本文所述的 AcroSensE 小鼠模型和活细胞成像方法为研究精子顶体这一亚细胞区室中的钙离子动态及其对膜融合和顶体外排等中间步骤的调控机制提供了新途径。
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本文内容
摘要
摘要
顶体外排（AE）是指精子的单一外排囊泡与质膜融合的过程，这是一种复杂的、依赖钙离子的生理事件，对受精至关重要。然而，目前我们对钙信号如何调控顶体外排的理解仍不完整，特别是顶体内钙离子动态变化与介导顶体外排的中间步骤之间的相互关系尚不明确。本文介绍一种能够提供顶体钙动态在空间和时间上精确信息，并揭示其与膜融合及随后顶体囊泡外排之间关系的方法。该方法利用一种新型的转基因小鼠模型，其表达一种靶向顶体的外排传感器（AcroSensE）。该传感器由基因编码的钙离子指示剂（GCaMP）与mCherry融合而成，这种融合蛋白被专门设计用于同时观测顶体内的钙动态变化和膜融合事件。通过高帧率成像结合可针对单个精子施加刺激物的递送系统，可实现在活体AcroSensE精子中对顶体钙动态和AE过程的实时监测。本实验方案还提供了若干基础方法示例，用于量化和分析原始数据。由于AcroSensE模型为基因编码，因此可通过现有的遗传学工具进一步拓展其科学应用价值，例如与其他小鼠遗传模型杂交或采用基因编辑（CRISPR）技术。通过这一策略，可进一步解析其他信号通路在精子获能及受精过程中的作用。总之，本文所述方法为研究特定亚细胞区室——精子顶体中的钙动态变化，以及这些动态如何调控膜融合及顶体外排的中间步骤，提供了一种便捷且有效的研究工具。
引言
精子在称为获能的过程中获得受精能力1。该过程的一个终点是精子具备发生顶体反应（AE）的能力。二十多年的研究数据支持哺乳动物精子中存在一个复杂且多步骤的顶体反应模型（总结见文献2,3）。然而，在活精子中研究顶体反应具有挑战性，目前可用于以足够分辨率监测该过程的方法较为繁琐，且需要多个制备步骤4，或仅限于检测顶体反应的最后一步（例如使用花生凝集素PNA5），或仅限于检测胞质钙的变化（而非顶体内的钙动力学），或仅能分别测量胞质钙动力学或顶体反应6。
为了克服在生理条件下进行实时顶体反应（AE）研究的一些关键局限性，并实现对钙离子动态变化与顶体反应之间相互作用的探究，研究人员构建了一种独特的小鼠模型。在此小鼠模型中，利用顶体素（acrosin）启动子和信号肽，使一种由基因编码的Ca2+传感器（GCaMP3）与mCherry融合而成的融合蛋白特异性地表达并靶向定位至顶体2。这种靶向定位的双GCaMP3-mCherry传感器，结合显微成像技术和单细胞刺激递送系统，能够在生理条件下对活精子中的钙离子浓度及顶体内容物状态进行同步实时检测（图1）。由于mCherry是顶体基质的组成部分，当发生膜融合及顶体反应时，该蛋白会从顶体囊泡中扩散出去，导致其光稳定且不受pH影响的荧光信号在精子中丢失。因此，该模型反映顶体反应发生时间与过程的能力，与此前报道的顶体靶向GFP小鼠品系所具有的优势相似7,8,9。
该转基因小鼠品系中使用的 GCaMP3 变体的解离常数（KD）约为 400 µM，对 Ca²⁺ 具有相应的动态响应范围2+ 10分之1-4-10-3 M10，这适用于该囊泡。我们证明了GCaMP3的这些特征组合能够揭示质膜与顶体外膜（OAM）之间融合孔的形成2融合孔的检测是由于孔径过小，导致AcroSensE蛋白无法从顶体中扩散出来所致通过 顶体内容物丢失）的同时提供一层膜 "通道" 使Ca²⁺内流2+ 离子进入顶体腔，导致GCaMP3的荧光强度增加。
明亮的单体非钙敏感荧光蛋白 mCherry 可用于顶体的可视化，而 GCaMP3 信号较弱（例如，在结合 Ca2+ 之前，图 2）；更重要的是，mCherry 还可用于识别适合成像的顶体完整精子细胞。
以下方案描述了独特的AcroSensE小鼠模型的应用，以及用于实验性研究顶体反应和精子钙动力学的显微镜方法，具有高空间和时间分辨率。
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方案
所有动物实验均在康奈尔大学机构动物护理和使用委员会（#2002-0095）的指导方针下并经其批准进行。本研究使用了8-10周龄的AcroSensE小鼠2。有关AcroSensE小鼠可获取性的信息请求可提交给通讯作者。
