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使用智能Leginon实现跨多个载网的冷冻电子显微镜筛选自动化

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DOI：

10.3791/66007

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2023年12月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Simons Electron Microscopy Center, New York Structural Biology Center, 2Herbert Wertheim UF Scripps Institute for Biomedical Innovation & Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

冷冻电子显微镜（cryoEM）多网格筛选通常是一个繁琐的过程，需要耗费数小时的注意力。本方案展示了如何设置标准的Leginon数据采集以及Smart Leginon Autoscreen，以实现该过程的自动化。该方案可适用于大多数cryoEM载网样品。

摘要

过去十年中，冷冻电子显微镜（cryoEM）技术的进步使结构生物学家能够常规地以接近原子级分辨率解析大分子蛋白质复合物的结构。整个cryoEM流程的通用工作流程包括在样品制备、cryoEM载网制备和样品/载网筛选之间反复迭代，然后进入高分辨率数据采集阶段。样品/载网制备与筛选之间的反复迭代通常是研究人员面临的主要瓶颈，因为每一次迭代实验都必须优化样品浓度、缓冲液条件、载网材料、载网孔径、冰层厚度以及蛋白质颗粒在冰中的行为等多种变量。此外，即使这些变量已得到满意确定，在相同条件下制备的载网在是否适合数据采集方面仍存在显著差异，因此建议在选择用于高分辨率数据采集的最佳载网之前进行额外的筛选。这一样品/载网制备与筛选过程通常会消耗数十个载网以及操作人员在显微镜上数天的工作时间。此外，筛选过程还受限于操作人员/显微镜的可用性及显微镜的可及性。本文中，我们将演示如何使用Leginon和Smart Leginon Autoscreen来自动化完成cryoEM载网筛选的大部分工作。Autoscreen结合了机器学习、计算机视觉算法和显微镜操作算法，消除了对持续人工操作输入的需求。Autoscreen可通过自动化的样品交换盒系统，自主加载并以多尺度成像方式对载网进行成像，从而实现对整盒载网的无人值守筛选。结果表明，使用Autoscreen对12个载网进行筛选的操作时间可缩短至约10分钟，而此前的方法由于无法应对载网间高度变异的问题，所需时间约为6小时。本实验方案首先介绍Leginon的基本设置与功能，然后逐步演示Autoscreen的功能，从模板会话的创建到完成12个载网的自动化筛选会话为止。

引言

单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）可实现对纯化的生物大分子复合物进行近原子分辨率的结构解析。一次单颗粒cryoEM实验通常只需从大量具有不同样品和载网条件的载网中，挑选出一至两个经过充分优化的载网即可。为了评估这些载网，需要在显微镜下对每个载网在多个放大倍数下成像，以判断其是否满足高分辨率数据收集的关键要求，包括冰层厚度、足够用于完整数据采集的区域、蛋白质纯度、蛋白质浓度、蛋白质稳定性以及取向偏好最小化等问题1。针对这些关键要求的优化，通常需要在显微镜筛选与样品制备条件（如蛋白质表达、缓冲液选择、潜在去垢剂的使用以及载网类型）之间进行反复反馈与调整2,3,4（图1）。传统的载网筛选通常通过手动或半自动软件（如Leginon5、SerialEM6和EPU7）完成。这种传统方法要求操作人员在显微镜前耗费数小时完成多个载网的筛查，导致操作者被大量重复性操作占据，严重制约了高分辨率单颗粒分析流程的效率。

此前，已介绍过 Smart Leginon Autoscreen 及其底层机器学习软件 Ptolemy，并描述了其基本方法、算法及示例8,9。目前已有多个软件包具备或正在开发实现全自动多载网筛选的能力10，其中包括 SmartScope11、Smart EPU12 和 CryoRL13,14。为解决筛选过程中的瓶颈问题，Smart Leginon 允许用户首先在模板显微镜会话中设置筛选参数，然后将该模板会话的参数作为标准，用于对显微镜自动进样器中的整盒载网进行筛选。该方法消除了载网筛选过程中的所有手动操作，从而显著提高了优化反馈循环的效率。

本方案详细描述了完整的 Smart Leginon Autoscreen 工作流程，使读者能够独立进行全自动多网格冷冻电镜筛选。对于初次使用 Leginon 的用户，方案的第一部分介绍了传统的 Leginon 操作方法。这部分知识汇集了在多台自动进样显微镜上积累的多年经验，并在此基础上进一步构建了后续的 Smart Leginon 部分内容。更多教学视频可访问 https://memc.nysbc.org 获取。

方案

遵循本方案（如图2所示）时，需在显微镜计算机及另一台Linux工作站上安装Leginon 3.6+，并在Linux工作站上安装Ptolemy。本方案经过多年发展，已在Thermo Fisher Scientific（TFS）Glacios和Krios显微镜上进行验证。本方案假设读者已配置Leginon、Appion15、相关数据库、显微镜校准参数，已在显微镜上完成直接对中，并已设置两个Leginon应用程序：一个用于标准单颗粒数据采集，另一个用于结合Ptolemy的单颗粒数据采集。Leginon的配置信息请参见： https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual。在Leginon中配置Ptolemy的信息请参见：https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening。Leginon可从http://leginon.org下载，Ptolemy可从https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy下载。Leginon遵循Apache许可证第2.0版，Ptolemy遵循CC BY-NC 4.0许可证。

