本方案描述了一种用于小鼠左肺移植模型的套管技术。该技术经过数年发展，表现良好，可有效应用于免疫学研究。
本文内容
摘要
摘要
在过去十年中，我们的实验室在开发和优化使用高效且高度可靠的“套管技术”进行带血管的小鼠肺移植模型方面取得了显著进展。本文介绍了一种在带血管的原位肺模型中进行原位肺移植的复杂而全面的方法，这是迄今为止最符合生理状态且最具临床相关性的小鼠肺移植模型。移植过程包括两个独立阶段：供体获取和随后的受体植入。该方法已成功掌握，经过数月的充分训练后，熟练的操作者可在约90分钟内完成从皮肤到皮肤的整个手术过程。令人惊讶的是，一旦克服了初始的学习曲线，围手术期的存活率几乎接近100%。该小鼠模型允许多种 commercially available 转基因和突变小鼠品系的使用，从而便于研究免疫耐受与排斥反应。此外，该模型的独特特性使其成为研究肿瘤生物学和免疫学的有力工具。
引言
尽管针对肾衰竭和心力衰竭患者已有透析和心室辅助装置等替代疗法，但对于终末期肺部疾病患者而言，肺移植仍是主要的治疗选择。该手术是肺纤维化患者唯一的挽救生命手段1。此外，肺移植也用于延长终末期阻塞性肺疾病（如肺气肿）患者以及化脓性疾病（如囊性纤维化）患者的生存期1。
尽管由于技术改进、围手术期护理的提升以及免疫抑制治疗的进步，短期存活率已有所改善，但肺移植后的长期预后明显差于其他实体器官移植。肺移植受者的总体五年存活率仅为50%，远低于接受心脏、肾脏或肝脏同种异体移植的患者1。我们团队及其他研究者怀疑造成这种差异的原因在于缺乏具有临床相关性的生物学模型，以充分理解导致肺同种异体移植物排斥反应和/或耐受的通路，因为对具有生理相关性的小鼠模型进行实验性操作已显著促进了其他实体器官或细胞同种异体移植物的长期存活2。
在小鼠原位肺移植模型建立之前，研究人员依赖较大的动物模型进行研究。然而，这些较大的模型存在局限性，包括缺乏探索机制问题所需的转基因突变体3。此外，大鼠研究也面临类似的限制4，而小鼠的非血管化异位气管移植模型在应用上同样受限5。研究表明，在多种器官系统中，使用血管化移植模型比非血管化模型更为重要 。例如，将新生心脏组织移植物植入受体小鼠耳廓的非血管化移植方式，无法与血管内皮及受体血液循环发生直接相互作用，因此其相关性相较于血管化的人类心脏移植物较为有限6。类似地，由于缺乏血管化和通气，异位气管移植模型与人类肺移植存在显著差异，尤其是在移植后小气道所观察到的气道改变方面。此外，异位气管同种异体移植物中纤维化闭塞的快速发生，并不能反映在人类肺脏或在较大动物及大鼠的血管化肺移植物中的实际观察结果7。
在我们的研究实验室中，原位小鼠肺移植模型的建立受到大鼠原位单肺移植模型的启发8,9。与人类不同，小鼠和大鼠的左肺仅有一个肺叶，占总肺质量的约百分之二十五。这一特点使得在小鼠模型中成功实施左肺移植成为可能，且无需循环支持10,11。随着时间的推移，我们对该模型进行了多项技术改进，本文将重点阐述这些有助于简化手术操作的关键步骤。
除了在移植免疫生物学研究中的意义之外，原位小鼠肺移植模型还为探索肺部非造血基质细胞在多种疾病过程中的作用提供了一个强有力的工具。这是因为通过突变同系单肺移植，可几乎完全将造血细胞替换为受体来源的细胞，而非造血基质细胞仍持续来源于供体。因此，无需宿主照射或肺特异性转基因表达，即可构建"嵌合器官"12。此外，在同一动物体内，对侧的天然肺可作为内部对照，且不会引起宿主免疫系统的广泛改变。该模型在推进肺移植及其他涉及肺基质细胞的疾病通路研究方面具有重要意义。
方案
