骨质疏松模型大鼠岭南火针疗法操作步骤及注意事项

摘要

本文介绍了一种应用于骨质疏松模型大鼠干预的岭南火针疗法操作方案。

摘要

与毫针疗法相比，火针疗法兼具针刺刺激和热温效应，对某些慢性病及疑难病症具有意想不到的效果。骨质疏松症（OP）在绝经后女性及中老年男性中发病率较高，且治疗周期较长。根据中医理论，岭南火针疗法在治疗骨质疏松方面展现出潜在疗效。然而，其广泛应用仍需进一步研究。本文重点探讨岭南火针疗法在大鼠骨质疏松干预中的应用，涵盖针具选择、穴位选取、大鼠体位定位及固定方法，并详细说明火针操作过程中的步骤及注意事项。实验共设三组：正常组、模型组和火针组，每组10只大鼠。火针组大鼠接受共六次的火针干预。干预结束后，采集股骨标本并进行显微CT扫描。结果表明，火针治疗可改善骨质疏松大鼠的骨形态结构并提高骨矿物质密度。本研究可为火针疗法的基础研究提供方法学依据。

引言

中医认为，气候和环境等因素会影响人的体质，进而影响疾病的发生与发展。中国岭南地区主要包括广东、广西和海南岛，地处热带季风气候区，长期在此地区生活的人群容易出现脾虚证候。在某些情况下，病情会累及肾与肝，导致骨质疏松症的高发¹。脾与胃主运化水谷精微，是气血生化的源泉，而肝有助于充养骨髓。因此，骨骼的营养依赖于脾、胃和肝的供给。中医认为，肾主生髓、强骨，其功能状态直接影响骨骼的强度与功能，故肾虚与骨质疏松密切相关。根据中医理论，肝（Gan）肾（Shen）亏虚、精（Jing）不足是其根本病因。在某些情况下，由于脾（Pi）胃（Wei）虚弱或功能失调，可能导致营养失衡。也就是说，肝（Gan）、肾（Shen）、脾（Pi）、胃（Wei）的亏虚是内在根本原因，而外邪（Xie qi）阻滞经络、损伤筋骨则是外在表现。根据世界卫生组织（WHO）的定义，骨质疏松症（OP）是一种以骨量减少和骨组织微结构退化为特征的医学状况²，是老年人群中的重要健康问题。选择适当的干预措施对于骨质疏松症的预防与治疗至关重要。

现代针灸医师结合岭南地区的气候特点及当地人群的体质特征，发展出具有独特岭南特色的火针疗法³。火针疗法是一种将特制针具烧至通红后，迅速刺入人体特定部位或穴位以治疗多种疾病的治疗方法。该疗法广泛应用于皮肤病、肌肉骨骼与关节疾病、神经系统疾病及其他系统性疾病，且疗效良好⁴。火针治疗骨质疏松症在临床上已有长期应用，其疗效优于单纯针刺或口服中药治疗^5,6,7。岭南火针疗法融合了针刺、三棱针和化脓性艾灸技术，既能温补肾阳，又能改善经络中的气血运行。该疗法可同时针对血瘀和肾（肾）虚进行干预，而这两种病理因素正是中医理论中骨质疏松症（OP）发病机制的重要组成部分。此外，该疗法还具有成本低、起效快、疗程短、安全性高等优点。然而，目前对其作用机制的研究仍显不足。本文介绍了一种在骨质疏松模型大鼠中应用岭南火针疗法的具体操作流程，为开展相关基础研究提供了方法学依据。

方案

所有实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并经湖北中医药大学实验动物管理和使用委员会批准。实验采用成年雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重为220 ± 20 g。所有大鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗循环、温度23 ± 1 °C、湿度40%-50%的环境中，可自由摄食和饮水。