1. Leginon 使用方法

  1. 启动 Leginon
    1. 在显微镜的 Windows 计算机上，关闭所有 Leginon 客户端，然后重新打开。在 Linux 工作站中，打开一个终端窗口并输入 start-leginon.py 或系统相应的 别名 用于启动 Leginon。
    2. 在新的 Leginon 设置 窗口，选择 创建新会话 并点击 下一步.
    3. 从下拉列表中选择项目，然后单击 下一步.
    4. 留下 名称 如前所述，选择适用于显微镜装置的正确支架，然后单击 下一步.
    5. 在描述栏中输入相关信息，例如显微镜名称、网格/样本描述和实验描述，然后点击 下一步.
    6. 对于图像目录，请确保已选择适当的文件系统，并且完整路径适合用于保存图像，然后单击 下一步.
    7. 下方 连接到客户端，点击 编辑在下拉菜单中，选择所有需要连接的计算机，然后依次单击每个计算机旁边的 + 按钮，再单击 好的 和 下一步.
    8. 输入正确的 C2 光阑尺寸，然后单击 下一步。该值可在 孔径 TFS TUI 软件的标签页
  2. Leginon 界面
    1. 选择 应用 从工具栏中选择并点击 运行.
    2. 从下拉菜单中选择正确的应用程序（点击 显示全部 如有必要）。设置 主要 连接到 Leginon 计算机 显微镜与摄像头 到相应的计算机，然后单击 运行主 Leginon 窗口的左侧将显示节点。
      注意：左侧面板显示所有 Leginon 节点。绿色相机图标节点是将被保存的图像： 网格，方形，孔洞 和 暴露具有目标标记的节点是用于定位高倍图像的低倍图像。紫色相机节点是用于程序设定以寻找等中心z轴高度和等中心焦点的节点。此外，还包括用于对零损失峰进行校准、监测缓冲循环、监测液氮填充、采集增益校正图像、计算冰层厚度（IceT）以及通过样品台移动和图像偏移在不同放大倍数下导航载网的节点。
    3. 预设管理器
      1. 点击 预设管理器节点在该节点中，点击底部的图标 导入预设 或上方的图标 从显微镜的当前状态创建一个新预设.
      2. 如果点击底部图标，将 导入预设 窗口将打开。选择正确的透射电子显微镜（TEM）和数码相机，然后单击 查找 并选择具有所需预设的最近会话。选中所有需要的预设，然后点击 导入，然后点击 完成.
        注意：预设管理器节点现在应列出所有已导入和创建的预设。建议为多种放大倍数和聚焦模式设置预设，包括 gr：网格放大倍数、sq：方格放大倍数、hln：孔洞放大倍数、fan：自动聚焦、fcn：中心聚焦、enn：曝光放大倍数（尾部的“n”表示纳米探针）。每种放大倍数的典型预设参数如下所示 表1，表2，以及 表3请注意，本方案中 Glacios 使用 C2 光阑尺寸为 70 µm，配备 Selectris X 和 Falcon 4i 的 Krios 使用 50 µm，配备 BioQuantum 和 K3 的 Krios 使用 100 µm。
    4. 导航与齐焦高度
      1. 熟悉通过 Leginon 控制显微镜并设置载网的 z 高度，请前往 导航节点，选择 gr 预设在顶部，然后点击 红色箭头 向右滑动以将预设设置发送到显微镜。显微镜应在1-2秒后更新。更新完成后，单击 相机按钮 向右移动以获取图像。
      2. 使用光标工具，选择一个网格方格以确定载物台移动的位置。单击 sq 放大倍数，然后 红色箭头 发送至显微镜，然后单击 相机按钮 获取图像。
      3. 前往 Z轴聚焦节点 并点击 模拟靶标 按钮顶部靠近中间位置的按钮。在采集图像以进行倾斜聚焦时，切换到 相关性视图 并观察峰位，确保其位于相关图像的角落。聚焦完成后，确保载物台设置为网格的 z 高度。
    5. 像差校正
      注意：本小节假设已进行直接比对，但尚未进行彗差校正。
      1. 导航至能产生清晰萨恩环的网格区域，例如碳基底。
        注意：若在金网格上进行样品收集，可使用交叉网格。
      2. 在 束流倾斜图像设置，确保 预设顺序 仅包括 fcn 以四个倾斜方向，每个方向倾斜角为0.005弧度。
      3. 点击 模拟目标 创建泽姆林图。点击 Tableau 在主窗口左侧点击以查看数据图表。
      4. 通过比较左右傅里叶变换图像以及上下傅里叶变换图像，校正彗差。若成对图像不完全一致，首先点击图像调节选项右侧的光标图标，然后在 Tableau 图像中偏离中心的位置沿差异方向轻微点击，并等待采集一组新的傅里叶变换图像。重复此过程，直至傅里叶变换图像完全对称一致。