所有与动物相关的操作均按照马里兰大学巴尔的摩分校机构动物护理和使用委员会的规定进行，并已获得该委员会的批准。建议使用雄性、8-12周龄（20-25 g）的BALB/c小鼠作为供体，C57BL/6小鼠作为受体。动物来自商业来源（见材料表）。
1. 支气管和血管袖状结构的制备
时间：10 分钟（适用于三个袖带）
- 使用18 G套管针制备支气管袖套，使用长度为1 mm（不包括延长手柄）的20 G套管针制备肺静脉袖套（参见材料表）。使用#11手术刀片以及套管针的金属针头作为切割面（图1）。
- 以类似方式使用长度为0.6 mm的24 G套管针制备肺动脉袖套（参见材料表）。
注意：袖套技术用于创建微血管吻合的基本原理如下：在进行小鼠肺移植时，由于血管尺寸微小，需采用特定的袖套技术。与可直接缝合的较大血管不同，微观的支气管和血管连接需要采用不同的方法。其基本原理是将供体血管穿过一个略大于血管本身的刚性环形袖套。
2. 供体操作步骤
时间：10–15 分钟
- 腹腔注射（i.p.）50 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪（见 材料表)以麻醉供体小鼠（遵循机构批准的方案）。
- 在确保麻醉充分后 通过 趾捏，剃除供体小鼠毛发，并将其置于手术显微镜下，调至10倍放大倍数，保持仰卧位。
- 注射 50 uL 肝素（参见 材料表)通过阴茎静脉（图2A).
- 沿气管切开并插入20 G套管针，然后用6-0丝线环绕结扎（参见 材料表）。将导管连接至呼吸机（图2B).
- 进行腹部正中切口（剖腹手术），并在膈肌上做环形切口（图2C).
- 行正中胸骨切开术12 并在胸骨两侧各放置一把止血钳，用于止血并从骨缘进行牵拉（图 2D).
- 取出胸腺，并切除左右心耳，以利于肺部引流液的排出。
- 注射3 mL市售的低温4 °C保存液（参见 材料表使用3 mL注射器连接27 G针头，将液体直接注入右心室或肺动脉根部，以冲洗肺部所有血液。
注意：心室内或肺动脉注射可能对供体肺造成损伤。灌注时必须维持充分的通气，以确保保存液均匀分布。 - 近端夹闭气管，然后远端切断气管。接着向尾侧及后方分离气管。12.
- 取出心肺组织块，转移至一个无菌的小型培养皿中，该培养皿内铺有经冷保存液浸湿的纱布。随后，将此培养皿置于装有冰块的较大培养皿中图 2E).
- 为暴露左侧肺门，将小块纱布分别置于左、右肺组织上以牵拉（图2F).
- 使用弯头镊子精确地轻轻分离肺门结构。将左肺动脉（PA）从支气管分离出来图 2G）。接着以类似方法解剖位于肺门最尾侧、支气管后方的肺静脉（PV）。图 2H).
- 尽可能长地切断肺动脉（PA）和肺静脉（PV），以确保正确套管。尽量避免切除过多的脂肪或淋巴组织，因为这可能导致套管步骤难以操作。
- 将PV套管置于肺动脉上方约2 mm处，使用稳定夹固定，然后将肺静脉插入套管内。将肺静脉翻转覆盖在套管上，从而暴露内皮表面（图 2I用10-0缝线（打2个结）将它固定在套管周围（图2J).
- 将肺动脉（PA）从肺门处分离，并以相同方式在肺动脉上放置套管。
注意：此阶段切勿切断支气管。相反，在植入前应确保对支气管进行套袖处理，以防止保存液在储存期间进入气道。将肺组织块浸入4 °C的保存液中。
3. 受体操作步骤
时间：50–60 分钟
- 用氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物对受体小鼠进行腹腔注射麻醉（遵循机构批准的实验方案）。随后，剃除左侧胸部毛发并进行气管插管12.
