方法文章

外来入侵植物研究中丛枝菌根真菌定殖率的量化

1.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65971

⸱

2023年12月1日

 ,  , 
1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

本文内容

摘要

本方案提供了一种简单且易于操作的方法，用于测定丛枝菌根真菌（AMF）在入侵植物根部的定殖率。

摘要

丛枝菌根真菌（AMF）是生态系统中广泛分布的土壤真菌，能够与大多数陆生植物的根系形成共生关系（菌根）。植物通过菌根共生关系向AMF提供碳源，而AMF的菌丝则可扩大根系的养分吸收范围，促进植物对养分的吸收。AMF包含多种不同物种，不同AMF物种与不同植物之间的共生关系存在差异。入侵植物可通过根系分泌物富集共生能力更强的AMF物种，促进自身生长，从而增加其在入侵植物根系中的定殖。同时，入侵植物还可能破坏AMF与本地植物之间的共生关系，影响当地植物群落结构，这是植物成功入侵的机制之一。AMF在入侵植物与本地植物根系中的定殖率间接反映了AMF在植物入侵过程中的作用。本方法中，采集的植物根系可直接处理，也可保存于固定液中以备后续批量处理。通过对根系进行脱色、酸化、染色和脱染处理，可清晰观察到根系中AMF的菌丝、孢子及丛枝结构。该方法可在基础实验室完成，用于观察并计算入侵植物根系中AMF的定殖率。

引言

菌根真菌广泛存在于自然生态系统中，能与大多数植物的根系建立共生关系，形成菌根1。这种共生关系对双方均有益处：植物为菌根真菌提供光合作用固定的碳化合物（如脂肪酸和糖类），以支持其生长；而真菌则向宿主植物提供磷、氮等矿物质养分，从而促进植物生长2。根据与植物根系形成的菌根类型，菌根真菌可分为四大类：外生菌根（ECM）真菌、杜鹃花类菌根（ERM）真菌、兰科菌根（ORM）真菌和丛枝菌根（AM）真菌1。其中，丛枝菌根真菌（AMF）分布最广，可与超过80%的植物物种形成菌根共生关系3,4。

丛枝菌根真菌（AMF）在促进土壤养分循环5、提高植物养分吸收效率6以及调节植物间的竞争与演替过程中发挥着关键作用。它们在入侵植物物种的定殖过程中也具有重要作用7,8。AMF隶属于毛霉门（Mucoromycota）9，包含超过250个物种10。不同AMF物种与不同植物之间可能形成特异性的共生关系。入侵植物物种有可能改变AMF的多样性，并促进那些具有更强共生能力的AMF物种富集，从而在生长和定殖过程中获得竞争优势8,11,12,13。深入了解AMF的动态变化及其与入侵植物物种之间的相互作用，对于揭示植物入侵的机制及其生态影响至关重要。

对丛枝菌根真菌（AMF）物种的定性研究通常包括两种主要方法。一种是形态学鉴定，例如通过湿筛-蔗糖离心法从土壤中收集AMF孢子，然后根据孢子的形态特征进行分类和定量14。另一种方法采用分子技术，通过扩增AMF基因的保守区域并进行测序以实现鉴定15。然而，这些方法通常需要丰富的形态学鉴定经验或较高的经费投入。相比之下，对AMF定殖率的定量研究虽然无法确定AMF物种及其组成的变化，但仍能全面评估AMF与植物之间的共生关系。这类研究在基础科研以及接种实验的后续验证工作中均不可或缺。

丛枝菌根真菌（AMF）的定殖在决定共存植物物种间资源分配方面起着关键作用7。它反映了AMF与宿主植物根系之间共生关系的建立程度和强度。在同一生境中，入侵植物物种通常表现出比本地植物更高的定殖率16,17。AMF的这种增强定殖有助于多种入侵物种的成功入侵，例如Ambrosia artemisiifolia18、Solidago canadensis19、Sapium sebiferum20、Ageratina adenophora21、Sphagneticola trilobata22和Flaveria bidentis7。了解入侵植物根系中AMF的定殖率，为揭示这些物种成功入侵背后的土壤微生物机制奠定了基础。研究入侵植物根部AMF的定殖率，有助于阐明植物-微生物相互作用的生态意义，并加深我们对驱动植物入侵机制的理解。

