一种用于小鼠左肺移植的简易套管技术

摘要

本方案描述了一种用于小鼠左肺移植模型的套管技术。该技术经过数年发展，表现良好，可有效应用于免疫学研究。

摘要

在过去十年中，我们的实验室在开发和优化使用高效且高度可靠的“套管技术”进行带血管的小鼠肺移植模型方面取得了显著进展。本文介绍了一种在带血管的原位肺模型中进行原位肺移植的复杂而全面的方法，这是迄今为止最符合生理状态且最具临床相关性的小鼠肺移植模型。移植过程包括两个独立阶段：供体获取和随后的受体植入。该方法已成功掌握，经过数月的充分训练后，熟练的操作者可在约90分钟内完成从皮肤到皮肤的整个手术过程。令人惊讶的是，一旦克服了初始的学习曲线，围手术期的存活率几乎接近100%。该小鼠模型允许多种 commercially available 转基因和突变小鼠品系的使用，从而便于研究免疫耐受与排斥反应。此外，该模型的独特特性使其成为研究肿瘤生物学和免疫学的有力工具。

引言

尽管针对肾衰竭和心力衰竭患者已有透析和心室辅助装置等替代疗法，但对于终末期肺部疾病患者而言，肺移植仍是主要的治疗选择。该手术是肺纤维化患者唯一的挽救生命手段¹。此外，肺移植也用于延长终末期阻塞性肺疾病（如肺气肿）患者以及化脓性疾病（如囊性纤维化）患者的生存期¹。

尽管由于技术改进、围手术期护理的提升以及免疫抑制治疗的进步，短期存活率已有所改善，但肺移植后的长期预后明显差于其他实体器官移植。肺移植受者的总体五年存活率仅为50%，远低于接受心脏、肾脏或肝脏同种异体移植的患者¹。我们团队及其他研究者怀疑造成这种差异的原因在于缺乏具有临床相关性的生物学模型，以充分理解导致肺同种异体移植物排斥反应和/或耐受的通路，因为对具有生理相关性的小鼠模型进行实验性操作已显著促进了其他实体器官或细胞同种异体移植物的长期存活²。

在小鼠原位肺移植模型建立之前，研究人员依赖较大的动物模型进行研究。然而，这些较大的模型存在局限性，包括缺乏探索机制问题所需的转基因突变体³。此外，大鼠研究也面临类似的限制⁴，而小鼠的非血管化异位气管移植模型在应用上同样受限

方案

所有与动物相关的操作均按照马里兰大学巴尔的摩分校机构动物护理和使用委员会的规定进行，并已获得该委员会的批准。建议使用雄性、8-12周龄（20-25 g）的BALB/c小鼠作为供体，C57BL/6小鼠作为受体。动物来自商业来源（见材料表）。

1. 支气管和血管袖状结构的制备

时间：10 分钟（适用于三个袖带）

1. 使用18 G套管针制备支气管袖套，使用长度为1 mm（不包括延长手柄）的20 G套管针制备肺静脉袖套（参见材料表）。使用#11手术刀片以及套管针的金属针头作为切割面（图1）。
2. 以类似方式使用长度为0.6 mm的24 G套管针制备肺动脉袖套（参见材料表）。
   ​注意：袖套技术用于创建微血管吻合的基本原理如下：在进行小鼠肺移植时，由于血管尺寸微小，需采用特定的袖套技术。与可直接缝合的较大血管不同，微观的支气管和血管连接需要采用不同的方法。其基本原理是将供体血管穿过一个略大于血管本身的刚性环形袖套。

2. 供体操作步骤

结果

根据过去10年使用该模型的经验，具备基本显微外科技能的操作人员通常需要约50只动物的训练量才能掌握该技术。一旦达到熟练水平，供体手术通常需要15至30分钟，而受体手术则大约需要60分钟。度过初始的学习阶段后，围手术期死亡率通常极低。

在图4A、B中，将Balb/cJ供体左肺移植到C57/B6J受体后第七天的肺组织形态显示，接受共刺激阻断治疗的小鼠肺部结构保持正常。相比之下，未接受免疫抑制的小鼠则表现出排斥反应的迹象。

图4C、D中，共刺激阻断治疗小鼠的H&E染色显示免疫反应极轻微，提示存在免疫耐受。相比之下，未接受免疫抑制的小鼠则表现出明显的淋巴细胞浸润，提示发生排斥反应。

讨论

小鼠左肺移植的套管技术代表了移植研究领域的一项重要进展^10,11。关键步骤包括精确细致地解剖肺门结构以及可靠地完成吻合。该技术可根据实验需求进行调整，但需要一定的学习过程。我们课题组将受体小鼠的体位从俯卧位改为仰卧位，通过弯曲受体小鼠以获得更好的肺门视野，从而缩短了学习曲线。