1. 精子采集与洗涤
- 收集附睾尾部精子（该操作的更多细节如下所述）11) 来自 AcroSensE 小鼠。在含有 0.5 mL 改良 Whitten 培养基（MW）的 3.5 cm 组织培养皿中，于 37 ℃ 进行 15 分钟的游出程序 °C. 培养皿应加盖以减少微波处理水（MW）的蒸发，并应倾斜放置，使液面足够深以浸没附睾尾。
注意：改良 Whitten 培养基（MW）包含 22 mM HEPES、1.2 mM MgCl₂、4.8 mM KCl、116 mM NaCl、5.6 mM D-葡萄糖、1.2 mM KH₂PO₄、5 mM NaHCO₃、1.7 mM CaCl₂ 和 3 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA），pH 值调至 7.4。2，100 mM NaCl，4.7 mM KCl，1 mM 丙酮酸，4.8 mM 乳酸半钙2+ 盐，pH 7.35。葡萄糖（5.5 mM），NaHCO₃3 （10 mM）和2-羟丙基-β-环糊精（CD；3 mM）被添加（参见 材料表根据诱导获能的需要添加，并可根据特定实验调整浓度。此外，可使用其他胆固醇受体替代环糊精（例如牛血清白蛋白或高密度脂蛋白）。 - 使用精细镊子从游出液收集皿中去除所有附睾组织。将含有精子的培养基转移至15 mL锥形管中，以100 x g离心悬液 g 在室温下，以摆动桶转子离心1分钟。使用塑料移液管去除上清液中的精子，避免吸取在此步骤中已沉淀的粗组织碎片。
- 通过加入37℃的MW，将含有精子的MW上清液调整至终体积为3 mL。 °C. 以 400 x g 在圆底管中室温孵育8分钟。缓慢移除松散沉淀精子上方的MW上清液。
- 如果具有活性，精子应呈现为 "绒毛状"-观察沉淀。轻柔地重悬精子 通过 使用大孔径移液管吹打混匀 通过 轻轻手动敲击管壁（"手指轻弹"。待充分均匀重悬后，转移至新的圆底试管中。使用10-20 µ取 L 精子悬液用于计数和活力评估。用 MW 稀释精子后使用。
注意：在涉及小鼠精子获能的大多数实验中，通常使用每毫升修饰的温育液（MW）含500万至1000万精子的终浓度。此处所述的成像方案不需要对精子进行获能处理，尽管精子需经获能才能具备发生生理相关性顶体外排的能力。研究者可在未获能的精子中研究由钙离子载体等试剂诱导的病理性外排或外排反应。此外，也可探究未获能精子在不同刺激下顶体内钙离子的潜在变化。 - 在采集后3-5小时内使用精子，尽量缩短时间，并在各实验组间保持一致。
- 在37℃下进行所有收集和洗涤步骤 °使用MW培养基，并采用尽量减少膜损伤的方法，包括使用宽口塑料移液管或大孔径移液器吸头，建议在实验全过程的各个阶段均使用此类工具。
2. 用于成像的盖玻片培养皿的多聚-D-赖氨酸包被
注意：聚-D-赖氨酸（PDL）培养皿应在每次实验前新鲜制备。
- 在盖玻片培养皿中央加入 0.5 μL 的 PDL 溶液（0.5 mg/mL，参见材料表）。
- 使用 10 μL 带刻度的移液枪头，将 PDL 液滴均匀涂布于盖玻片表面（采用如图 1B所示的交叉涂布法）。
- 在 37 ˚C 下干燥 10 分钟。PDL 包被的培养皿需保持加盖状态，并存放于 37 ˚C 环境中，直至使用。
3. 毛细管拉制与加样以用于喷吹
- 拉制硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 2 mm，内径 1.56 mm，参见 材料表）设置参数如下：加热（Heat）：330，拉力（Pull）：250，速度（Velocity）：250，时间（Time）：70。此步骤应根据所使用的具体拉制仪进行优化。
- 每次实验前，取一根毛细管，加入含有刺激剂的刺激溶液，其浓度为终浓度的3-5倍（以补偿吹入时溶液的快速扩散）。在灌注前，用精细镊子将毛细管尖端在距顶端约1-2 mm处折断 从末端开始。这应产生一个 ∼5 µm 开口直径。无需热抛光。
- 使用细塑料移液管，缓慢将刺激溶液注入毛细管中，直至其长度的四分之三充满为止。
- 通过轻轻弹击毛细管，去除填充过程中形成的任何气泡。
- 将装满液体的毛细管安装到显微操作器上（参见 材料表).
