利用自动化液体处理技术实现去黄化玉米叶片原生质体的高通量转基因表达研究

摘要

本方案描述了使用自动化液体处理仪创建随机转染布局的方法、黄化玉米叶片原生质体的分离方案，以及利用液体处理仪进行96孔板转染的操作流程。

摘要

近年来，植物生物技术领域取得了显著进展，彻底改变了针对多种用途对植物进行操控和改造的能力。然而，随着该领域研究的多样性和复杂性日益增加，迫切需要在早期阶段采用高效、可靠且高通量的瞬时筛选方法，以缩小后续进行稳定转化的策略范围。近年来重新受到关注的一种方法是利用植物原生质体，目前已有多种物种、组织和发育阶段的原生质体分离与转染技术。本文介绍了一种在96孔板中随机化质粒制备的简单自动化流程、一种黄化玉米叶片原生质体的分离方法，以及一种自动化转染程序。在植物生物技术中采用自动化解决方案——以这些新型液体处理原生质体转染流程为代表——相较于传统人工方法是一次重大进步。通过利用自动化技术，研究人员能够轻松克服传统方法的局限性，提高实验效率，加快科研进程。

引言

植物原生质体转染是一种将外源遗传物质导入去除细胞壁的植物细胞的技术，在过去半个世纪中，该技术已涵盖多种物种，支持了植物生物技术研究的发展。然而，即使每次分离能获得数百万个原生质体，这些方法的应用仍可能费时费力且适用范围有限。传统的植物原生质体转染方法通常操作繁琐、耗时较长、易受变异影响且技术要求高，导致其仅适用于少数特定体系，且重复性较差¹。然而，近年来自动化解决方案的出现为这项已有60年历史但仍具活力的技术带来了新的发展机遇^2,3。通过自动化实现材料准备、聚乙二醇（PEG）孵育以及后续转染试剂分配等关键但重复性高的步骤，研究人员可显著减少手动操作需求及其他潜在的人为误差来源⁴。此外，自动化液体处理系统所提供的精确控制和操作均一性，可确保转染结果的一致性和可重复性。

尽管原生质体分离是一个精细的过程，涉及切碎、消化、孵育、过滤和离心等步骤，但这些方案中的转染部分非常适合由自动化液体处理设备完成。大多数原生质体转染方案采用聚乙二醇（PEG）介导的方法，将分离得到的原生质体与PEG及纯化的质粒DNA在特定时间、精确浓度（取决于物种和组织类型）条件下混合，从而使细胞吸收质粒DNA⁵。转染后需进行一系列洗涤步骤，最终进行过夜孵....

方案

1. 转染板的制备

1. 甲板布局创建：为了创建DNA板随机化方法，打开液体处理仪软件。从菜单栏点击新建方法按钮以创建新方法。在起始行和结束行之间，通过左侧面板上的仪器设置按钮添加仪器设置行。
   注意：与本自动化方案配套的相关截图可在补充图1、补充图2和补充图3中找到。
2. 点击仪器设置行，从耗材类别菜单中找到正确的实验耗材，并将其拖放到甲板布局中，如补充图1所示。
   注意：如果该耗材此前未定义，则需根据制造商的规格将其编程至液体处理仪中，但此类操作不在本方案的范围之内。
3. 文件导入转移：在步骤调色板中点击从文件转移按钮，并将从文件转移行放置在仪器设置行下方。确保吸头选择与更换方式如补充图3所示。
4. 勾选文件包含标题行，并确认列信息正确无误。
5. 点击源区域以激活该区域，然后从甲板布局中选择源板，定义目标板，并输入需移液的....