        注意：每次点击 Tableau 需要数秒时间完成，此期间请勿进行其他点击操作。
    6. 获得参考文献
      注意：如果相机具有自动硬件参考功能，请跳过本部分。
      1. 在 导航节点，发送一个低倍率预设，例如 gr，并移动到一个对光路无遮挡的区域。
      2. 确认载物台位置未被光路遮挡，方法是使用中等放大倍率拍摄一幅图像 sq 或 hln 预设
      3. 发送高倍镜图像 enn 预设至显微镜。
      4. 在 校正节点设置，选择合适的 仪器 信息并设置 相机设置 以匹配采集设置。
      5. 通过关闭显微镜的柱阀来采集暗参考图像，然后在 校正节点，选择 暗 和 双通道 从顶部的下拉菜单中选择并点击 获取 相机按钮位于右侧。
      6. 完成后，选择 明亮 从下拉菜单中选择并点击 获取Leginon 将自动打开柱阀。
      7. 检查增益是否已正确采集，方法是选择 已校正 从下拉菜单中点击 获取，观察所得图像。
    7. 冰层厚度参考图像
      1. 如果显微镜配有能量过滤器，则在 IceT 节点设置，勾选采集冰层厚度图像，输入 395 对于 平均自由程，并填写设置中的其余数值。
      2. 如果显微镜没有能量过滤器，那么在 导航节点，发送 enn 预设显微镜并点击 获取. 记录下 平均值 左侧的像素值。在 IceT 节点设置，勾选“根据孔径限制散射计算冰层厚度”，输入 1055 对于 ALS系数 以及测得的平均像素值。
        注意：395 和 1055 这两个数值分别为 TFS Krios 和 Glacios 的测定结果，具体测定方法见前文所述16，并且可能需要针对不同的显微镜配置重新校准。
    8. 图像剂量校准
      1. 在 预设管理器，选择 enn 预设并点击 相机按钮（获取所选预设的剂量图像。检查底部显示的测量剂量，若接近预期值（通常在30至70之间），则点击 是.
    9. 预设比对
      1. 在 预设管理器，检查所有高倍放大预设enn, fcn，以及 风扇) 以确保图像偏移和电子束偏移均为 0, 0。
      2. 在显微镜连接的计算机上 导航 碳区域
      3. 在Leginon计算机上 导航节点，获取 一张带有 gr 预设
      4. 找到感兴趣的物体，并使用以下方法前往该位置 光标工具.
      5. 获取 一幅带有 hln 预设并使用该感兴趣对象的唯一部分重新定位至中心 光标工具.
      6. 获取 一张带有 enn 预设并使用光标工具将其重新定位到目标物体的同一独特部位。
      7. 选择 图像偏移 从下拉菜单中 获取 使用 hln 预设的图像。将目标重新定位至感兴趣物体的同一独特部位 光标工具.
      8. 在 预设管理器，选择 hln 预设，点击 s设置按钮，并从 导航 通过点击 左侧绿色箭头 旁边的 图像偏移 值。
      9. 重复步骤 2.9.7 和 2.9.8 对于 sq 和 gr 预设
    10. 网格图谱
      1. 在显微镜计算机上，关闭 柱阀 和 收回 目标孔径。转至 网格定位节点在设置中更改网格的标签。选择所需图谱的半径（最大半径为 0.0009 m）。点击 好的然后点击 计算图谱 计算器按钮位于顶部，然后单击 绿色播放按钮（“提交靶点”）.
      2. 在 方形_靶向节点，将采集网格图像并拼接成一幅图谱。使用鼠标滚轮进行缩放 下拉菜单 并调整对比度和亮度。使用 滚动条 在整个网格中移动。
      3. 一旦图谱收集完成， 插入 根据需要调整物镜光阑。
      4. 如果显微镜配有能量过滤器，选择一个 参照靶标 在破碎正方形的中心处按下 播放按钮，然后在下一小节中继续进行ZLP校准。否则，跳过ZLP校准步骤。
    11. ZLP 对准
      1. 在 Align_ZLP 节点设置，选择 阶段位置n 用于移动参考目标并进行选择 预设管理器 作为移动者。取消选择 旁路调节器，然后按压 好的.
        ​注意：现在应配置ZLP对齐，使显微镜定期移动至参考目标并执行相机的ZLP对齐程序。对于Gatan BioQuantum和TFS Selectris X能量滤波器，ZLP重新对齐的时间通常分别设置为30分钟和60分钟较为安全。这些数值会因能量滤波器的环境条件而异，包括湿度稳定性、温度稳定性、电磁场屏蔽以及振动隔离。