1. 术前准备

1. 组设计
   1. 在对30只3月龄雌性大鼠进行基因分型后，随机将其分为三组（每组n = 10）：正常组、模型组和火针组。对火针组大鼠进行火针干预，每日1次，共6次，每次间隔1天休息。
      注意：正常组和模型组大鼠用固定外套束缚，其频率和持续时间与火针组相同，但不进行火针处理。
2. 大鼠骨质疏松模型的制备
   1. 对模型组和火针组的大鼠，按照所述方法通过手术切除卵巢以建立骨质疏松模型^8,9,10.
      1. 进行卵巢切除术时，术前通过腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）实施麻醉，当动物对脚趾夹捏试验无反应时，视为已达到外科麻醉平面，麻醉成功。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。术前皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）作为镇痛剂。手术过程中保持无菌操作条件。
         注意：若手术尚未完成而大鼠出现复苏迹象，可临时适量补充腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液，每次补充剂量不得超过总注射量的20%。
      2. 术后将大鼠置于小型动物加热垫上，温度设置为32 °C。在大鼠恢复意识并能自由爬行之前，不得使其无人看管。在大鼠完全恢复之前，不得将其放回与其他动物同笼饲养。
      3. 大鼠苏醒后，检查缝线是否完整，然后将大鼠放回笼中。所有大鼠均需肌肉注射青霉素钠（50,000 U/天，连续3天），并腹腔注射0.1 mL 0.05%双氯芬酸钠溶液（每天1次，连续3天），以预防感染并促进愈合^9,10.
   2. 根据雌性大鼠阴道脱落细胞涂片观察动情周期，方法如下所述¹¹若周期出现紊乱，则模型建立成功¹¹.
      注意：大鼠在卵巢切除术后大约需要8-12周时间才会出现骨质疏松症。
3. 针具的选择
   1. 从医疗器械制造商处购买火针。确保针具由钨锰合金制成，该材料耐高温、质地坚硬、不易变形且受热均匀。火针形状类似毫针，应选择针体较粗、针尖锐利且挺直、针柄缠绕铜丝的产品，铜丝具有隔热作用，可防止烫手。
   2. 选用直径为0.40 mm、长度为13 mm的单头火针，因为大鼠体型较小。检查火针是否有倒刺或裂纹。
      注意：在临床实践中，大多数火针均采用由国医大师贺普仁研发的火针¹²基于此，林国华创制了岭南长柄火针和岭南三头火针¹³根据实验需求选择不同规格的火针。
4. 穴位的选择与定位
   1. 根据相关数据和文献，选取用于治疗绝经后骨质疏松症的穴位。
      注意：最常使用的穴位按使用频率排序依次为肾俞（BL 23）、足三里（ST 36）、脾俞（BL 20）、悬钟（GB 39）和大杼（BL 11）。^14,15在去卵巢模型大鼠针灸干预骨质疏松的基础研究中，最常用的穴位为肾俞（BL 23）、三阴交（SP 6）、关元（CV 4）和足三里（ST 36）。^16,17,18.
   2. 确定本实验所选用的穴位。参考既往研究中所选用的针灸穴位^{14,15,16,17,18} 并针对骨质疏松症的发病机制，选取本研究的四个穴位，即肾俞（BL 23）、脾俞（BL 20）、足三里（ST 36）和三阴交（SP 6）。这些穴位分别归属于膀胱经、督脉、脾经和肾经。
      注意：严禁在具有较大血管和神经干的部位使用火针。
   3. 使用宠物电推剪在定位前剃除针灸部位的毛发，以暴露针灸穴位。
   4. 常用穴位的名称及其位置¹⁹定位穴位方法如下：肾俞（BL 23）位于第二腰椎下两侧，距背正中线6 mm处；脾俞（BL 20）位于第12胸椎下两侧肋骨之间^th 胸椎，距背正中线6 mm处；足三里（ST 36）位于膝关节后外侧，腓骨小头下方约3 mm处；三阴交（SP 6）位于后肢内踝尖垂直向上约10 mm处。
   5. 用油性记号笔在确定位置后标记这些点。
5. 大鼠固定方法
   注意：为了减少大鼠在固定和处理过程中的应激反应，应使用牢固的束缚外套将大鼠悬吊固定^20,21 选择使用大鼠外套管固定法。该固定方法具有以下优点：首先，它充分利用了大鼠偏好黑暗环境的习性，减少了固定过程中大鼠的应激反应；其次，由于四肢和脚趾无受力点，悬吊状态下的大鼠在整个火针治疗过程中更为安静且配合度更高；第三，大鼠背部和四肢的穴位得以充分暴露，便于操作。每次治疗需固定大鼠5–10分钟。当大鼠安全置于外套管中时，不会挣扎，状态平静。
   1. 准备大鼠外套。将清洗干净的织物缝制成一个50 cm × 13 cm的管状大鼠外套。在大鼠外套的四肢和背部位置分别剪出孔洞，并在四个角缝上系带。
   2. 戴上手套，将大鼠置于不易打滑的桌面上，用左手抓住大鼠尾巴并轻轻向后拉。用右手打开大鼠实验服的开口。利用大鼠喜暗和钻洞的习性，将其置于实验服开口处，大鼠会自行钻入其中。
   3. 当大鼠钻入鼠衣中部时，用左手握住大鼠两侧肩胛骨，右手拉出大鼠的两只前肢。
   4. 收紧外套前部的绳子，将绳子交叉后缠绕至大鼠背部。调整绳子的松紧度，并在大鼠背部打结固定。最后以类似方式固定大鼠尾部末端，使其双侧后肢位于大鼠外套外部。
   5. 对于摆动式悬挂，取两个S形钩，将它们钩住大鼠外套背部的结，再将钩子挂在铁架上。此时，大鼠通过布条悬挂，处于轻微摆动状态（图1).
      注意：布条距离地面的高度约为70 cm，以便实验者坐在凳子上时能够舒适、省力地进行操作。若大鼠可能发生滑落，应在大鼠下方的平面上放置厚垫料作为预防措施。

