建立用于牙髓炎研究的新型开口器小鼠牙髓暴露模型

摘要

本文介绍了一种利用创新性开口器在小鼠中建立牙髓炎模型的简化方案，并随后进行组织学分析。

摘要

牙髓炎是导致天然牙齿丧失的常见原因，可引起炎症牙髓组织的坏死及生物活性的丧失。揭示牙髓炎的发生机制并实现有效治疗，一直是牙髓病学研究的重点。因此，深入了解牙髓内的炎症过程，对于提高牙髓保存率至关重要。与其他组织相比， 体外 实验方面，小鼠牙髓炎模型为观察牙髓炎的病理进展提供了更为真实且基因多样性更丰富的研究环境。然而，尽管小鼠具有成本低、易获取的优点，但其体型小、配合度差以及耐受性低等特点，使得口腔及牙科操作过程较为困难。本方案介绍了一种新型开口器的设计与应用，可用于暴露小鼠牙髓，从而促进更高效的口腔内操作。该开口器由大多数牙科医生 readily available 的牙弓结构组成，可显著加快手术准备过程，即使是初次操作亦能迅速完成。采用显微CT、苏木精-伊红（HE）染色及免疫荧光染色技术，用于识别形态学变化及细胞表达的改变。本文旨在帮助研究人员利用这一新型开口器，建立一种更具可重复性且操作要求更低的牙髓炎症模型构建方法。

引言

牙髓是牙齿的重要组成部分，负责多种基本功能，如营养供应、牙本质形成、感觉功能以及防御反应¹。然而，牙髓被坚硬的组织包围，易受到深龋、牙髓炎、外伤或后续治疗等引起的损伤和破坏^2,3。功能性牙髓的缺失会增加牙齿脆性的风险⁴。此外，年轻恒牙牙髓活力的丧失可能对牙齿的发育成熟产生不利影响，而目前的义齿技术无法恢复健康牙髓所提供的神经反馈功能⁴。这一现状促使研究人员探索除简单切除之外，处理炎症牙髓的替代性解决方案。

2007年，Murray等人率先将组织工程应用于再生牙髓学，从而激发了人们对牙髓保存与再生的广泛兴趣⁵。然而，炎症状态下的牙髓组织存在挑战，因为细胞会释放白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子，招募炎症细胞，导致细胞坏死、牙髓活力丧失以及功能恢复困难^6,7。因此，理解炎症及其相关的细胞死亡机制，对于推动活髓保存技术的发展至关重要。已有大量实验致力于探索活体（in vivo）或体外（in vitro）条件下炎症牙髓的分子生物学特性^8,9。尽管二维或三维细胞培养等in vitro 实验已发展多年，日趋成熟并被广泛用于检测牙髓细胞对炎症因子的反应，但这些实验无法反映牙髓组织与全身免疫系统之间的相互作用¹⁰。如果所研究的现象来源于免疫系统、血管系统或神经系统等其他组织来源的细胞，则单纯的牙髓细胞培养将难以取得突破。因此，in vivo 实验非常必要，且具有重要参考价值。

小鼠在炎症研究中正日益成为常用的选择 体内 由于小鼠具有成本低、繁殖力强和生命力旺盛等优点，常被用于实验研究。然而，目前尚缺乏构建小鼠牙髓炎模型的系统性实验方案可供参考。小鼠体型微小且对刺激敏感，给实验操作带来显著挑战。观察隐藏于口腔深部的微小牙齿通常需要使用悬臂式显微镜，尽管大多数实验室更常配备台式显微镜。此外，实验过程中缺乏专用的开口器，往往需要助手协助。为解决这一问题，研究团队利用 readily available materials 设计了一种口撑装置，旨在建立标准化且可重复的小鼠牙髓炎模型构建方案。本文详细描述了在 C57 小鼠上实施该模型的操作流程，包括术前准备、固定、牙髓暴露手术及样本采集等步骤。本方案推荐使用该口撑装置，并介绍其结构、制作方法及应用方式，以帮助其他研究人员顺利复现实验操作。

方案

本研究中的实验操作已获得四川大学华西口腔医学院伦理委员会的批准（WCHSIRB-D-2021-125）。成年C57BL/6小鼠购自中国成都的集萃药康实验动物有限公司。上颌第一磨牙的整个牙冠在出生后21天完全萌出。用于手术的小鼠应大于21天，且具有正常的生命活力¹¹。本研究中使用6至8周龄的小鼠进行建模。图1为实验流程示意图。

1. 术前准备 (图2)

1. 准备以下器械：体视显微镜、固定板、医用胶带、开口器、直径为0.6 mm的微创牙科钻头、牙科高速手机、8# C+锉、加热垫、1 mL注射器、无菌棉球、眼科镊。
2. 准备以下药品：麻醉混合液、兽用软膏。