    12. 靶向定位孔模板设置
      1. 在 方形_靶向节点，选择多个 采集 靶点，然后按 播放.
      2. 在 孔位定位节点设置，确保 允许用户验证选定的靶标 和 排列目标 是 已检查。此外， 跳过自动孔洞查找 目前。点击 应用，然后 好的.
      3. 在主窗口中，使用 Ctrl-Shift-右键单击 以移除所有目标。选择 采集光标 并放置目标。选择 聚焦光标 在采集目标之间放置一个对焦目标。点击 播放.
      4. 接下来 孔位定位 图像，取消选中该复选框 跳过自动孔洞查找 在设置中，然后单击 应用 和 好的. 移除自动目标 Ctrl-Shift-右键单击.
      5. 选择 标尺工具 并测量孔的直径。在 模板设置，更换 最终模板直径 测量得到的孔径。不要更改 原始模板直径. 点击 测试如果每个孔的中心没有明亮的光点，则增加 最终模板直径完成后，单击 好的.
      6. 在 阈值设置，选择一个值 A 能够对各个孔洞进行单独分割 测试 被点击。单击 好的 当满意时。
      7. 在 斑点设置，输入数值并点击 测试最大斑点数为1，因此仅显示一个斑点。点击 好的.
      8. 在 晶格设置，使用 标尺工具 测量两个孔之间的距离（中心到中心）。输入该数值于 间距 并单击 测试一个斑点将变为一个晶格点。单击 好的.
      9. 前往 采集参数，并利用冰层厚度阈值优化采集目标 测试目标按钮将光标悬停在晶格点上以获取冰层厚度信息。
      10. 如果采集目标不理想，请使用 标尺工具 测量晶格点到目标采集位置之间的距离和角度。删除之前的 采集目标模板 点。单击 自动填充，放入 4 根据目标数量，将半径和角度调整为测得的数值。点击 好的. 选中“在模板卷积后的采集目标上应用冰层厚度阈值”。
      11. 当对晶格点和冰层厚度阈值满意后，点击 提交靶点 按钮
      12. 根据需要重复上述任一步骤 针对每个选定的方格，提交整个队列 提交排队目标按钮 所有方形目标提交后。
      13. Leginon 将开始对每组目标进行聚焦和成像。在 Z轴聚焦节点，确保正确找到正中高度。
    13. 曝光模板定位设置
      1. 在 暴露靶向节点，将出现孔的放大图像。使用 Ctrl-Shift-右键单击 以移除自动目标。
      2. 使用以下方法测量孔的直径 标尺工具. 在 模板设置，将直径输入到 最终模板直径 并单击 测试每个孔的中心现在应出现一个峰。调整 直径 必要时调整数值。
      3. 在 阈值设置，调节 A 阈值调整至二值化测试图像仅在孔洞位置显示白色区域为止。
      4. 在 斑点设置，点击 测试每个分割孔中应出现一个斑点。增加 边界 如有需要，可去除图像边缘的斑点。
      5. 在 晶格设置，点击 测试调整参数，直至所有斑点均变为晶格点。单击 好的.
      6. 点击 标尺工具 并测量两个晶格点之间的距离。在 晶格设置，更换 间距 该距离。
      7. 将鼠标悬停在每个晶格点上，可查看平均强度、平均厚度、强度标准差和厚度标准差。记录每个晶格点的强度值，并利用这些数值设定所需的冰层厚度参数 采集参数.
      8. 测量一个晶格点到4个孔中心的距离和角度 标尺工具. 在 采集参数设置，删除当前的焦点目标。单击 自动填充，然后将半径和角度更改为测得的数值。点击 测试靶向，点击 好的，然后单击 提交靶点.
        注意：Leginon 将会找到等心聚焦点（eucentric focus）焦点节点）并采集曝光图像，这些图像将显示在 暴露节点.
      9. 所有目标成像完成后，前往 曝光靶向节点 查看下一个孔的图像。在 设置中，取消勾选“允许用户验证所选目标”。此外，取消勾选 排列目标 和 跳过自动孔洞查找. 点击 好的 并点击 提交靶点.
        注意：Leginon 将根据上述配置的设置自动采集图像。请在 Appion 中查看图像和元数据。
    14. 在自动采集过程中可进行调整。例如，随时通过编辑来更改采集的离焦范围 enn 预设在 预设管理器.
    15. 如果需要停止采集，请通过点击结束队列 中止 和 中止队列 孔洞和曝光节点中的按钮。
    16. 收集完成后，前往 应用 并点击 杀死，然后前往 文件 并点击 退出.