2. 针灸治疗

1. 消毒
   1. 针刺前用5%碘伏消毒液对局部区域消毒3次。每次碘伏擦拭后，再用酒精棉球擦拭。
2. 烧针
   注意：应采取安全措施，防止烧伤和损伤。
   1. 用止血钳夹取棉球，左手持浸有95%酒精的棉球，用打火机点燃。
   2. 右手拇指、食指和中指以微屈姿势持针柄，如同执笔。
   3. 将针尖和针体置于酒精棉球上加热；先加热针体，再加热针尖。根据治疗目的，将针烧至通体亮白或发红（图2）。
      注意：针体必须完全烧至亮白或发红，否则会影响针灸疗效，甚至导致术后感染等问题。
3. 针刺
   注意：根据进针速度、深度、范围、留针时间及治疗目的的不同，岭南火针可分为点刺、散刺、密刺、快刺和慢刺等多种操作技术²²。使用岭南火针操作的关键在于“红、准、快”。
   1. 待针烧至通红后，将针移离火焰，悬于穴位上方。
   2. 针尖垂直对准穴位，迅速刺入并拔出。确保整个过程在1秒内完成。
   3. 针刺深度约为1–2 mm，仅刺入烧红的针尖部分。
      注意：针刺深度应根据病情、体质、年龄、穴位处肌肉厚度、血管深度及神经分布情况而定。
   4. 每个穴位刺3–5次。所有穴位均重复此操作（图3）。
      注意：操作时应全神贯注、动作敏捷。在同一实验大鼠的操作过程中，应使用同一根火针，每次两点之间需重新烧灼灭菌；针具不得放置于台面或失去无菌状态。

3. 针灸后管理

1. 将火针从皮肤上提起，用无菌干棉球按压针孔以防止出血。火针治疗后，大鼠活动能力未受影响，且未出现可检测到的并发症。
   注意：若火针后出现出血，无需刻意止血，待其自然停止后用干棉球擦拭即可。