结果

为了获得支持边缘效应可能影响响应测量结果的观测数据，开展了一项预实验以验证这些推测。在本研究中，将上述方法应用于三个仅含单一处理水平的96孔板重复实验。所有原生质体均转染pSYN11250¹⁹质粒，该质粒组成型表达ZsGreen，旨在揭示位于孔板边缘区域的单元与第二圈及中心区域相比，其响应水平是否存在系统性差异。孔板最外圈的36个孔定义为区组1，从外缘向内第二圈的28个孔定义为区组2，中心区域的32个孔定义为区组3——见图2A右下角面板。该布局可容纳28个处理水平，作为随机完全区组设计（RCBD），或容纳32个处理水平，作为随机不完全区组设计（RIBD）。在图2A中，针对每个重复（rep），各孔的原始数据点均以该孔板自身的均值进行归一化处理。在实验的三个重复中，孔板边缘区域的响应值平均比最小值高出1-1.5倍。图2B展示了每个重复中各区组均值相对于整个孔板均值的百分比。表2列出了.......

讨论

本文描述了一种利用自动化转染系统实现转染板制备及去黄化玉米叶片原生质体分离的实验方案。为顺利完成本方案中的转染板制备步骤，需使用配备八通道移液模块的自动化液体处理机器人。对于转染实验步骤， 建议使用96孔板适配器，以实现对96孔板的完全且均匀的转染。虽然也可使用8通道适配器完成转染操作，但需特别注意吸液和加液步骤所需的时间，以及在各列之间更换吸头所耗费的时间。已有充分文献证实，聚乙二醇（PEG）孵育时间的差异会显著影响转染效率和蛋白表达水平，因此必须特别关注这些影响因素，以避免样品处理过程中出现不一致性。¹³在启动液体处理仪程序之前，有必要仔细考虑程序的各个步骤，以及某些操作是否可以同时进行。本程序使用一种设备，该设备从甲板上的一个位置为96孔板加载吸头。本程序所用的液体处理仪具备一项功能，即机器人可在孵育期或用户暂停步骤期间更换吸头盒，从而避免为程序增加额外时间。在决定购买液体处理仪时，应充分考虑其功能以及可能带来的时间节省便利性。

尽管本实验方案最初是为使用Beckman Coulter NXp和Biomek FX设备而.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(2)β-巯基乙醇	Sigma	M6250
2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物	Sigma	69892
50 mL 带平盖离心管，无菌	Fisher	22-010-064
96孔光学平底黑色聚合物底板，带盖，细胞培养级，无菌，聚苯乙烯，每孔0.4 mL	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX 机器人吸头，非无菌，宽孔	Fisher	14-222-096
Axygen 机器人用 30 μL 带滤芯吸头，无菌，带架	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion 圆形真空干燥器	Fisher	08-648-10
Bemis 2 英寸 × 250 英尺卷装实验室用Parafilm	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	贝克曼库尔特	902508
二水合氯化钙	Sigma	C5080
Chemglass生命科学一次性血细胞计数板	Fisher	50-131-1352
Clorox 杀菌漂白剂，浓缩型	Fisher	NC1871274
康宁微孔板铝封膜	Fisher	07-200-684
Corning 96 孔检测板，2 mL，96 孔标准板	Fisher	07-200-701
DL-二硫苏糖醇（DTT）	Sigma	10197777001
D-甘露醇	Sigma	M9546
Fisherbrand 60 mL 塑料注射器	Fisher	14-955-461
Fisherbrand 无菌细胞筛，40 μm	Fisher	22-363-547
Fisherbrand 培养皿，透明盖，可叠放，100 mm × 25 mm，每箱325个	Fisher	FB0875711
六水合氯化镁	Sigma	M2670
Millex 注射器驱动滤器，无菌，33 mm，PES，0.22 μm	Fisher	SLGPR33RS
无菌一次性针筒式滤器，33 mm，PVDF，孔径0.45 μm	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip 无菌一次性真空滤器 50 mL PES	Fisher	SCGP00525
聚乙二醇 4000	Sigma	81240
Redi-Earth 育苗块 &和幼苗培养基	Wyatt Quarles	GP92747
常规单刃剃须刀片 钢制背板 0.009英寸半径	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
氯化钠	Sigma	S7653
托盘插件 - 36 孔 - 6×6 嵌套式	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 真空泵，100-120 V，50/60 Hz，美标插头	VWR	97058-164