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方法文章

诱导背外侧膝状体核神经元内在兴奋性的长期可塑性

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DOI：

10.3791/65950

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2024年9月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unité de Neurobiologie des canaux Ioniques et de la Synapse (UNIS), UMR1072, INSERM, Aix-Marseille University

本文内容

摘要

在此，我们描述了一种在维持于体外的背外侧膝状核中继神经元中诱导神经元内在兴奋性长时程可塑性的实验方案。 离体 脑切片

摘要

背侧外侧膝状体核（dLGN）长期以来被认为仅作为视觉信息从视网膜传递至皮层区域的基本中继站，但近期研究发现，dLGN 主要神经元的功能可塑性可能被严重低估。然而，支持这些变化的细胞机制尚未得到充分探索。本文报道了一种在急性脑片制备的幼年大鼠背侧 dLGN 中继神经元中诱导神经元固有兴奋性长时程增强（LTP-IE）的实验方案。固有可塑性通常与突触可塑性平行发生，但在 dLGN 神经元中，仅通过 40 Hz 频率的放电活动持续 10 分钟即可稳定诱导 LTP-IE。dLGN 中继神经元中的 LTP-IE 具有持久性，在诱导后可维持长达 40 分钟。综上所述，本研究结果首次证明了 dLGN 中继细胞中固有可塑性的可诱导性，进一步揭示了丘脑神经元在活动依赖性视觉可塑性中的重要作用。

引言

本文方法的总体目标是提供一种简单的方法，以诱导大鼠视觉丘脑神经元神经元兴奋性的持久可塑性 体外，采用膜片钳技术中的标准电流钳模式1,2该技术的开发原理在于其简单性和可重复性。与替代技术（如突触输入刺激，无论是否与特定时序的突触后动作电位配对）相比，其优势在于更高的可靠性。

传统上认为，视觉系统的可塑性仅在皮层水平表达，而背侧外侧膝状体核（dLGN）作为视网膜输入在丘脑水平的主要接收结构，通常被认为仅仅是视觉信息的中继站3。然而，这一最初的结论已受到近期研究的挑战，表明这种简化的观点不再成立4,5,6。例如，在弱视患者中，视觉反应的功能缺陷在LGN阶段就已可观察到7。此外，给定单眼区域中大部分dLGN中继神经元接收来自双眼的输入，表明大部分dLGN神经元可能具有双眼性8,9,10。而且，单眼剥夺会导致dLGN神经元眼优势的显著偏移5,11,12。

在可能导致眼优势偏移的功能可塑性机制中，神经元固有兴奋性的可塑性是一个潜在候选机制。事实上，包括视觉区域在内的许多脑区在执行各种行为任务后均表现出固有可塑性。13,14长期固有可塑性已在刺激传入性谷氨酸输入后于中枢神经元中被报道15,16,17,18，放电活动19,20，感觉刺激21 或在活动或感觉剥夺之后20,22,23在此，我们描述了一种可在dLGN中继神经元中诱导内在兴奋性长时程增强（LTP-IE）的实验方案，该增强由40 Hz频率的放电活动所触发。40 Hz的放电频率对应于大多数dLGN神经元中观察到的放电频率。 在体 视觉刺激下24,25.

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方案

所有实验均按照欧洲和机构指南（欧洲理事会指令 86/609/EEC 和法国国家研究委员会指南）进行，并经当地卫生主管部门（兽医服务部门，罗讷河口省省长办公室，马赛）批准。

1. 动物

  1. 使用19至25日龄的Long Evans大鼠（两性均可，体重在50-90 g之间）进行实验。
  2. 将动物与其母鼠及同窝仔鼠一同饲养于常规塑料笼中，保持恒定温度，并维持12小时光照/12小时黑暗的循环光照条件。 随意摄取 饮水和食物的获取。