4. 数据收集与分析

1. 经过6个疗程的火针干预后，通过腹腔注射高剂量戊巴比妥钠（150–200 mg/kg）处死大鼠。取股骨标本并进行显微CT扫描²³。
2. 使用分析软件对数据进行统计学分析。测量结果以均值表示，并采用单因素方差分析（one-way ANOVA），以 p <0.05 为差异具有统计学意义。

结果

数据在 表1 结果显示，与正常组相比，模型组的骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）以及骨小梁静态参数骨体积分数（BV/TV）均显著降低（p < 0.05） <0.05），且骨小梁分离度（Tb.Sp）升高（p <0.05）；表明去卵巢术后大鼠股骨远端干骺端富含小梁骨区域的小梁骨结构受到显著破坏，存在明显损伤。

与模型组相比，火针组大鼠股骨的骨小梁厚度、骨小梁数量及骨小梁静态参数骨体积分数均显著增加（p <0.05），骨小梁分离度降低（p <0.05）。这表明火针治疗可改善去骨所致骨质疏松模型大鼠股骨松质骨结构的损伤。

图4展示了各组大鼠骨松质基质的三维结构图像。图4A为正常组，图4B为模型组，图4C为火针组。由图可见，与正常组相比，模型组股骨松质骨中心甚至周边区域大量骨小梁丢失，下部出现大量空腔，骨结构的整体连续性受到破坏，并可见部分游离的骨小梁。与模型组相比，火针组股骨松质骨中心及周边区域的骨小梁明显增厚，整体骨结构的连续性得到改善。这表明火针可保护去卵巢诱导的骨质疏松大鼠模型中股骨松质骨的骨小梁结构。

图 1：大鼠固定方法：用外套束缚后悬挂大鼠。 将大鼠穿上专用外套后，通过两个S形钩钩住外套，将大鼠固定并悬吊在空中。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：岭南火针。（A）针具。选用规格为 0.40 mm × 13 mm 的细火针。（B）烧针。将针尖和针体置于浸有酒精的棉球上并加热。请点击此处查看该图的放大版本。

图3火针针刺四穴位操作步骤 (A) 脾俞（BL 20）：位于第12肋骨下方两侧肋骨之间^th 胸椎，距背正中线6 mm处（B肾俞（BL 23）：位于第二腰椎下方两侧，距背正中线6 mm处C足三里（ST 36）：位于膝关节外侧后方，腓骨小头下方约 3 mm 处。D三阴交（SP 6）：位于后肢内踝尖正上方约10 mm处。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图4：各组大鼠股骨远端松质骨三维结构的比较。 （A）正常组。（B）模型组。（C）火针组。比例尺：500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

组别	骨小梁数量 (Tb.N, mm)	骨小梁间距 (Tb.Sp, mm)	骨小梁厚度 (Tb.Th, mm)	骨体积分数 (BV/TV)
正常组	3.29±0.47	0.23±0.06	0.12±0.03	0.39±0.14
模型组	0.96±0.78*	0.66±0.44*	0.09±0.01*	0.17±0.11*
火针组	2.73±0.76Δ	0.33±0.20Δ	0.12±0.02Δ	0.33±0.16Δ

表1： 火针疗法对股骨骨质疏松微结构指标的影响。数据以均值±标准差表示，n=10。与正常组比较，*p<0.05；与模型组比较，Δp<0.05。

讨论

岭南火针疗法具有深厚的历史背景。关于火针及其针刺方法的记载可追溯至《黄帝内经》。现代针灸学家司徒铃和张皆炜结合岭南地区的气候特点及当地人群的体质特征，创立了岭南火针疗法³。林国华将岭南火针疗法的治疗作用概括为温、通、补、清、消，其中以“温”为根本²⁴。