4. 刺激喷射递送的准备工作
注意：为尽量降低用户受伤风险，进行喷射操作时应佩戴护目镜。
- 设置单细胞递送系统的参数，以提供持续10秒、压力为5 psi的脉冲。
- 将硼硅酸盐毛细管连接至单细胞递送系统的移液器固定装置，确保密封紧密。
- 在观察毛细管尖端的同时，施加一个持续2秒、压力为20 psi的短暂气流，以确认溶液确实从尖端末端释放（尖端末端应明显出现小液滴）。
5. 显微镜观察与图像采集
注意：有多种品牌的显微镜可供选择并使用；但建议最低帧速率达到每秒3帧。关于温度和环境控制，请注意应确认培养皿中培养基的实际温度，例如使用非接触式红外测温仪进行测量。
- 加入80 μ将稀释后的精子悬液取适量加至经多聚-L-赖氨酸包被的35 mm盖玻片培养皿中央。对于大多数涉及小鼠精子获能的实验，终浓度通常为500万至1000万精子/mL。
- 缓慢向精子中加入 3 mL 温热（37 ˚C) 添加 10 mM CaCl₂ 的 MW 基础培养基2.
注意：可以在室温下进行实验以减缓细胞过程，但需要注意的是，由于获能过程依赖于脂质交换以及微区和宏区的流动性，因此必须认识到生理相关的获能和顶体外排是温度依赖性过程。 - 将载有精子的培养皿置于预热至 37 ℃ 的显微镜载物台上 ˚C）。
- 使用488 nm激光激发GCaMP3，并通过505-550 nm带通（BP）滤光片观察。使用555 nm激光激发mCherry，并通过575-615 nm带通（BP）滤光片观察。
- 使用显微操作仪（建议将操作仪安装在放置显微镜的隔振台上），将毛细管尖端定位至距离目标约100 μm 到侧面以及 5-10 μm 高于目标细胞所在平面。
注意：刺激溶液的配制浓度为正常浓度的3-5倍，以补偿毛细管与细胞之间体积中发生的快速扩散。 - 启动显微镜的成像序列。
- 以高帧率对精子细胞进行成像，优选 >每秒10帧。此处使用了共振扫描仪，可实现每帧33毫秒的成像速度。
- 显微镜图像采集开始10秒后，启动单细胞递送系统，以触发持续10秒的刺激剂脉冲。
- 对细胞成像持续 10–15 分钟。
- 使用单细胞递送系统，根据所提供的位置，从单个培养皿中对多个细胞进行成像 图1B.
注意：在显微镜下，未经处理或未受刺激的精子应主要呈现红色，绿色信号强度较低。精子头部应附着在盖玻片上，活精子可通过其摆动的尾部进行识别。在发生顶体外排（AE）的精子中，GCaMP3绿色信号会先增强，若AE完成，则mCherry红色信号和GCaMP3绿色信号均会消失，如图所示 图2mCherry荧光的减少为AE起始时间提供了更特异的指示，因为Ca2+ 浓度将持续引起GCaMP3荧光强度的变化。
6. 图像与数据分析
注意：离线图像分析使用 ImageJ 进行（参见材料表）。此前已有研究报道了导致顶体外排（AE）过程中的多个中间步骤，包括顶体钙升高（ACR）和完全膜融合。后者会导致 mCherry 荧光信号的丧失，因此代表完全的 AE。在某些细胞中，当采用安培法研究外排过程时，可观察到类似于预脉冲足部事件（PSF）的信号（更多细节请参见2）。目前有多种可选方法可用于分析 AcroSensE 原始数据，以定量 ACR、AE 及其各个中间步骤。以下介绍一些基本的分析方法。
- 根据特定显微镜系统的文件扩展名，使用分通道工具（图像 > 颜色 > 拆分通道）为 GCaMP3 和 mCherry 通道生成独立的窗口。
- 使用“同步窗口”工具（分析 > 工具 > 同步窗口）同步各个通道窗口。
- 在红色通道中围绕精子头部选择一个感兴趣区域（ROI），以包含顶体区域（图 3A、B）。同步工具可将相同的区域选择自动应用于绿色通道，此时精子在绿色通道中仍过于暗淡而不可见。
- 选择“Z Profiler”插件（插件 > 图像栈 > Z Profiler）或“Time Series Analyzer”（插件 > 图像栈 > 时间序列分析器），以绘制两个通道的荧光强度随帧数/时间变化的曲线。
- 将数据复制到电子表格软件（例如 Microsoft Excel）中进行绘图和进一步分析。
注：一旦数据被复制到电子表格中，即可提取多个参数用于分析，包括以下参数，如 图 4 所示。- 融合孔（FP）起始时间：测量从时间点 0 到 GCaMP3 信号开始上升的时间点。该参数表示刺激与精子顶体反应（ACR）响应之间的延迟。
- 顶体外排（AE）起始时间：测量从时间点 0 到 mCherry 信号开始衰减的时间点。该参数表示刺激与精子 AE 响应之间的延迟。该参数也可用于计算融合孔形成与 AE 响应之间的延迟。
- FP 峰值幅度：测量从基线到 GCaMP3 信号上升峰值的荧光信号变化。该参数表示顶体反应的总增加量。
- mCherry 丢失速率：通过对 mCherry 信号衰减部分进行线性或指数拟合来确定该参数（如 图 4B 中“斜率”所示）。
注：或者，可通过残余信号（R）法在不同时间点确定衰减速率（例如 R60：mCherry 信号从基线衰减至残余 60% 所需的时间，单位为秒）。该参数可用于量化 AE 发生后顶体内容物的扩散速率。 - mCherry 信号减少量：确定 AE 前后 mCherry 荧光强度基线与 AE 后信号之间的幅度差。该参数表示 AE 发生后顶体内容物的总释放量。