2. 大鼠dLGN的急性切片

  1. 准备切片/恢复液和细胞外记录溶液。
    1. 配制切片/恢复液：混合 92 mM n-甲基-D-谷氨酰胺、30 mM NaHCO3、25 mM D-葡萄糖、10 mM MgCl2、2.5 mM KCl、0.5 mM CaCl2、1.2 mM NaH2PO4、20 mM Hepes、5 mM 抗坏血酸钠和 3 mM 丙酮酸钠，并用 95% O2-5% CO2 气体饱和（pH 7.4）。切片过程中保持该溶液低温。
    2. 配制记录液（人工脑脊液，ACSF）：混合 125 mM NaCl、26 mM NaHCO3、2 mM CaCl2、2.5 mM KCl、2 mM MgCl2、0.8 mM NaH2PO4 和 10 mM D-葡萄糖，并持续用 95% O2-5% CO2 气体平衡。
  2. 准备解剖工具和两个冰平台（图 1A）。
  3. 在外层容器中放入冰块，并将振动切片机的切片室中充满冰冷的切片液（图 1B）。
  4. 使用异氟烷（5%）对年轻的 Long Evans 大鼠（年龄：P19-P25）进行深度麻醉。通过用力夹捏足部无反应确认动物已深度麻醉后，在延髓水平使用剪刀或断头器（根据动物年龄/体型选择）实施安乐死。将头部置于第一个冰平台上，并每隔 10 秒用充氧的冰冷切片液润湿分离的组织。
    注意：麻醉和安乐死操作必须在动物设施的独立房间内进行。
  5. 沿尾侧方向切开头皮，使用小剪刀在颅骨两侧剪开。用钝头镊子打开颅骨，迅速用解剖刀将脑组织从颅腔中取出，并放置于第二个冰平台上。
    注意：从断头到脑组织取出的时间不应超过 2 分钟。
  6. 在脑的冠状面上进行两次贯穿全脑的切割；第一次切除大脑皮层前部和嗅球（见 图 1C），第二次在下丘水平切除大脑皮层后部和小脑。
  7. 将脑块腹侧朝上粘附于振动切片机的载板上（见 图 1D、E）。在整个操作过程中，每隔 10 秒定期用溶液润湿脑组织，直至其浸入振动切片机的切片室中。
  8. 使用振动切片机切出厚度为 350 µm、包含背外侧膝状体（dLGN）的脑片（图 1G）。用铅笔轻轻牵拉皮层和海马组织，将其从中脑上移除。
  9. 使用连接柔软橡胶吸头的断裂巴斯德移液管吸取脑片（图 1H）。
  10. 将脑片在恢复液中恢复 20–30 分钟（图 1I）。

3. 全细胞膜片钳电生理学

注意：对 dLGN 中继神经元进行全细胞膜片钳记录时，应使用特定的膜片钳放大器。

  1. 启动装置的泵，使细胞外记录液（成分见步骤2.1）在记录室中循环。
  2. 通过混合120 mM K-葡萄糖酸盐、20 mM KCl、10 mM Hepes、0.5 mM EGTA、2 mM MgCl2、2 mM Na2ATP 和 0.3 mM NaGTP（pH 7.4）来配制细胞内溶液。
    注意：细胞内溶液可预先配制，并在-80°C下冷冻保存。解冻后，溶液应置于4°C保存。
  3. 向细胞外灌流液中加入GABAA通道阻断剂毕可毒素（终浓度100 µM）和离子型谷氨酸受体拮抗剂犬尿烯酸（终浓度2 mM）。
  4. 将脑片转移至安装在直立显微镜上的浸没式记录室。记录室温度控制在30°C，并持续用预平衡的aCSF灌流。
  5. 将U形铂丝置于脑片上，并调整脑片位置以观察背外侧膝状体（dLGN）（图2A）。
  6. 使用拉制仪将硼硅酸盐玻璃管拉制成膜片钳电极。确保当电极内充满细胞内溶液时，其电阻为5–10 MΩ。
  7. 在高倍镜下（40x或60x）观察dLGN，并利用微分干涉差红外视频显微镜选择一个形态健康的神经元进行膜片钳记录（图2B）。所选神经元应外观健康（即轻微肿胀且细胞膜轮廓清晰）。
  8. 使用显微操作器将膜片钳电极置于选定的神经元上，并保持持续正压。
    1. 将放大器设置为VC模式，施加5 mV电压阶跃，将电压钳制在-65 mV。随后释放正压，以形成高阻封接（表现为对电压阶跃的电流响应显著减小）。轻微抽吸电极内液以获得清晰的瞬变电流信号。
    2. 将放大器切换至CC模式，平衡桥式电路以补偿接入电阻，并将神经元钳制在-65 mV。

4. 数据采集

  1. 以 20 KHz 采样频率获取信号，以更准确地检测快速的动作电位。将电压和电流信号的低通滤波器设置为 10 kHz。
  2. 通过注入一个正向电流脉冲（通常为 ~80–250 pA，持续 500 ms），在约 10 分钟的对照期监测神经元兴奋性，该电流应足以在对照条件下以 0.1 Hz 的频率引发 3–5 个动作电位。
  3. 在整个实验过程中，使用短暂的负向电流脉冲（通常为 -20 pA，持续 100 ms）监测神经元的输入电阻。在诱导 LTP-IE 前后，保持电流脉冲幅度恒定。

5. LTP-IE 的诱导

  1. 对照期结束后，通过施加去极化电流短脉冲（2-5 ms）以 40 Hz 频率持续 10 分钟，诱发 15 次动作电位组成的串刺激，从而诱导 LTP-IE。
  2. 选择适当的电流脉冲幅度，以确保每次刺激均引发单个动作电位（即每串 15 个动作电位）。
    注意：每串 15 个动作电位以 0.1 Hz 的频率诱发（即共 60 串，总计 900 个动作电位）。