2. Smart Leginon Autoscreen 的使用

  1. 创建一个 Smart Leginon 模板会话
    1. 按照第 1 节中的说明启动 Leginon。
    2. 转到 Application 并点击 Run。在 Run Application 窗口中，选择 Ptolemy Application（如有必要，请选择 Show All）。将 main 设置为 Leginon 计算机，将 scope and camera 设置为相应的计算机。
    3. 在 Preset_Manager 中，按照步骤 1.2.3 的说明 import 预设。
    4. 配置节点设置。
      1. 在 Square_Targeting 节点设置中，确保勾选 Sort targets by shortest path 和 Enable auto targeting （补充图 1A）。
      2. 在 Square 节点设置中，确保勾选 Wait for node to process the image。如果右侧列表中尚未包含 Square 预设，请从下拉菜单中添加。在 高级设置中，勾选 set these apertures while imaging ，并确保两个光阑的数值正确（补充图 1B）。
      3. 在 Hole_Targeting 节点设置中，勾选 Allow for user verification of selected targets，取消勾选 Queue up targets 和 Skip automated hole finder （补充图 2A）。
      4. 在 Hole 节点设置中，勾选 Wait for a node to process the image，并确保右侧列表中包含 Hole 预设。在 高级设置中，勾选 set these apertures while imaging，并确保两个光阑的数值正确（补充图 2B）。
      5. 在 Exposure_Targeting 节点设置中，勾选 Allow for user verification of selected targets，取消勾选 Queue up targets 和 Skip automated hole finder （补充图 3A）。
      6. 在 Exposure 节点设置中，确保 Wait for a node to process the image 未被勾选，右侧列表中包含 Exposure 预设，并在 高级设置中勾选 set these apertures while imaging，同时确保两个光阑的数值正确（补充图 3B）。
      7. 在 Focus 节点设置中，确保 Wait for a node to process the image 未被勾选，右侧列表中包含 Auto-focusing 预设，并将 Desired autofocus accuracy 设置为 4 × 10-6 m（补充图 4A）。
      8. 在 Focus 节点 Focus Sequence（位于设置按钮旁），仅启用两个 Beam Tilt Auto-focusing 步骤（补充图 4B,C）。
      9. 在 Z_Focus 节点设置中，确保 Wait for a node to process the image 未被勾选，右侧列表中包含 Hole 预设，并将 Desired autofocus accuracy 设置为 5 × 10-5 m（补充图 5A）。
      10. 在 Z_Focus 节点 Focus Sequence中，仅启用两个 low-magnification Stage Tilt 步骤（补充图 5B,C）。
    5. 按照步骤 1.2.4 所述确定载网的 z 高度。
    6. 按照步骤 1.2.10 所述采集一张图谱（atlas）。
    7. 设置方格查找参数。
      1. 图谱采集完成后，Ptolemy 将在 Square_Targeting 节点中定位方格。每个方格将显示一个蓝色圆圈，称为斑点（blob）。当鼠标悬停在每个斑点上时，Leginon 将报告 Ptolemy 计算出的其尺寸大小。记录下最大和最小的斑点尺寸。
      2. 在 Thresholded 设置中，调整 Filter Range 的最小值和最大值，以包含理想的方格并排除不理想的方格。
      3. 点击顶部工具栏中的 Find Squares 按钮。调整 Filter Range，直到 Find Squares 能良好地定位目标。
      4. 在 acquisition 设置中，为 Max. number of targets 和 Number of target group to sample 选择合适的数值。这些参数将定义将要定位的方格数量及方格组数量。
      5. 当对参数满意后，点击 Play 按钮。补充图 6 展示了设置完成后的一个图谱示例。
    8. 设置孔洞查找参数。
      1. 在 Hole_Targeting 节点中，使用 ruler tool 测量一个孔洞的直径。
      2. 在 Template 设置中，将测得的直径输入 Final Template Diameter ，然后点击 Test。调整直径，直到所有孔洞中心均呈现明亮的白色峰值。
      3. 在 Threshold 设置中，点击 Test。调整 A 值，直到二值化图像中仅在孔洞位置显示白色区域。
      4. 在 Blobs 设置中，通过使用标尺确定距边缘的最小距离并输入该值，选择排除 Border 目标。斑点可根据其大小、圆度和所需数量进行筛选。将鼠标悬停在斑点上可查看其数值。点击 Test 以检查当前数值。
      5. 在 Lattice 设置中，输入孔洞半径及孔洞间距（使用测量工具），然后点击 42 按钮，测量真空区域（空孔或破损支撑膜）的 Reference Intensity 值。
      6. 在 acquisition 设置中，勾选 Use subset of the acquisition targets ，并将 Sample Maximal 值设为较小数值（例如 2）。设置较宽范围的冰层厚度均值和标准差（通过将鼠标悬停在目标上测量这些值）。点击 Test targeting，根据上述数值随机选择目标。
      7. 当对所有设置满意后，点击 Play 按钮。Leginon 将执行载物台 Z_Focus 并采集第一个目标。补充图 7 展示了设置完成后的一个图像示例。
    9. 设置曝光定位参数。
      1. 在 Hole 设置中，将 Shell Script 设置为 Ptolemy 安装目录下的 hl_finding.sh 脚本路径。将接受的最小分数设为 ≤0。输入孔洞半径（使用测量工具），然后点击 42 按钮 测量真空区域（空孔或破损支撑膜）的 Reference Intensity 值。点击 Test 以查找孔洞晶格。
      2. 在 acquisition 设置中，勾选 Use subset of the acquisition targets，并将 Sample Maximal 值设为较小数值（例如 4），以便对部分孔洞进行筛选采集。设置较宽范围的冰层厚度均值和标准差（通过将鼠标悬停在目标上测量这些值）。
      3. 当对所有设置满意后，点击 Play 按钮。Leginon 将执行对中聚焦（eucentric Focus）并采集高倍图像，这些图像可在 Exposure 节点中查看。补充图 8 展示了设置完成后的一个图像示例。
    10. 检查下一个 Exposure_Targeting 图像，确认上述设置是否仍然合适。当确认无误后，在 Exposure Targeting 和 Hole Targeting 设置中取消勾选 Allow for user verification of selected targets。
      注：当前载网的筛选现在应无人值守运行。此会话将作为所有载网的模板会话。
  2. 当载网完成筛选后，点击 File > Exit 以关闭 Leginon。
  3. 设置 Smart Leginon Autoscreen
    1. 在终端窗口中，执行 Smart Leginon's autoscreen.py。
    2. 选择 gui，输入以逗号分隔的待筛选载网槽位列表，input full 作为工作流程，input 用于新建会话的模板会话名称（可在 Appion imageviewer 中找到），并 input 该模板会话的 z 高度值（补充图 9）。
    3. 将打开一个图形界面，允许用户为每个载网 input 会话名称，并 select 其相应的项目关联（补充图 10）。
      注：Smart Leginon Autoscreen 现在将使用模板会话设置，自动筛选每个载网，并在无人值守的情况下自动切换载网。
    4. 可在 Leginon、Appion 和显微镜计算机上监控采集过程，也可完全无人值守。
      注：当所有载网筛选完成后，Smart Leginon 将关闭显微镜的镜筒阀门。