- 将红、绿两个通道的荧光变化（F）以原始数据形式绘图，或通过初始荧光强度（F0）进行归一化，并表示为 ΔF/F0。后者可在同一图表中更清晰地显示红、绿两通道的变化（例如参见 图 3D 和 图 3H）。
注：最后，可比较不同条件下的各项测量参数，以确定顶体钙浓度变化与 AE 之间的关系。有关不同实验条件比较的示例，请参见参考文献2。
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结果
图2 提供了一个简化的示意图，显示精子成功受到刺激后预期的荧光变化序列。上图面板 图2 展示了GCaMP3荧光强度的变化，其中信号初始较弱（顶体基础钙离子浓度低于GCaMP3的KD值），随后随着钙离子的进入 通过 融合孔形成后，荧光亮度增加。最后，在胞吐事件（AE）发生时，由于传感器扩散至胞外空间，信号随之丢失。下图面板显示 图2 展示了mCherry荧光强度的变化，初始信号较强，只有在顶体外排（AE）发生后，随着传感器及其他顶体基质内容物的扩散，红色信号才逐渐减弱。
图3 提供上述两个经刺激的活精子在各阶段的实际测量数据 125 µM 神经节苷脂GM1的（关于GM1如何在精子中调控AE的更多细节）12），在单个视野中捕获。 图3A
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讨论
本文介绍了一种基于显微镜的方法，用于利用新构建的AcroSensE小鼠模型，对顶体钙离子动态变化与顶体反应（AE）中间步骤之间的相互作用进行实时、单细胞水平的监测与分析。结合现有的遗传学手段，例如与其他小鼠遗传模型杂交或基因编辑技术，该模型与方法为研究参与精子获能、顶体反应及受精相关信号通路中各种组分和通路的功能提供了强大的研究体系。
关键步骤
在所有精子操作步骤中，必须使用宽口塑料移液管或大孔径移液器吸头，并在 37 ˚C 下进行收集和洗涤的每一步操作，以尽量减少膜损伤。同样，应优先选用摆桶式转子而非固定角转子，以避免精子细胞与微量离心管管壁相互作用而导致膜损伤。如果具备 Z 轴位置漂移校正功能，强烈建议使用 Z 轴位置校正硬件/软件，以防止在成像期间被观察的精子偏离焦平面。
修改与故障排除
此处所述方案已针对脂质介导的信号传导研究进行了优化2,
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披露
作者均无与本工作相关的利益冲突需要申报。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院资助 R01-HD093827 和 R03-HD090304（A.J.T）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100倍油镜 | 奥林巴斯日本 | UPlanApo | |
| 2-羟丙基-β-环糊精 | Sigma | C0926 | |
| 35 mm 盖玻片培养皿，1.5 厚度 | MatTek 公司 | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL 圆底管 | Falcon | 352054 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Sutter Instrument Co. CA 美国 | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| 共聚焦显微镜 | 奥林巴斯日本 | 奥林巴斯 FluoView | |
| 葡萄糖 | Sigma | G7528 | |
| 刻度吸头 | TipOne，USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| 乳酸 | Sigma | G5889 | |
| 活细胞显微镜培养系统 | TOKAI HIT 静冈，日本 | 模型 STX | |
| MgCl₂2 | Sigma | M8266 | |
| 微移液管拉制仪 | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO₃3 | Sigma | S6297 | |
| 塑料移液管 | FisherBrand | 13-711-6M | |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma | P7280 | |
| 丙酮酸 | Sigma | 107360 | |
| 单细胞递送系统 | Parker，美国纽约州霍普奇 | Picospritzer III |
参考文献
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