均匀。盖上色谱缸上端盖子。
2. 将没食子酸、红景天苷、酪醇标准溶液及Rhodiola crenulata溶液分别置于样品架的 A1–A4 位置。
3. 将 5 cm × 10 cm 硅胶板（见材料表）放置在进样台上。启动自动进样仪（见材料表），打开气控阀。
4. 打开 visionCATS 软件（见材料表）。点击新建 > 新建文件夹（命名为Rhodiola crenulata 样品测试）> 确定。点击新建方法（命名为Rhodiola crenulata 样品测试）> 确定 > ATS 4。
5. 点击完成步骤定义。点击轨道分配以编辑描述（没食子酸、红景天苷、酪醇及Rhodiola crenulata样品）。
6. 点击HPTLC 步骤。设置薄层参数（5 cm × 10 cm）。选择点样类型（条带），设定参数（表1），然后点击确定按钮。
7. 打开填充/冲洗质量。勾选仅填充设定体积。将小瓶底部高度（mm）设为 0.5，点击确定按钮。
8. 点击执行方法。
9. 点击轨道分配按钮，勾选居中，并设置参数（表2）。
10. 点击继续按钮进行自动进样。
11. 关闭自动进样仪和气阀。从自动进样仪上取下硅胶板。
12. 将硅胶板放入步骤 6.1 中双槽色谱缸的另一侧，盖上上端盖子，预饱和 20 分钟。
13. 用镊子轻轻夹住薄层板上端，迅速将硅胶板放入展开剂中，并盖上上端盖子。
    注：当展开前沿距离薄层板上端 0.5–1.0 cm 时，取出硅胶板。
14. 待有机溶剂挥发后，在室温下将显色剂溶液喷洒至硅胶板表面，获得显色结果。
    注：显色剂溶液为含 2% FeCl₃ 和 1% K₃[Fe(CN)₆] 的水溶液。

结果

本实验方案描述了在野外识别和采集Rhodiola crenulata的方法。Rhodiola crenulata通常生长于高海拔地区的高山流石带、冲沟坡地及岩石缝隙中。Rhodiola crenulata的生境、全株、花和叶片见图2。Rhodiola crenulata具有红棕色的根茎（图3A），其药材粉末的代表性图像见图3B。根据上述实验方案，显微观察结果可归纳如下：1）木栓细胞呈棕黄色或无色，细胞较大，多角形或长多角形，细胞壁略增厚（图3C）；2）淀粉粒为单粒或复粒，脐点呈人字形或裂缝状（图3D）；3）导管主要为螺纹导管，排列紧密（图3E）；4）木薄壁细胞无色，椭圆形，成片分布，内含草酸钙砂晶（

讨论

有90多种 红景天 世界上的植物，其中超过60%的物种分布在中国，常见的包括 红景天，玫瑰红景天，无鳞红景天 和 Rhodiola algida¹⁷. 红景天 收录于《中华人民共和国药典》（2020年版）一部，是一种生长在高海拔地区的传统藏药。市场对该药材的需求 红景天 每年都在增加，因此确保正确使用该来源是保障安全使用的关键。特别是从田间采集到简单快速的实验室常规鉴定的标准化流程不容忽视。已有报道称，高效液相色谱、质谱以及简单序列重复间区分析可准确鉴定 Rhodiola crenulata 来自其他 红景天 物种，这一过程耗时、复杂且成本高昂^18,19,20同时，我们建立了多维度感官识别评价方法（电子鼻和颜色分析）以及高效液相色谱法，以进行区分 Rhodiola cren...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 微孔滤膜	Millipore	SLGP033RB
自动采样机	CAMAG	ATS 4
水合氯醛	福建文莱科技有限公司	ST1002
色谱的 样本 瓶子	浙江艾力特生命科学仪器有限公司	C0000008
锥形瓶	四川硕博有限公司	1121
盖玻片	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	10211818c
解剖针	上海冰禹流体技术有限公司	BY-5026
电子天平	SHIMADZU	ATX124
乙酸乙酯	成都科龙化工试剂有限公司	2022120901
甲酸	成都科龙化工试剂有限公司	2021110801
没食子酸	成都赫柏匹瑞有限公司	M-017
甘油	国药集团化学试剂有限公司	10010618
高速  破碎机	北京中兴伟业仪器有限公司	FW-100
甲醇	成都科龙化工试剂公司	20230108
显微镜	重庆奥普瑞仪器有限公司  有限公司	B203
显微镜载玻片	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
烘箱	上海跃进医疗器械有限公司	DHG-8145
药典筛	杭州兴润筛网厂	572423281330
移液器	常德碧凯美生物科技有限公司	120302008
红景天苷	成都赫柏普瑞生物有限公司	H-040
饱和水箱	Yancheng Liegu Technology Co., Ltd	10*20 P-1
硅胶板	烟台江友硅胶开发  有限公司	HSG20211227
三氯甲烷	成都科龙化工试剂公司有限公司	20221013-1
镊子	常德碧凯曼生物科技有限公司	130302027
酪醇	成都Herbpurify有限公司	L-042
超声设备	宁波新艺超声波设备有限公司	SB-8200DTS
移液管	常德碧凯曼生物科技有限公司	120301006