- 在直视下进行插管，轻轻将舌头拉出口腔以暴露声门。在解剖显微镜下以10倍放大倍数进行此操作。通过插入一根20 G × 1.25的导管对动物进行插管。" 在声带之间直接插入套管针。
- 将动物置于右侧卧位，用70%乙醇清洁胸壁。图3A).
- 使用剪刀切开皮肤，并完全用电灼器完成左侧开胸术（参见 材料表).
注意：为尽量减少此步骤中胸壁的出血，分离操作的各个部分均应使用电灼止血。使用乙醇擦拭后必须将皮肤擦干，因为乙醇与电灼同时使用存在烧伤风险。 - 从第3肋间进入胸腔rd 或 4th 肋间隙并放置两个胸腔拉钩（参见 材料表) (图3B).
- 开胸后，将小鼠转为仰卧位。轻微弯曲受体小鼠的身体，使左侧胸部更靠近操作者，以充分暴露肺门区域，提高视野清晰度和操作可及性。
- 将一把直角动脉钳（6 英寸）置于受体左肺，轻轻牵拉肺组织。这有助于暴露前肺门，便于进一步的手术入路和操作。图3C).
- 使用弯头解剖镊将肺动脉（PA）从支气管分离，注意避免撕裂血管。最佳解剖位置为中段，分离距离约2 mm即可（图3D).
- 以类似方式从支气管分离肺静脉图3E).
- 为了阻断受体左肺的气流和血流，放置一个动脉瘤微型夹（参见 材料表) 位于肺门基底部（图 3F).
- 使用显微剪刀在受体肺动脉（PA）和肺静脉（PV）处做一个小的V形切口。用直头或弯头镊子轻柔地扩张支气管和血管开口，以形成适合放置供体袖套的开口。
- 用稀释肝素（肝素：生理盐水 = 1:9）轻柔冲洗以去除血液。
- 在肺动脉周围放置10-0尼龙线，并保持松弛状态（用于后续固定套管）。
- 然后，以与肺动脉和肺静脉类似的方式切断供体支气管并进行套管处理。弃去供体右肺-心脏复合体。
- 手持受体左肺，将供体肺置于牵开器上方，并用一小块湿润纱布覆盖。
注意：应保持受体左肺的位置，以对受体肺门施加张力，从而便于吻合操作。 - 从前侧暴露带套袖的肺门结构，并在下方固定套袖的同时，将供体肺动脉（PA）置入受体肺动脉（PA）内，开始吻合。此时供体肺动脉会受到一定程度的牵拉（图 3G).
- 当供体肺动脉（PA）插入受体肺动脉（PA）后，将微型夹夹在套管延伸部分以固定结构。接下来，将先前放置的10-0尼龙缝线在受体肺动脉（PA）和套管周围打两个结进行固定（参见 图3H最后，将微型夹从延伸套筒上取下。
- 以类似方式将供体的PV插入受体的PV中（图 3I).
- 将供体支气管插入受体支气管，确保供体支气管处于一定张力下（图3J）。松开肾门处的微夹以恢复灌注和通气（图 3K).
- 在胸腔内，插入供体肺，并通过切断受体肺动脉（PA）、肺静脉（PV）和支气管前部残留的部分，切除受体左侧肺图3L）。弃去受体左侧肺。
- 使用6-0 PDS缝线关闭胸腔（参见 材料表），从而固定胸廓切口下方和上方各一根肋骨。在关闭胸腔前，给予动物一次深呼吸，以排出胸腔内残留的空气。
注意：与大鼠模型不同，小鼠无需插入胸管。 - 使用连续皮下缝合的6-0丝线缝合皮肤及皮下组织（参见 材料表).
