外来入侵植物研究中丛枝菌根真菌定殖率的量化

摘要

本方案提供了一种简单且易于操作的方法，用于测定丛枝菌根真菌（AMF）在入侵植物根部的定殖率。

摘要

丛枝菌根真菌（AMF）是生态系统中广泛分布的土壤真菌，能够与大多数陆生植物的根系形成共生关系（菌根）。植物通过菌根共生关系向AMF提供碳源，而AMF的菌丝则可扩大根系的养分吸收范围，促进植物对养分的吸收。AMF包含多种不同物种，不同AMF物种与不同植物之间的共生关系存在差异。入侵植物可通过根系分泌物富集共生能力更强的AMF物种，促进自身生长，从而增加其在入侵植物根系中的定殖。同时，入侵植物还可能破坏AMF与本地植物之间的共生关系，影响当地植物群落结构，这是植物成功入侵的机制之一。AMF在入侵植物与本地植物根系中的定殖率间接反映了AMF在植物入侵过程中的作用。本方法中，采集的植物根系可直接处理，也可保存于固定液中以备后续批量处理。通过对根系进行脱色、酸化、染色和脱染处理，可清晰观察到根系中AMF的菌丝、孢子及丛枝结构。该方法可在基础实验室完成，用于观察并计算入侵植物根系中AMF的定殖率。

引言

菌根真菌广泛存在于自然生态系统中，能与大多数植物的根系建立共生关系，形成菌根¹。这种共生关系对双方均有益处：植物为菌根真菌提供光合作用固定的碳化合物（如脂肪酸和糖类），以支持其生长；而真菌则向宿主植物提供磷、氮等矿物质养分，从而促进植物生长²。根据与植物根系形成的菌根类型，菌根真菌可分为四大类：外生菌根（ECM）真菌、杜鹃花类菌根（ERM）真菌、兰科菌根（ORM）真菌和丛枝菌根（AM）真菌¹。其中，丛枝菌根真菌（AMF）分布最广，可与超过80%的植物物种形成菌根共生关系^3,4。

丛枝菌根真菌（AMF）在促进土壤养分循环⁵、提高植物养分吸收效率⁶以及调节植物间的竞争与演替过程中发挥着关键作用。它们在入侵植物物种的定殖过程中也具有重要作用^7,8。AMF隶属于毛霉门（Mucoromycota）⁹，包含超过250个物种¹⁰....

方案

我们采用一种入侵植物 F. bidentis 和一种本地植物 Setaria viridis 开展实验。两种植物均种植于中国河北省廊坊市的中国农业科学院（CAAS）科研试验基地。每种植物分别种植在独立的样地内，每个样地面积为 2 m × 3 m，样地之间间隔 1 米。植物自然生长约两个月后，采集根系样品。

1. 根系制备与保存

1. 在每个样地内随机选取三株生长状况相似的植株。用铁铲松动植株周围的土壤，轻轻将植株拔出。抖落根部附着的土壤后，切下整套根系并带回实验室。将采集的根样在流动水下彻底冲洗干净，并将同一样地内三株植物的根混合，组成一个生物学重复。
   注意：为便于描述操作流程，本方案以一个生物学重复为例进行说明。为确保实验结果的可靠性，在实际操作中应根据实验设计至少采集三个生物学重复的样品。
2. 用滤纸吸去清洗后根系表面多余的水分，并使其自然风干。
3. 用剪刀剪除受损的根段，保留完整的细根用于储存或进入下一步操作。若计划在2天内进行后续操作，可将根样置于4 °C冰箱中短期保存。若需长期保存根样，则应将其置于固定液（如福尔马林-醋酸-酒精溶液（FAA，38%甲醛5 mL + 冰醋酸5 mL + 70%酒精90 mL））中固定。
   ​注意：使用FAA固定液并非必需步骤。若样品数量较少，且可在采集后短时间内完成染色与根系计数....

结果

使用该方法对入侵植物根部进行染色的结果如图1所示。菌根真菌（AMF）的结构（菌丝、丛枝、孢子和泡囊）被染成红色，脱色后根皮层细胞呈浅红色，中柱被染成红色。该染色结果足以区分真菌结构，因为AMF主要存在于植物皮层中。从染色结果中可以清晰观察到丛枝（A）、根内菌丝（IH）、根外菌丝（EH）、孢子（S）、泡囊（V）以及附着胞等结构。丛枝通常位于根部皮层细胞内，呈现树状分枝结构，其染色颜色较菌丝和泡囊更浅。在40倍物镜下，可观察到菌丝进入细胞并形成分枝状的丛枝结构（图1B）。根内菌丝和根外菌丝分别存在于根内细胞间和根外，表现为红色或深红色的丝状结构（图1）。泡囊是AMF的储存结构，位于根部皮层或皮层细胞附近，形态和大小多样，如圆形、椭圆形或不规则球形（图1A、C）。孢子是AMF的繁殖结构，通常在土壤中形成，某些物种可在根内产生孢子。孢子的大小和形状各异，染色后呈球形或椭球形（.......

讨论

外来植物与丛枝菌根真菌（AMF）之间的相互作用复杂多样。研究这些相互作用对于理解外来植物的成功入侵机制及其生态效应至关重要。这些相互作用可影响植物的入侵能力、土壤生态系统的结构与功能，以及本地植物的竞争能力。定殖率是研究外来植物与AMF关系的重要指标，它为建立共生关系、评估入侵能力、分析生态效应以及研究相互竞争提供了定量依据，从而加深我们对外来植物与AMF之间相互作用及其生态效应的理解^7,8,31。

由于丛枝菌根真菌（AMF）菌丝在根系内部生长，观察其在根内的生长情况并量化定殖率，需要对根进行透明化处理和菌丝染色。根透明化主要使用KOH完成，其浓度和处理时间需根据根的状况进行调整。染色过程对于成功观察菌丝结构至关重要。在过去几十年中，研究人员已采用多种染色方法，其中最广泛使用的是台盼蓝和酸性品红染色法³³。近年来，多种替代性染色方法被探索，例如甲基蓝.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70% 酒精	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	R433197
乙酸溶液	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	A116166
酸性品红	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	A104917
甲醛溶液，福尔马林	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	F111941
甘油	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	G116203
盐酸，HCl	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	H399657
乳酸	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	L432769
手动系统显微镜 BX43	奥林巴斯（中国）有限公司
氢氧化钾，KOH	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	P112284