AMF定殖率的测定涉及一种染色显微技术，包括多个步骤：根系保存、透明化、酸化、染色、脱色及显微观察（补充 图1）。在过去几十年中，研究人员探索了多种AMF的观察方法，并发展出多种染色技术。早期阶段，广泛使用台盼蓝染色法23,24。然而，该方法因台盼蓝具有毒性而存在局限性。相比之下，酸性品红染色是一种常用方法，可产生鲜明的颜色，并具有可靠且稳定的染色效果25。此外，染色液可重复使用，因而更具成本效益。定殖率的计算采用网格线交叉法，该方法相比其他方法可提供更为客观的统计结果26。该方法具有操作简便、成本低、设备需求少的特点，可在基础实验室条件下实施。该方法为评估AMF定殖率提供了一种实用且易于推广的技术路径，有助于加深对AMF与植物根系共生关系的理解。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

我们采用一种入侵植物 F. bidentis 和一种本地植物 Setaria viridis 开展实验。两种植物均种植于中国河北省廊坊市的中国农业科学院（CAAS）科研试验基地。每种植物分别种植在独立的样地内，每个样地面积为 2 m × 3 m，样地之间间隔 1 米。植物自然生长约两个月后，采集根系样品。

1. 根系制备与保存

  1. 在每个样地内随机选取三株生长状况相似的植株。用铁铲松动植株周围的土壤，轻轻将植株拔出。抖落根部附着的土壤后，切下整套根系并带回实验室。将采集的根样在流动水下彻底冲洗干净，并将同一样地内三株植物的根混合，组成一个生物学重复。
    注意：为便于描述操作流程，本方案以一个生物学重复为例进行说明。为确保实验结果的可靠性，在实际操作中应根据实验设计至少采集三个生物学重复的样品。
  2. 用滤纸吸去清洗后根系表面多余的水分，并使其自然风干。
  3. 用剪刀剪除受损的根段，保留完整的细根用于储存或进入下一步操作。若计划在2天内进行后续操作，可将根样置于4 °C冰箱中短期保存。若需长期保存根样，则应将其置于固定液（如福尔马林-醋酸-酒精溶液（FAA，38%甲醛5 mL + 冰醋酸5 mL + 70%酒精90 mL））中固定。
    ​注意：使用FAA固定液并非必需步骤。若样品数量较少，且可在采集后短时间内完成染色与根系计数，则可省略FAA固定步骤，直接在洗净根部后进行后续操作。使用FAA固定液时，因含有甲醛，操作应在通风良好的环境中进行。

2. 根部染色

  1. 从保存液中取出根系，用清水冲洗干净。将根系放入100 mL烧杯中，加入约50 mL的10% KOH溶液（10 g KOH + 100 mL水），确保所有根系完全浸没于溶液中。在90 °C下加热30分钟。
    注意：根据根系的成熟程度调整加热时间。此步骤可去除根系中的色素，使其透明，便于显微镜观察。
  2. 倒掉烧杯中的KOH溶液，用自来水轻轻冲洗根样3至6次，以去除残留的KOH。倒去多余的水分。
    注意：确保烧杯及所有使用工具上的KOH残留物彻底清除，否则可能影响下一步的酸化效果，从而降低酸性品红染色的效果。
  3. 向烧杯中加入2% HCl溶液，确保液体完全覆盖根系。在室温下让根系在酸性溶液中浸泡10分钟。
  4. 倒掉HCl溶液，加入约50 mL的0.01%酸性品红溶液（874 mL乳酸，63 mL甘油，63 mL蒸馏水，0.1 g酸性品红）。在90 °C下染色20–60分钟。染色完成后，酸性品红溶液可回收并用于后续染色。
    ​注意：染色时间可能因根系的年龄和状态而异，幼嫩根系可能需要在室温下过夜染色。