局限性包括对超出指定体重范围的小鼠操作存在困难，以及需要具备显微外科经验的熟练外科医生。为降低移植物发生肺不张的风险，强烈建议在移植后实施呼气末正压（PEEP），并确保适当给予镇痛药物。为预防静脉撕裂，建议使用较小的套管尺寸（22 G）。此外，为避免动脉扭转，建议在制备完成后尽量减少移植物的移动，并在吻合过程中调整供体肺方向时格外小心。

尽管存在局限性，该方法的血管化途径仍优于非血管化模型，并具有更高的生理相关性。它还克服了异位气管模型的不足之处⁷，使其成为研究移植免疫生物学和疾病过程的理想.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10-0 尼龙缝线	Surgical Specialties Corporation, 阅读, PA	AK-0106
2 把杜蒙特 #5 镊子	Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA	11251-20
2 把哈尔斯特德-蚊式钳，弯头	Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA	91309-12
6-0 编织丝线缝线	Henry Schein 公司, 梅尔维尔, 纽约,	100-5597
6-0 聚对二氧环己酮 PDS II 缝线	Ethicon 公司, 萨默维尔, 新泽西州.	Z117H
70% 乙醇	Pharmco Products 公司, 布鲁克菲尔德, 康涅狄格州	111000140
阿德森镊子	Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA	91127-12
Balb/c 小鼠	Jackson 实验室, 巴港, 缅因州, 美国	000651	8–12 周龄；雄性
双极电凝器	Valleylab 公司, 博尔德, 科罗拉多州	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 小鼠	Jackson 实验室, 巴港, 缅因州, 美国	000664	8–12 周龄；雄性
透明氯己定	Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, 诺克罗斯, 佐治亚州	57591
电灼器	Bovie
精细弹簧剪（Vannas 型）	Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA	15000-03
哈尔西持针器	Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA	91201-13
哈佛仪器小鼠呼吸机 VentElite	哈佛仪器, 霍利斯顿, 马萨诸塞州	55-7040	设置：3L O2/分钟，呼吸频率 130 次/分钟，潮气量 0.4 cc
肝素溶液	Abraxis 制药产品公司, 肖姆堡, 伊利诺伊州	504031	100 U/mL
注射级生理盐水	Hospira 公司, 森林湖, 伊利诺伊州	NDC 0409-4888-20
氯胺酮	VetOne, 博伊西, 爱达荷州	501072	50 mg/kg
Konig Mixter 微型儿科镊子，直角钳口	Medline, 北菲尔德, 伊利诺伊州,	MDS1247714	超细，总长度 5 1/2" (14cm)
Medline 高温电灼器，带精细尖端	Leica Microsystems 公司, 阿兰代尔, 新泽西州	10 450 290
Leica M80 F12 地面支架显微镜	Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA	15396-00
Moria 超细弹簧剪	Parkland Scientific, 珊瑚泉, 佛罗里达州	V3000i
Ohio 异氟烷蒸发器	Vitrolife 公司, 恩格尔伍德, 科罗拉多州,	19001
Perfadex 低钾右旋糖酐葡萄糖溶液	Becton Dickinson 实验室器皿, 弗兰克林湖, 新泽西州	353025	电解质保存液
聚苯乙烯培养皿	Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA	00632-11 和 00649-11	150 × 25 mm 和 60 × 25 mm
S&T SuperGrip 镊子，直头和角头	Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA	18200-20
小型动物牵开系统	Puritan Medical 公司, 伊利诺伊州吉尔福德	823-WC	锥形迷你棉签，3 英寸涂抹器
无菌棉签	Terumo 医疗公司, 埃尔克顿, 马里兰州	SROX2419Z
Surflo etfe 静脉导管，黄色，24 G x 0.75"	Terumo 医疗公司, 埃尔克顿, 马里兰州	SROX1851Z
Surflo etfe 静脉导管；绿色，18 G x 2"	Terumo 医疗公司, 埃尔克顿, 马里兰州	SROX2032Z
Surflo etfe 静脉导管；粉色，20 G x 1.25"	Thermocare 公司, 倾斜村, 内华达州
ThermoCare 小型动物重症监护系统	A to Z Vet Supply, 德累斯顿, 田纳西州	008679	10 mg/kg
赛拉嗪	Aesculap 公司, 中心谷, 宾夕法尼亚州,	FT480T
Yasargil 动脉瘤夹施加器	Aesculap 公司, 中心谷, 宾夕法尼亚州,	FT264T
Yasargil 临时性动脉瘤夹	Medline, 北菲尔德, 伊利诺伊州,	ESCT001