使用火针的第一步是选择合适的针具类型。火针主要可分为三类：单头针、多头针和平头针。单头火针在临床实践中应用广泛，常用于治疗多种系统的疾病。多头火针由三根细针或三根中粗针呈三角形组合而成，主要用于治疗皮肤病。平头火针常用于去除皮肤上的各种痣、疣及其他增生性病变^25,26。本研究选用单头针，因其适用范围更广，功能更多，且更容易获得适合大鼠体型的细针。

其次，正确使用火针疗法需要对烧针温度有严格的标准。研究人员²⁷发现，将针具加热至特定温度是确保其疗效的必要条件。如果温度不足，可能无法有效缓解相应的病理变化。因此，为达到理想的治疗效果，火针疗法所用针具必须烧至通红或亮白色，随后迅速刺入选定的穴位或部位。此外，由于不同火针器械、针刺部位及所治疗疾病的差异，烧针标准亦有所不同。为此，我们整理了一套完整的火针烧针标准，可供参考（见Table 2）。在本研究中，我们采用单头火针进行多点刺激，而非多头火针，原因是多个针头距离过近时，难以保证每根针都能均匀烧灼。

针具	烧针程度	适应证
单头火针	微红至暗红色。	骨关节疾病及疼痛性疾病
多头火针	针尖微热。	痤疮等皮肤病
平头火针	亮白色，针柄微热。	丝状疣等赘生物

表2：烧针的标准。

关于火针进针的角度，通常为垂直进针。至于进针深度，目前尚无统一标准。但一般认为，肌肉丰厚、皮肤较厚的部位可适当深刺，而皮肤和肌肉较薄的部位则宜浅刺。此外，该领域许多专家认为，火针的进针深度应参考毫针针刺的深度²⁸。有研究建议，在针刺穴位时，火针深度应略浅于毫针；而在针刺痛点时，则可略深于毫针²²。因此，在火针的实际应用中，建议首先参照毫针的进针标准，再结合临床经验确定具体的进针深度。

根据192位岭南专家的共识，骨质疏松症（OP）高危人群的主要病因是肾（Shen）虚，进而导致继发性血瘀。因此，治疗OP需同时兼顾补肾（Shen）和活血化瘀²⁹。目前，针灸是治疗OP的常用方法之一。不同类型的针灸治疗包括毫针疗法、艾灸、温针灸、电针（EA）、埋线疗法、穴位注射、针灸与药物联合治疗，以及针灸联合艾灸治疗。其中，临床应用最广泛的治疗方式为埋线疗法、艾灸以及针灸与药物联合治疗³⁰。临床上，火针疗法已广泛应用于137种不同疾病的治疗，涉及运动系统、神经系统、内分泌系统、消化系统、妇产科等多个器官系统，其中应用最多的是运动系统疾病³¹。岭南火针疗法是一种结合了针刺、三棱针和化脓性艾灸优势的治疗方法，可改善经络气血运行，温补肾（Shen）。该疗法既能活血化瘀，又能补肾（Shen），针对中医理论中OP的发病机制。此外，该疗法还具有成本低、起效快、疗程短、安全性高等优点。临床试验也表明，火针疗法联合针灸治疗OP的效果优于单纯针灸或药物治疗^5,6。关节疼痛是OP的典型症状之一，已有研究证实，火针疗法在治疗关节疼痛方面的疗效显著优于毫针疗法³²。