3. 脱色与显微镜观察

  1. 将染色后的根置于约 50 mL 乳酸（85%）溶液中，以去除根细胞中的酸性品红。该脱色处理将使丛枝菌根真菌（AMF）组织保持红色，而根细胞无色或呈淡红色。中柱部分可能呈现红色。
  2. 在 200 倍显微镜下观察根组织与真菌组织，确保两者界限清晰后再停止脱色。当 AMF 结构与根细胞可被明确区分时，即可结束脱色过程。
    注意：根据根的成熟度调整脱色时间。在脱色过程中，可随机选取部分根制作压片，在显微镜下观察。
  3. 将根从乳酸溶液中取出，转移至约 50 mL 甘油（99%）溶液中。此时 AMF 结构和根细胞内的酸性品红不再发生分离，可用于后续显微观察。
  4. 在载玻片上滴加一滴甘油。对每个重复，随机选取 30–50 条根，从每条根上截取 1 cm 长的根段。将根段置于含甘油的载玻片上，使其与载玻片短边平行，并彼此平行排列（补充图 1）。每张载玻片放置 10 个根段，每个重复共制备 3 至 5 张载玻片。
    注意：本步骤描述的是用于观察的根段数量，即每个重复的技术重复数。每个样品所观察的根段数量应根据植物种类和根的形态合理安排。对于细根，每个样品观察 30–50 段、每段 1 cm 长的根段已足够；但对于较粗的根（如玉米根），则需适当增加观察数量。为确保统计结果的可靠性，每个处理至少应设置 3 个生物学重复，每个生物学重复均按上述方法操作。
  5. 盖上盖玻片。盖片后避免样品水平移动，以防根段摩擦或变形。此举可确保菌丝形态的自然状态不受干扰，从而保证定殖率计算的准确性。
  6. 使用 200 倍显微镜，参照示意图（补充图 2）采用交叉计数法测定定殖率。
    1. 在显微镜目镜中安装带十字丝的测微尺。将视野移至根的一端，使其中一条十字丝与根平行。观察另一条线是否与菌丝、丛枝或泡囊相交。
    2. 沿根的方向移动视野至另一端，每次移动的距离依据显微镜载物台坐标保持一致。采用二进制方式（0 或 1）记录每个视野中的交点：若另一条十字丝与 AMF 菌丝、丛枝或泡囊相交，则在对应表格中记为 1；否则记为 0。若未与任何 AMF 结构相交，则在阴性区域记为 1。每个根段观察 10 个视野，每张载玻片共获得 100 次观察，每个植物样品共进行 300 至 500 次观察。

4. 定植率计算

  1. 根据每张载玻片的10条根中记录的菌丝（H）、丛枝（A）和泡囊（V）的交点数以及非菌根（N）的交点数（如表1所示），按以下方式计算定殖率：

    菌丝定殖率 = (AH / AT) × 100%
    丛枝定殖率 = (AA / AT) × 100%
    泡囊定殖率 = (AV / AT) × 100%
    总定殖率 = [(AT - AN) / AT] × 100%

    其中：
    AH：与菌丝相交的交点数
    AA：与丛枝相交的交点数
    AV：与泡囊相交的交点数
    AT：交点总数
    AN：与非菌根根段相交的交点数

    上述计算可提供各结构（菌丝、丛枝和泡囊）的定殖率以及总体定殖率，总体定殖率为所有结构定殖率之和。
处理切片交叉数目
阴性菌丝丛枝泡囊总计
样本 1切片 1AN1AH1AA1AV1AT1
切片 2AN2AH2AA2AV2AT2
切片 3AN3AH3AA3AV3AT3
总计ANAHAAAVAT

表1：丛枝菌根真菌定殖率的统计表。 缩写： AH = 含菌丝的交叉点数量；AA = 含丛枝的交叉点数量；AV = 含泡囊的交叉点数量；AT = 总交叉点数量；AN = 含非菌根根系的交叉点数量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

使用该方法对入侵植物根部进行染色的结果如图1所示。菌根真菌（AMF）的结构（菌丝、丛枝、孢子和泡囊）被染成红色，脱色后根皮层细胞呈浅红色，中柱被染成红色。该染色结果足以区分真菌结构，因为AMF主要存在于植物皮层中。从染色结果中可以清晰观察到丛枝（A）、根内菌丝（IH）、根外菌丝（EH）、孢子（S）、泡囊（V）以及附着胞等结构。丛枝通常位于根部皮层细胞内，呈现树状分枝结构，其染色颜色较菌丝和泡囊更浅。在40倍物镜下，可观察到菌丝进入细胞并形成分枝状的丛枝结构（图1B）。根内菌丝和根外菌丝分别存在于根内细胞间和根外，表现为红色或深红色的丝状结构（图1）。泡囊是AMF的储存结构，位于根部皮层或皮层细胞附近，形态和大小多样，如圆形、椭圆形或不规则球形（图1A、C）。孢子是AMF的繁殖结构，通常在土壤中形成，某些物种可在根内产生孢子。孢子的大小和形状各异，染色后呈球形或椭球形（...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

外来植物与丛枝菌根真菌（AMF）之间的相互作用复杂多样。研究这些相互作用对于理解外来植物的成功入侵机制及其生态效应至关重要。这些相互作用可影响植物的入侵能力、土壤生态系统的结构与功能，以及本地植物的竞争能力。定殖率是研究外来植物与AMF关系的重要指标，它为建立共生关系、评估入侵能力、分析生态效应以及研究相互竞争提供了定量依据，从而加深我们对外来植物与AMF之间相互作用及其生态效应的理解7,8,31。