4. 动物恢复
时间：12 h
- 将动物置于小型动物重症监护室（便携式动物重症监护单元，参见材料表）中，自由摄取食物和饮水，过夜恢复。
- 皮下注射布托啡诺（0.5–1 mg/kg），每12小时一次，以减轻术后疼痛。
结果
根据过去10年使用该模型的经验，具备基本显微外科技能的操作人员通常需要约50只动物的训练量才能掌握该技术。一旦达到熟练水平，供体手术通常需要15至30分钟，而受体手术则大约需要60分钟。度过初始的学习阶段后，围手术期死亡率通常极低。
在图4A、B中，将Balb/cJ供体左肺移植到C57/B6J受体后第七天的肺组织形态显示，接受共刺激阻断治疗的小鼠肺部结构保持正常。相比之下，未接受免疫抑制的小鼠则表现出排斥反应的迹象。
图4C、D中，共刺激阻断治疗小鼠的H&E染色显示免疫反应极轻微，提示存在免疫耐受。相比之下，未接受免疫抑制的小鼠则表现出明显的淋巴细胞浸润，提示发生排斥反应。
图1：袖状结构的制备。 使用#11刀片，（A）制备血管和支气管袖状结构，并延长袖状手柄以方便放置。（B）分别使用18 G/20 G/24 G导管用于支气管/肺静脉/肺动脉（从左至右）。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：供体手术操作。 供体手术操作包括通过阴茎静脉注射肝素（A）、插管（B）、膈肌解剖（C）以及正中胸骨切开术（D）。切除的肺组织块（E）用纱布覆盖以保持湿润（F）。肺门结构的解剖首先从供体肺动脉（G）开始，随后为肺静脉（H）。将血管通过套管腔内夹住，然后翻折覆盖于套管上，暴露内皮/上皮表面（I）。接着用10-0尼龙缝线在套管周围打两个结进行固定（J）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3受体手术操作。 受体手术步骤包括气管插管，取右侧卧位（A）以及左侧开胸术（B）。从前方观察，将受体左肺从肺门处的附着组织中松解（C）以及受体肺动脉（D)，肺静脉（E）和支气管被解剖。使用动脉瘤夹对受体肺门进行近端控制（F）。将套管化的供体肺动脉通过V形的1/3动脉切口插入受体肺动脉中（G）并通过第二个动脉瘤夹控制套管手柄以保持套管稳定，随后用10-0尼龙线打结固定（2个结）（H）。2nd 夹子被移除，随后对肺静脉采用相同的步骤进行操作（我）和支气管（J）。第1st 夹子被移除以使肺组织重新灌注（K）。肺部充气后，再放回胸腔（L). 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：移植肺的形态学与组织学特征。 将 Balb/cJ 供体的左肺移植至 C57/B6J 受体小鼠后第 7 天，接受共刺激阻断治疗的小鼠显示出完整且正常的形态结构（A）。相比之下，未接受免疫抑制治疗的小鼠则表现出排斥反应的迹象（B）。经共刺激阻断治疗小鼠的 H & E 染色显示免疫反应极轻微，提示存在免疫耐受（C）。未接受免疫抑制治疗的小鼠则出现明显的淋巴细胞浸润，表明发生了排斥反应（D）。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
小鼠左肺移植的套管技术代表了移植研究领域的一项重要进展10,11。关键步骤包括精确细致地解剖肺门结构以及可靠地完成吻合。该技术可根据实验需求进行调整，但需要一定的学习过程。我们课题组将受体小鼠的体位从俯卧位改为仰卧位，通过弯曲受体小鼠以获得更好的肺门视野，从而缩短了学习曲线。
局限性包括对超出指定体重范围的小鼠操作存在困难，以及需要具备显微外科经验的熟练外科医生。为降低移植物发生肺不张的风险，强烈建议在移植后实施呼气末正压（PEEP），并确保适当给予镇痛药物。为预防静脉撕裂，建议使用较小的套管尺寸（22 G）。此外，为避免动脉扭转，建议在制备完成后尽量减少移植物的移动，并在吻合过程中调整供体肺方向时格外小心。
尽管存在局限性，该方法的血管化途径仍优于非血管化模型，并具有更高的生理相关性。它还克服了异位气管模型的不足之处7，使其成为研究移植免疫生物学和疾病过程的理想模型。该模型的转化特性允许供体造血细胞逐渐被宿主细胞取代，有助于开展疾病与恶性病变的相关研究12。此外，该模型还能揭示肺部间质细胞的贡献，对于理解肺脏病理生理机制及开发靶向治疗策略至关重要。
总体而言，袖套技术在移植生物学、肺部疾病和免疫学研究中具有广阔的应用前景，并有望拓展至多个研究领域。研究人员应充分认识到该技术的学习曲线及其对特定研究需求的适应性。我们通过一些实用性的改进措施，例如开胸后重新调整动物体位以获得更佳的手术视野，旨在提高手术操作的效率和成功率。尽管核心技术保持不变，但这些优化措施能够显著简化操作流程，尤其是在实验条件下实现及时的肺吻合方面尤为重要。本文为提升该技术在实际应用中的操作水平提供了有价值的建议。
披露
作者声明本稿件所涉主题无任何需要披露的内容。
致谢