结果

根据该方案，大多数（80%-90%）带孔载网及条件下的冷冻电镜筛选实验可实现自动且成功的运行。此前已有多个示例和实验8,9展示了Smart Leginon Autoscreen成功运行时的预期结果。一次成功的Autoscreen运行通常以约10分钟的初始化设置开始，随后在约6小时（每张载网30分钟）内自动完成一个盒装12张载网的全部筛选，每张载网中3-5个不同大小的方格、每个方格内3-5个孔洞均以高倍率成像，使用户能够快速判断每张载网上的样品特性，并迅速优化样品与载网的条件（图3）。然而，偶尔也会出现筛选失败的情况，常见原因包括Autoscreen定位到了破损的方格、未能正确识别载网或方格间较大的冰层厚度梯度，或在碳膜载网上无法正确识别孔洞。此外，潜在的内存泄漏可能导致Leginon因内存占用过高而崩溃，可通过释放内存、重启计算机，或为计算机增加更多内存来解决或缓解该问题。

电子显微镜工作流程示意图：模板会话设置、校准、自动筛选过程。
图1：Smart Leginon Autoscreen 工作流程。 Smart Leginon Autoscreen 工作流程的高级概述。首先，通过为待筛选样品网格批次中的代表性网格选择参数，创建模板会话。设置 Leginon 并创建模板会话所需时间少于 45 分钟。其次，配置 Autoscreen 以使用模板会话的参数对盒中所有网格进行筛选，此过程耗时少于 10 分钟。最后，Autoscreen 结束筛选会话。请点击此处查看该图的放大版本。

显示从样品制备到高分辨率成像的工作流程图；突出显示过程瓶颈。
图 2：自动化筛选前的传统单颗粒冷冻电镜流程。 自动化筛选前传统单颗粒冷冻电镜流程中最常见的步骤，以及可改进的环节。各步骤的颜色反映了其相对于其他步骤成为瓶颈的程度。蓝色圆形箭头表示大多数步骤之间存在的多个反馈循环。多个步骤的通量在很大程度上取决于样品、经费以及研究人员所在地区。 请点击此处查看本图的放大版本。

冷冻电镜载网制备；示意图比较冰层厚度和颗粒分布；显微镜分析。
图3：Smart Leginon Autoscreen 的代表性结果。 采用 TFS Krios 冷冻透射电镜（配备 BioQuantum 能量过滤器和 K3 相机）按照 Smart Leginon Autoscreen 方案采集的多尺度图像。(A) 一张复合的“图谱”图像，展示冷冻电镜载网的整体情况。(B-F) 载网图谱中指定位置的多尺度图像。第一行为低倍图像，第二行为中倍图像，第三行为高倍图像，均由系统自动选取，以获取从薄冰到厚冰区域的样品信息。Leginon 估算的冰层厚度显示在底部。标尺在 (A) 中为 500 µm，在 (B-F) 中分别为第一行 10 µm、第二行 5 µm、第三行 100 nm。本图经 Cheng 等人8 许可修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

gr：网格 方：Square hln：孔 风扇：自动对焦 fcn：中枢焦点 暴露 
放大倍数 210 2600 6700 120000 120000 120000 
离焦 -0.0002 -0.00015 -0.00015 -2 × 10-06 -7 × 10-07 -2.5 × 10-06 
斑点大小 5 5 4 2 2 2 
强度 1.1 0.83 0.65 0.44 0.44 0.45 
维度 1024 x 1024 1024 x 1024 1024 x 1024 1024 x 1024 1024 x 1024 4096 x 4096 
偏移量 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 512, 512 0, 0 
分箱 4 x 4 4 x 4 4 × 4 4 × 4 2 x 2 1 × 1 
曝光时间（ms） 200 500 500 500 500 1000 
暴露前（s） 0 0 0 0 0 0 
剂量（e/Å2) -- -- -- 36.5 36.5 64.7 
保存原始帧 无 无 无 无 无 是 