由于丛枝菌根真菌（AMF）菌丝在根系内部生长，观察其在根内的生长情况并量化定殖率，需要对根进行透明化处理和菌丝染色。根透明化主要使用KOH完成，其浓度和处理时间需根据根的状况进行调整。染色过程对于成功观察菌丝结构至关重要。在过去几十年中，研究人员已采用多种染色方法，其中最广泛使用的是台盼蓝和酸性品红染色法33。近年来，多种替代性染色方法被探索，例如甲基蓝...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由国家关键研发计划资助&中国国家重点研发计划（2021YFD1400100、2021YFC2600400 和 2022YFC2601100）以及国家自然科学基金（42207162）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
70% 酒精上海阿拉丁生化科技股份有限公司R433197
乙酸溶液上海阿拉丁生化科技股份有限公司A116166
酸性品红上海阿拉丁生化科技股份有限公司A104917
甲醛溶液，福尔马林上海阿拉丁生化科技股份有限公司F111941
甘油上海阿拉丁生化科技股份有限公司G116203
盐酸，HCl上海阿拉丁生化科技股份有限公司H399657
乳酸上海阿拉丁生化科技股份有限公司L432769
手动系统显微镜 BX43奥林巴斯（中国）有限公司
氢氧化钾，KOH上海阿拉丁生化科技股份有限公司P112284