6. 数据分析

注意：在诱导LTP-IE之前（对照条件）和之后，分析程序相同。

  1. 针对每条记录的轨迹，根据测试电流步阶前注入的小幅负向电流脉冲所引起的电压反应计算输入电阻（Rin）（Rin = Vstep/Istep）。若在对照期间输入电阻出现上升或下降（超过10%），则舍弃该次实验。
  2. 根据未施加任何电流刺激前的膜电位选择记录的轨迹。仅保留静息膜电位在 -67 至 -63 mV 范围内的轨迹。
  3. 通过测量每个电流脉冲诱发的动作电位（AP）数量，并使用数据分析软件中的自编程序对每分钟数据取平均值，来量化诱导后20分钟开始的10分钟内的LTP-IE（参见 补充文件1 中的Igor Pro程序）。当电压信号超过0 mV时判定为锋电位。
    注意：LTP-IE以诱导后电流脉冲刺激诱发的动作电位数量相对于诱导前的百分比（%）表示。分析时段分别为基线期的 -10 至 0 分钟和测试期的 +20 至 +30 分钟。

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结果

dLGN神经元采用全细胞记录模式，LTP-IE通过在离子型谷氨酸受体和GABA受体拮抗剂存在条件下，以40 Hz频率诱发动作电位持续10分钟来诱导图3A在诱导后20-30分钟，动作电位数量增加了三倍图3B）且输入电阻 R 未发生改变在 (图3C）。该方案可稳定地在dLGN神经元中诱导LTP-IE（图3D)26这些结果表明，本文所述方案可有效诱导dLGN神经元神经元兴奋性的持久可塑性。 体外.

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讨论

本文报道了通过刺激记录到的神经元，使其以40 Hz的频率发放动作电位持续10分钟，从而在急性脑切片中存活的dLGN神经元内诱导长时程突触后兴奋性增强（LTP-IE）的方法 。该方案在任何神经生理学实验室中均易于实施，仅需最少的设备（切片机、显微镜、1台放大器、1块数据采集板和计算机）。然而，为获得有价值的数据，必须严格遵守若干关键步骤。方案中的第一个关键步骤是脑组织的质量。健康的丘脑切片从表面至切片中部（约150 µm）应含有大量神经元。健康神经元略显肿胀，而正在死亡的神经元通常皱缩。第二个关键步骤是基线记录期间的稳定性。动作电位的数量应保持稳定，无增强（run-up）或减弱（run-down）现象。此外，使用短暂的超极化电流脉冲检测的输入电阻变化不应超过10%。最后，钳制电流必须稳定在±10 pA范围内。该诱导方案最初用于在视觉皮层神经元中诱导LTP-IE19,20。本文表明，该方案同样可在视觉系统的丘脑中继神经元中诱导固有性增强26。通过直接电流注入诱导动作电...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

由法国国家健康与医学研究院（INSERM）、法国国家科学研究中心（CNRS，资助DD）、艾克斯-马赛大学（AMU，资助MR）、法国医学研究基金会（FRM，项目号DVS20131228768和DEQ20180839583，资助DD）以及NeuroSchool资助"法国2030" 通过艾克斯-马赛大学卓越计划（A*Midex，AMX-19-IET-004）和法国国家研究局资助（ANR-17-EURE-0029）项目 至 AW），以及 ANR（LoGiK，ANR-17-CE16-0022 至 DD；Plastinex，ANR-21-CE16-013 至 DD）。我们感谢 A Venture &感谢 K Milton 提供出色的动物护理。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
自动化振动刀片切片机LeicaVT-1200Svibratome/slicer
硼硅酸盐玻璃管PhymepB-15086-10
控制器 Typ VLuigs&NeumannTyp V温度控制器
Igor 软件wavemetrics分析软件
红外视频显微镜OlympusXM-10 相机
犬尿酸盐Merk/SigmaK3375AMPA/NMDA 受体阻断剂
低噪声数据采集系统Axon - Molecular devicesDigidata 1440A模拟/数字接口
微操纵器Luigs&NeumannLN Mini25
Multiclamp 200BAxon - Molecular devicesN/A膜片钳放大器
Multiclamp 700BAxon - Molecular devicesN/A膜片钳放大器
PC-100 拉制仪NarishigePC-100微电极拉制仪
PClamp10Axon - Molecular devicesN/A膜片钳记录软件
荷包牡丹碱AbCamab120315GABAA 受体阻断剂
切片迷你室 Luigs&NeumannLN Chambre Slice mini I-II浸没式记录室
直立显微镜OlympusBX51 WI

参考文献

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