骨强度取决于骨密度，即单位体积内的骨量。骨小梁的数量和分布是骨量的组成部分，显著影响骨体积，进而影响骨密度。骨体积分数表示单位组织体积中骨体积所占的百分比，是评估骨量的重要参考指标²³。作为骨骼系统的一部分，松质骨的主要功能是支撑和协助运动。然而，若其体积增大，可能降低骨密度，从而减弱骨强度。松质骨的结构呈海绵状，由骨小梁构成。因此，松质骨的结构由骨小梁决定。为维持松质骨的强度，关键在于确保存在足够数量的骨小梁作为支撑框架；其次，还需保持骨小梁之间相对充足的连接，以确保骨结构的稳定性³³。为使骨小梁能够承受一定负荷，必须维持其厚度。松质骨的结构通常依据骨小梁的数量、连接性及其厚度进行评估³⁴。通过比较松质骨的结构参数（表1），我们发现模型组大鼠与正常组之间存在显著差异。模型组股骨的骨小梁数量、骨小梁厚度和骨体积分数均降低，而骨小梁间距则升高。这些结果提示，模型组的松质骨结构发生改变，可能导致骨质疏松症或其他骨病。根据松质骨的三维结构图像观察，模型组股骨中部缺乏骨小梁，且周边上部超过一半的骨小梁也已缺失。这表明去卵巢术后大鼠股骨的骨结构完整性已受到破坏。与模型组相比，火针组大鼠股骨的骨小梁数量、骨小梁厚度和骨体积分数均增加，骨小梁间距减小。此外，从松质骨的三维结构图可见，火针组的中央骨髓腔缩小，周边骨小梁结构完整（图4）。本研究表明，火针疗法可有效预防和控制去卵巢大鼠股骨松质骨结构的损伤。

本研究所选用的卵巢切除模型大鼠存在以下局限性。雌激素水平下降是原发性骨质疏松症（OP）的风险因素之一³⁵。因此，卵巢切除术是建立OP大鼠模型的可靠方法^8,9,10。此外，SD大鼠不仅易于获取，且性情温顺，饲养条件宽松。基于上述原因，我们首先对该模型进行了研究，并推荐使用精细的火针刺激穴位。我们的长期计划是通过在其他模型（如衰老大鼠）中进一步验证火针疗法缓解OP的效果，以拓展研究范围。最后，表3总结了单纯针灸对骨质疏松模型大鼠的疗效及其作用机制。未来我们将对可能的作用机制进行更深入的探讨^{36,37,38,39,40,41,42}。

结局指标		作用机制				参考文献
骨吸收		针灸通过抑制骨吸收，防止骨量丢失和结构改变。				36
骨强度		针灸增加松质骨体积和厚度，降低胫骨松质骨分离度，减少磷和脱氧吡啶啉（Dpd）的排泄，同时促进血清骨钙素浓度升高。				37
骨代谢		针灸可显著下调去卵巢大鼠血清碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（BGP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）水平。				38
信号通路		针灸通过调控Wnt信号通路，提高大鼠骨矿物密度，减轻体内炎症反应，并增加成骨相关因子的表达水平。				39,40
内分泌调节作用		针灸调节血清雌二醇、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质酮（CORT）水平。				41
体重		针灸通过调节瘦素水平的变化，抑制体重增加。				36,41
脑源性神经营养因子		针灸可提高BDNF和TrkB的表达水平，加速骨质疏松后骨折愈合过程。				42

表3：单纯针刺对骨质疏松模型大鼠疗效的影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
75% 酒精	山东利康医疗科技有限公司		消毒
95% 酒精	山东利康医疗科技有限公司		灼烧针头
成年雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠	辽宁长生生物技术有限公司	SCXK 2020-0001	骨质疏松症的建模
豪华温控加热垫	臻华仪器		用于维持大鼠体温。
双氯芬酸钠注射液	山东省健木生物医药有限公司	150182913	解热镇痛
升高型固定架	台州市艾科学教育仪器设备有限公司		固定大鼠
火针	北京罗亚山川医疗设备有限公司	20190240	一种针刺工具
止血钳	青岛施密茨生物技术有限公司		固定大鼠
Liguter	上海马驰贸易有限公司	H5	点燃酒精
碘伏消毒液	青岛海氏海诺创新消毒科技有限公司	2016-0604	消毒
医用棉球	江苏三和医用材料有限公司	20172142357	消毒
戊巴比妥钠	北京杰辉生物科技有限公司	P3761	麻醉
宠物电推剪	奉化溪口鲁褒刀具 &安普&剪刀电器厂		剃除大鼠的毛发
自制大鼠外套			固定大鼠
镊子	青岛施密茨生物技术有限公司		捏紧棉球