ASK、AEG 和 DK 由 P01 AI116501 项目资助。 ASK 和 EJ 还获得了 R01AI145108-01 和 R01HL166402 的资助。 ASK 由 I01 BX002299-05 项目资助。AEG 和 DK 还由 RO1HL09601 项目资助。 CL 由 R01 HL128492 项目资助。 本研究部分得到了 Chuck 和 Mary Meyers 以及 Richard 和 Eibhlin Henggeler 的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10-0 尼龙缝线 | Surgical Specialties Corporation, 阅读, PA | AK-0106 | |
| 2 把杜蒙特 #5 镊子 | Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA | 11251-20 | |
| 2 把哈尔斯特德-蚊式钳，弯头 | Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA | 91309-12 | |
| 6-0 编织丝线缝线 | Henry Schein 公司, 梅尔维尔, 纽约, | 100-5597 | |
| 6-0 聚对二氧环己酮 PDS II 缝线 | Ethicon 公司, 萨默维尔, 新泽西州. | Z117H | |
| 70% 乙醇 | Pharmco Products 公司, 布鲁克菲尔德, 康涅狄格州 | 111000140 | |
| 阿德森镊子 | Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA | 91127-12 | |
| Balb/c 小鼠 | Jackson 实验室, 巴港, 缅因州, 美国 | 000651 | 8–12 周龄；雄性 |
| 双极电凝器 | Valleylab 公司, 博尔德, 科罗拉多州 | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| C57BL/6 小鼠 | Jackson 实验室, 巴港, 缅因州, 美国 | 000664 | 8–12 周龄；雄性 |
| 透明氯己定 | Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, 诺克罗斯, 佐治亚州 | 57591 | |
| 电灼器 | Bovie | ||
| 精细弹簧剪（Vannas 型） | Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA | 15000-03 | |
| 哈尔西持针器 | Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA | 91201-13 | |
| 哈佛仪器小鼠呼吸机 VentElite | 哈佛仪器, 霍利斯顿, 马萨诸塞州 | 55-7040 | 设置：3L O2/分钟，呼吸频率 130 次/分钟，潮气量 0.4 cc |
| 肝素溶液 | Abraxis 制药产品公司, 肖姆堡, 伊利诺伊州 | 504031 | 100 U/mL |
| 注射级生理盐水 | Hospira 公司, 森林湖, 伊利诺伊州 | NDC 0409-4888-20 | |
| 氯胺酮 | VetOne, 博伊西, 爱达荷州 | 501072 | 50 mg/kg |
| Konig Mixter 微型儿科镊子，直角钳口 | Medline, 北菲尔德, 伊利诺伊州, | MDS1247714 | 超细，总长度 5 1/2" (14cm) |
| Medline 高温电灼器，带精细尖端 | Leica Microsystems 公司, 阿兰代尔, 新泽西州 | 10 450 290 | |
| Leica M80 F12 地面支架显微镜 | Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA | 15396-00 | |
| Moria 超细弹簧剪 | Parkland Scientific, 珊瑚泉, 佛罗里达州 | V3000i | |
| Ohio 异氟烷蒸发器 | Vitrolife 公司, 恩格尔伍德, 科罗拉多州, | 19001 | |
| Perfadex 低钾右旋糖酐葡萄糖溶液 | Becton Dickinson 实验室器皿, 弗兰克林湖, 新泽西州 | 353025 | 电解质保存液 |
| 聚苯乙烯培养皿 | Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA | 00632-11 和 00649-11 | 150 × 25 mm 和 60 × 25 mm |
| S&T SuperGrip 镊子，直头和角头 | Fine Science Tools 公司, 福斯特城, CA | 18200-20 | |
| 小型动物牵开系统 | Puritan Medical 公司, 伊利诺伊州吉尔福德 | 823-WC | 锥形迷你棉签，3 英寸涂抹器 |