表1：使用Glacios cryoTEM配备Falcon 3EC相机在中国科学院西蒙斯电子显微镜中心（SEMC）进行冷冻电镜载网筛选的预设参数。 列出了SEMC在Glacios cryoTEM配备Falcon 3EC相机上常用各预设模式的参数。不同显微镜可提供的放大倍数可能不同，不同实验也会采用如离焦量和曝光时间等不同的参数。

gr：网格 平方：Square hln：孔 风扇：自动对焦 fcn：中央焦点 暴露 
放大倍数 64 1700 2850 75000 75000 75000 
离焦 0 -5 × 10-05 -5 × 10-05 -1 × 10-06 -7 × 10-07 -2 × 10-06 
光斑尺寸 6 9 9 6 6 7 
强度 0.001 1.65 × 10-05 1.5 × 10-05 4.3 × 10-07 4.3 × 10-07 5.5 × 10-07 
能量滤波宽度 -- -- -- 20 20 20 
维度 1024 x 1024 1024 x 1024 1024 x 1024 1024 x 1024 2048 x 2048 4096 x 4096 
偏移量 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 
分箱 4 × 4 4 × 4 4 × 4 4 × 4 2 x 2 1 × 1 
曝光时间（ms） 500 2000 1000 500 300 8700 
暴露前 (s) 0 0 0 0 0 0 
剂量（e/Å2) -- -- -- -- -- 47.4 
保存原始帧 无 无 无 无 无 是 

表2：使用配备Selectris X和Falcon 4i相机的Krios冷冻透射电镜在SEMC进行冷冻电镜载网筛选的预设参数。 显示了在SEMC使用配备Selectris X能量过滤器和Falcon 4i相机的Krios冷冻透射电镜时常用各预设的参数。不同显微镜可提供的放大倍数不同，不同实验也会采用如离焦量和曝光时间等不同的参数。

gr：网格 平方：Square hln：孔 风扇：自动对焦 fcn：中央焦点 暴露 
放大倍数 1550 940 2250 81000 81000 81000 
离焦 0 -5 × 10-05 -5 × 10-05 -1 × 10-06 -7 × 10-07 -2 × 10-06 
斑点大小 4 8 7 6 6 6 
强度 0.0015 0.00017 7.3 x 10-05 1.3 × 10-06 1.3 × 10-06 9.2 × 10-07 
能量滤波宽度 -- -- 50 20 20 20 
维度 1024 x 1024 1440 x 1024 1440 x 1024 1440 x 1024 1008 x 1008 5760 x 4092 
偏移量 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 936, 519 0, 0 
分箱 4 × 4 8 x 8 8 x 8 8 x 8 4 × 4 2 x 2 
曝光时间（ms） 250 600 600 500 500 2100 
暴露前 (s) 0 0 0 0 0 0 
剂量（e/Å）2) -- -- -- -- -- 51 
保存原始帧 无 无 无 无 无 是 

表3：使用配备BioQuantum能量过滤器和K3相机的Krios冷冻透射电镜在SEMC进行冷冻电镜载网筛选的预设参数。 列出了在SEMC使用配备BioQuantum能量过滤器和K3相机的Krios冷冻透射电镜时常用各预设的参数。不同显微镜可提供的放大倍数各不相同，不同实验也会采用如离焦量和曝光时间等不同的参数。

补充图1：Smart Leginon的方形定位设置和方形设置。（A）方形定位设置。（B）方形设置。请点击此处下载该文件。

补充图2：Smart Leginon的孔定位设置和孔设置。（A）孔定位设置。（B）孔设置。请点击此处下载该文件。

补充图3：Smart Leginon的曝光定位设置和曝光设置。（A）曝光定位设置。（B）曝光设置。请点击此处下载该文件。

补充图4：Smart Leginon的对焦设置与对焦序列设置。（A）对焦设置。（B）对焦序列设置（Defocus1）。（C）对焦序列设置（Defocus2）。请点击此处下载该文件。

补充图 5：Smart Leginon 的 Z_Focus 设置和 Z_Focus 序列设置。(A) Z_Focus 设置。(B) Z_Focus 序列设置（Stage_Tilt_Rough）。(C) Z_Focus 序列设置（Stage_Tilt_Fine）。请点击此处下载该文件。

补充图6：设置Smart Leginon Square_Targeting参数后的示例图谱。 蓝色圆圈代表斑点，绿色加号代表采集位置，棕色的“x”表示当前载物台位置。请点击此处下载该文件。

补充图7：设置Smart Leginon Hole_Targeting参数后的示例图谱。 紫色加号表示晶格位置，带方框的绿色加号表示采集位置，蓝色加号表示对焦位置。 请点击此处下载该文件。

补充图8：设置Smart Leginon Exposure_Targeting参数后的示例图谱。 蓝色圆圈为斑点，绿色加号为采集位置，蓝色加号为对焦位置。 请点击此处下载该文件。

补充图9：Smart Leginon Autoscreen 终端设置。 请点击此处下载该文件。

补充图10：Smart Leginon Autoscreen 图形用户界面设置。 请点击此处下载该文件。

讨论

在本方案中，我们描述了 Smart Leginon Autoscreen 的工作流程，并为初次使用该采集软件的用户补充介绍了 Leginon 的基本操作。截至2024年底，单颗粒冷冻电镜（cryoEM）有望成为最高效的三维（3D）蛋白质结构解析技术17。单颗粒冷冻电镜的工作流程包含多个步骤，这些步骤正在持续优化，以提高数据质量和通量。图2展示了最常见的步骤（样品制备、载网制备、筛选耗时与人力、高分辨率数据采集时间、实时处理以及完整后期处理），以及流程中可进一步改进的其他组成部分（筛选用显微镜的可及性、样品台速度与精度、相机采集速度以及高分辨率显微镜的可及性）。大多数步骤的结果会形成反馈回路，影响之前的步骤（图2中的蓝色箭头），从而使整个流程高度相互依赖。图2中每个步骤以不同颜色标注，大致表示该步骤相对于其他步骤的瓶颈程度。Smart Leginon Autoscreen 将筛选12个载网的操作时间从6小时减少到不到10分钟，显著降低了人力投入，缓解了这一瓶颈，从而加快了对样品/载网制备环节的反馈（图3）。