参考文献

  1. Genre, A., Lanfranco, L., Perotto, S. Unique and common traits in mycorrhizal symbioses. Nat Rev Microbiol. 18 (11), 649-660 (2020).
  2. Shi, J., Wang, X., Wang, E. Mycorrhizal symbiosis in plant growth and stress adaptation: from genes to ecosystems. Annu Rev Plant Biol. 74, 569-607 (2023).
  3. Evelin, H., Devi, T. S., Gupta, S., Kapoor, R. Mitigation of salinity stress in plants by arbuscular mycorrhizal symbiosis: current understanding and new challenges. Front Plant Sci. 10, 470(2019).
  4. Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal symbiosis. , Academic press. (2010).
  5. Bender, S. F., Conen, F., Heijden, M. vd Mycorrhizal effects on nutrient cycling, nutrient leaching and N2O production in experimental grassland. Soil Biol Biochem. 80, 283-292 (2015).
  6. Shen, K., et al. AM fungi alleviate phosphorus limitation and enhance nutrient competitiveness of invasive plants via mycorrhizal networks in Karst Areas. Front Ecol Evol. 8, 125(2020).
  7. Zhang, F. J., et al. Arbuscular mycorrhizal fungi facilitate growth and competitive ability of an exotic species Flaveria bidentis. Soil Biol Biochem. 115, 275-284 (2017).
  8. Zhang, F., et al. AM fungi facilitate the competitive growth of two invasive plant species, Ambrosia artemisiifolia and Bidens pilosa. Mycorrhiza. 28 (8), 703-715 (2018).
  9. Spatafora, J. W., et al. A phylum-level phylogenetic classification of zygomycete fungi based on genome-scale data. Mycologia. 108 (5), 1028-1046 (2016).
  10. Tedersoo, L., et al. High-level classification of the fungi and a tool for evolutionary ecological analyses. Fungal Diversity. 90 (1), 135-159 (2018).
  11. Meinhardt, K. A., Gehring, C. A. Disrupting mycorrhizal mutualisms: a potential mechanism by which exotic tamarisk outcompetes native cottonwoods. Ecol Appl. 22 (2), 532-549 (2012).
  12. Dong, L. J., Ma, L. N., He, W. M. Arbuscular mycorrhizal fungi help explain invasion success of Solidago canadensis. Appl Soil Ecol. 157, 103763(2021).
  13. Ramana, J. V., Tylianakis, J. M., Ridgway, H. J., Dickie, I. A. Root diameter, host specificity and arbuscular mycorrhizal fungal community composition among native and exotic plant species. New Phytol. 239 (1), 301-310 (2023).
  14. Mertz, S. M., Heithaus, J. J., Bush, R. L. Mass production of axenic spores of the endomycorrhizal fungus Gigaspora margarita. Trans British Mycol Soc. 72 (1), 167-169 (1979).
  15. Renker, C., Heinrichs, J., Kaldorf, M., Buscot, F. Combining nested PCR and restriction digest of the internal transcribed spacer region to characterize arbuscular mycorrhizal fungi on roots from the field. Mycorrhiza. 13 (4), 191-198 (2003).
  16. Bunn, R. A., Ramsey, P. W., Lekberg, Y. Do native and invasive plants differ in their interactions with arbuscular mycorrhizal fungi? A meta-analysis. J Ecol. 103 (6), 1547-1556 (2015).
  17. Majewska, M. L., Rola, K., Zubek, S. The growth and phosphorus acquisition of invasive plants Rudbeckia laciniata and Solidago gigantea are enhanced by arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 27 (2), 83-94 (2017).
  18. Huang, D., Sang, W. G., Zhu, L., Song, Y. Y., Wang, J. P. Effects of nitrogen and carbon addition and arbuscular mycorrhiza on alien invasive plant Ambrosia artemisiifolia. Chinese J Appl Ecol. 21 (12), 3056-3062 (2010).
  19. Zhang, Q., et al. Positive feedback between mycorrhizal fungi and plants influences plant invasion success and resistance to invasion. PLoS ONE. 5 (8), e12380(2010).
  20. Yang, Q., Li, B., Siemann, E. Positive and negative biotic interactions and invasive Triadica sebifera tolerance to salinity: a cross-continent comparative study. Oikos. 124 (2), 216-224 (2015).
  21. Li, L. Q., et al. Arbuscular mycorrhizal fungi enhance invasive plant, Ageratina adenophora growth and competition with native plants. Chinese J Ecol. 35 (1), 79-86 (2016).
  22. QI, S. S., et al. Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on the growth and the competition of an invasive plant Wedelia trilobata. Microbiol China. 47 (11), 3801-3810 (2020).
  23. Phillips, J. M., Hayman, D. S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Trans British Mycol Soc. 55 (1), 158-161 (1970).
  24. Koske, R. E., Gemma, J. N. A modified procedure for staining roots to detect VA mycorrhizas. Mycol Res. 92 (4), 486-488 (1989).
  25. Kormanik, P. P., Bryan, W. C., Schultz, R. C. Procedures and equipment for staining large numbers of plant root samples for endomycorrhizal assay. Can J Microbiol. 26 (4), 536-538 (1980).
  26. McGonigle, T. P., Miller, M. H., Evans, D. G., Fairchild, G. L., Swan, J. A. A new method which gives an objective measure of colonization of roots by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytol. 115 (3), 495-501 (1990).
  27. Souza, T. Handbook of Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , Springer International Publishing. Switzerland. (2015).
  28. Chandwani, S., Maiti, S., Amaresan, N. Microbial Symbionts. , Academic Press. (2023).
  29. Piercey, M. M., Graham, S. W., Currah, R. S. Patterns of genetic variation in Phialocephala fortinii across a broad latitudinal transect in Canada. Mycol Res. 108 (Pt 8), 955-964 (2004).
  30. Jumpponen, A. R. I., Trappe, J. M. Dark septate endophytes: a review of facultative biotrophic root-colonizing fungi. New Phytol. 140 (2), 295-310 (1998).
  31. Du, E., et al. Rhizoglomus intraradices and associated Brevibacterium frigoritolerans enhance the competitive growth of Flaveria bidentis. Plant Soil. 453, 281-295 (2020).
  32. Wang, S. Y., et al. Practical methods for arbuscular mycorrhizal fungal spore density, hyphal density and colonization rate of AMF. Bio-protocol. 101, e2104253(2022).
  33. Sheng, P., Liu, R., Li, M. Methodological comparison of observation and colonization measurement of arbuscular mycorrhizal fungi. MYCOSYSTEMA. 30 (4), 519-525 (2011).
  34. Grace, C., Stribley, D. P. A safer procedure for routine staining of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi. Mycol Res. 95 (10), 1160-1162 (1991).
  35. Vierheilig, H., Coughlan, A. P., Wyss, U., Piche, Y. Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl Environ Microbiol. 64 (12), 5004-5007 (1998).
  36. Vierheilig, H., Schweiger, P., Brundrett, M. An overview of methods for the detection and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Physiol Plant. 125 (4), 393-404 (2005).
  37. Dalpé, Y., Séguin, S. M. Microwave-assisted technology for the clearing and staining of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Mycorrhiza. 23, 333-340 (2013).
  38. Biermann, B., Linderman, R. G. Quantifying vesicular-arbuscular mycorrhizae: a proposed method towards standardization. New Phytol. 87 (1), 63-67 (1981).
  39. Bethlenfalvay, G. J., Pacovsky, R. S., Brown, M. S. Measurement of mycorrhizal infection in soybeans. Soil Sci Soc Am J. 45 (5), 871-875 (1981).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

视频即将推出

相关文章