| 无菌棉签 | Terumo 医疗公司, 埃尔克顿, 马里兰州 | SROX2419Z | |
| Surflo etfe 静脉导管，黄色，24 G x 0.75" | Terumo 医疗公司, 埃尔克顿, 马里兰州 | SROX1851Z | |
| Surflo etfe 静脉导管；绿色，18 G x 2" | Terumo 医疗公司, 埃尔克顿, 马里兰州 | SROX2032Z | |
| Surflo etfe 静脉导管；粉色，20 G x 1.25" | Thermocare 公司, 倾斜村, 内华达州 | ||
| ThermoCare 小型动物重症监护系统 | A to Z Vet Supply, 德累斯顿, 田纳西州 | 008679 | 10 mg/kg |
| 赛拉嗪 | Aesculap 公司, 中心谷, 宾夕法尼亚州, | FT480T | |
| Yasargil 动脉瘤夹施加器 | Aesculap 公司, 中心谷, 宾夕法尼亚州, | FT264T | |
| Yasargil 临时性动脉瘤夹 | Medline, 北菲尔德, 伊利诺伊州, | ESCT001 |
参考文献
- Trulock, E. P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-fourth official adult lung and heart-lung transplantation report-2007. J Heart Lung Transplant. 26 (8), 782-795 (2007).
- Truong, W., Emamaullee, J. A., Merani, S., Anderson, C. C., James Shapiro, A. M. Human islet function is not impaired by the sphingosine-1-phosphate receptor modulator FTY720. Am J Transplant. 7 (8), 2031-2038 (2007).
- Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9 (5), 419-438 (2008).
- Hele, D. J., Yacoub, M. H., Belvisi, M. G. The heterotopic tracheal allograft as an animal model of obliterative bronchiolitis. Respir Res. 2 (3), 169-183 (2001).
- Djamali, A., Odorico, J. S. Fas-mediated cytotoxicity is not required for rejection of murine nonvascularized heterotopic cardiac allografts. Transplantation. 66 (12), 1793-1801 (1998).
- Neuringer, I. P., et al. Epithelial kinetics in mouse heterotopic tracheal allografts. Am J Transplant. 2 (5), 410-419 (2002).
- Okazaki, M., et al. Sphingosine 1-phosphate inhibits ischemia reperfusion injury following experimental lung transplantation. Am J Transplant. 7 (4), 751-758 (2007).
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J Thorac Cardiovasc Surg. 97 (4), 578-581 (1989).
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7 (6), 1672-1679 (2007).
- Gelman, A. E., et al. CD4+ T lymphocytes are not necessary for the acute rejection of vascularized mouse lung transplants. J Immunol. 180 (7), 4754-4762 (2008).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 4 (1), 86-93 (2009).
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