方案中的若干关键步骤如图1所示。用于创建模板会话的载网必须能够代表后续待筛选的所有载网，这一点至关重要。重要的是，Leginon会记录创建模板会话整个设置过程中的所有参数（图1中的蓝色步骤），从而使得每次重复建立模板会话时能够更快速地完成。在创建模板会话时，最关键的步骤是在所有放大倍数下设置靶向参数，以确保这些参数和阈值能够反映待筛选载网之间的预期差异。各种“测试”按钮有助于提高此设置过程的效率。在进行Autoscreen会话期间，必须在Appion中密切监控前几个载网，以便尽早发现任何问题，并立即在Leginon中进行修正。

SEMC 的典型工作流程是将 Autoscreen 数据输入 CryoSPARC Live18，并利用这些附加信息反馈优化样品和载网的制备过程。在研究人员与操作员集中进行冷冻电镜优化期间，即使 Autoscreen 仍在筛选载网，有关样品和载网状态的信息也会实时反馈至样品和载网的制备环节。这使得每周能够制备并筛选数十个载网8。

Smart Leginon Autoscreen 在 SEMC 观察到的大多数（80%-90%）有孔载网上和条件下均能有效工作。其余 10%-20% 的载网包括某些效果不佳的情况——孔与基底之间对比度差异极小的载网；孔径和间距较小的载网（例如 0.6/0.8）；以及跨多个载网进行靶向通常不切实际的情况——如 Spotiton/Chameleon19,20 载网，其样品呈条带状分布在载网上；网状载网。请注意，倾斜载网采集功能目前正处于 Autoscreen 的开发阶段，尚不可用。可以通过修改方案以适配 Spotiton/Chameleon 载网：首先手动成像条带区域以确定较窄的参数阈值，然后在步骤 2.1.7.4 中尝试分别将较大和较小的方格归为两组，再从含冰的组中选择靶点。该修改的目标是让 Smart Leginon 将空方格与非空方格自动分为两组。即使找到了适用参数，这些参数也可能无法很好地推广至其他待筛查的载网。此外，也可通过在步骤 2.1.9.1 中移除 hl_finding.sh 脚本，并根据需要调整参数以靶向更亮或更暗的区域，从而修改方案以适配网状载网。该修改的成功率可能因冰层厚度和载网材料的不同而有所差异。

在 Autoscreen 运行期间进行故障排查是可行的，有时也是必要的。在自动采集过程中，可以修改预设参数（例如离焦量）和定位参数（例如孔洞定位阈值）。当 Autoscreen 会话正在进行数据采集时，无法取消网格会话，因为这将终止 autoscreen.py 程序。然而，可以使用定位节点中的“中止”按钮来跳过某个网格的任何部分或整个网格。偶尔，autoscreen.py 可能因占用过多内存而冻结，此时将出现两个选项：“强制退出”或“等待”。如果选择“强制退出”，整个脚本将终止，用户需要重新运行脚本以对剩余的网格继续进行筛选。如果选择“等待”，脚本将继续运行，此时可调整设置以防止未来再次发生冻结，例如关闭曝光节点中的图像显示、减小图谱中的像素尺寸，或运行内存清理脚本。如果程序冻结且未提供上述两个选项，则内存错误可能无法自行恢复，导致数据采集暂停。在此情况下，“强制退出”选项可能更为适用。

Smart Leginon Autoscreen 在 SEMC 被常规使用。随着单颗粒冷冻电镜流程中的瓶颈不断被消除，冷冻电镜技术的应用将持续增长，以助力解答生物学问题。本实验方案朝着优化整个流程的方向迈出了一步，为显著减少反馈循环提供了清晰的路径。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

部分工作在纽约结构生物学中心的西蒙斯电子显微镜中心完成，得到了西蒙斯基金会（SF349247）、美国国立卫生研究院（U24 GM129539）以及纽约州议会的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Glacios 冷冻透射电镜 Thermo Fisher Scientific GLACIOSTEMFEG，200 keV，Falcon 3EC 相机 
Krios 冷冻透射电镜 Thermo Fisher Scientific KRIOSG4TEMXFEG，300 keV， Gatan BioQuantum 能量滤波器，Gatan K3 相机 
Leginon Simons 电子显微镜中心 http://leginon.org 
Ptolemy Simons 机器学习中心 https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy 

参考文献

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  3. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
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  9. Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy. IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).
  10. Bepler, T., et al. Smart data collection for CryoEM. Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913(2022).
  11. Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope. eLife. 11, e80047(2022).
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  18. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  19. Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. 168, 62271(2021).
  20. Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).

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