2. 口腔拉钩的制备

1. 根据体重按 0.007 mL/g 的剂量，通过腹腔注射麻醉混合液（10% 盐酸氯胺酮 + 5% 赛拉嗪 + 85% 无菌等渗盐水）对小鼠进行称重和麻醉，并通过脚趾夹捏法确认麻醉效果。在眼睛上涂抹眼用润滑软膏，以防止手术过程中因干燥造成眼部损伤。
   注意：必须佩戴医用帽、口罩、手套和防护服等基本防护装备。确保手术环境和小鼠饲养环境清洁安全。整个操作过程中需使用加热垫以维持体温。
2. 按以下步骤制备开口器（图3）。
   1. 准备以下材料：直径为 8 µm 的正畸弓丝、幼环弯制钳、粗丝剪、记号笔、长度为 3 mm、横截面直径为 1 mm 的橡胶帽。
   2. 首先用左手固定弓丝，右手拇指和食指轻微向弓丝弧度方向弯折。重复此动作数次，有助于后续准确弯制成三维角度。
   3. 使用幼环弯制钳在弓丝中点处弯制梯形（图3C，a-l-k-b）顶部边缘（图3G，a-i），长度约 8 mm。确保点 a（图3）位于钳喙边缘。
   4. 左手持钳，右手拇指和食指夹住弓丝自由端，从点 a 开始弯制约 120° 的角度。在点 i（图3G）重复相同操作。将弓丝平放于水平台面，检查其是否处于同一平面，不应出现翘起。
   5. 两侧各预留约 9 mm 长度（图3D，a-b，l-k），使用与步骤 2.2.4 相同的技术将自由端弯制成 75° 角，确保每一边均在同一平面上。使用钳喙尖端弯制此锐角。
   6. 在距点 b 约 5 mm 处确定点 c。采用相同技术在点 c 处弯制 105° 角。在距点 c 5 mm 处的点 d 再弯制另一个 105° 角。从点 d 起预留约 4.5 mm 确定点 e，在点 e 处将自由端弯制形成约 100–105° 的角度（图3E）。
      注意：本实验所用 C57 小鼠为 6–8 周龄，体重约 20 g。5 mm 的间距既能牢固固定小鼠上下颌而不滑动，又不会压迫皮肤引起不适。若使用其他品系或年龄的小鼠，请根据实际情况调整 c-d 和 i-h 部分的长度（图3E、G）。
   7. 额外弯制一个用于下颌部分的舌压板（图3G，j-i-h-g）。
   8. 在 l-k-j 部分重复 a-b-c 部分的弯制步骤。同时夹住 i-k 和 k-j 部分，将点 j 处的自由端弯制至与 i-k-j 平面垂直。夹住距点 j 5 mm 的点 i，将自由端弯制至与 i-k-j 平面及 c-d 部分均平行（图3H）。
   9. 从点 i 起预留 5 mm 长度，在点 h 处将弓丝弯制至与 i-h 部分垂直，并与 j-i-h 平面平行。在距点 h 5 mm 处确定点 g，夹住 j-i-h-g 平面并将自由端弯制，使其与 k-j 部分对称。此后点 f 之后的自由端应与点 e 的自由端对称（图3H）。
   10. 在自由端安装橡胶帽（图3F）。

3. 固定化

1. 用皮肤胶带将小鼠仰卧固定在固定板上，并固定其四肢。用拇指和食指按压开口器的自由端。
2. 将小鼠的上门齿固定在两个臂状结构的梯形凹槽内。确保带有压舌板的一侧对应下颌。调整开口器，使小鼠舌头固定不动，但避免缺血。

4. 牙齿评估

1. 确保用于手术的上颌第一磨牙无龋齿、外伤及牙源性病变，周围牙龈无红肿或瘘管。确保对侧牙齿健康，可作为健康对照组。

5. 牙髓暴露

1. 使用牙科钻头在上颌第一磨牙的咬合面以20,000 rpm的速度进行钻孔，确保去除釉质。使用牙科手机操作时仅限于牙本质浅层，以避免对牙髓组织造成过度的热刺激¹²。
2. 同时，在操作过程中每3分钟使用注射器向牙齿滴加生理盐水，以防止过热。
3. 将8#或10# C+锉置于钻孔最深处，穿通剩余牙本质以暴露髓腔。当局部牙本质被完全去除时，会有明显的落空感。探查时不宜过深，以免将牙髓组织带出髓腔。
4. 清理牙齿周围的碎屑，取出开口器，手术结束。以对侧上颌第一磨牙作为未处理对照。

6. 术后护理

1. 手术后，皮下注射卡洛芬（5 mg/kg），并将小鼠俯卧于化学热疗加热垫上，直至从麻醉中恢复。给予小鼠食物并提供饮用水。恢复过程应有人员监管。在小鼠完全恢复之前，同一饲养盒内不应有其他动物。

7. 样本采集与保存

1. 术后24小时或根据实验需要的其他时间点，在深度麻醉条件下通过颈椎脱位处死小鼠⁹。使用眼科剪剪除附着在上颌骨和颧骨上的骨骼肌。去除骨骼、额骨及软组织，取出带有上颌磨牙的齿骨板。
   注：根据He等人的研究，建议在术后72小时内采集牙髓炎样本，以避免牙髓组织发生广泛性坏死¹³。
2. 将齿骨板沿矢状面均分为两半，置于4%多聚甲醛（PBS配制，pH 7.4）中，4 °C固定24小时。

8. 组织学分析

1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织，并在含有5% EDTA和4%蔗糖的PBS脱钙液（pH 7.4）中于4 °C条件下脱钙2–4周，每日更换脱钙液¹⁰。
2. 将半块下颌骨齿板包埋于石蜡中，确保无牙的矢状面朝下放置于组织包埋盒底部。
3. 使用石蜡切片机将石蜡包埋块切成5 µm厚的切片。根据显微镜下观察到的近端、远端、上方及下方的位置关系，调整石蜡块的角度，以确保能够切到第一磨牙完整的牙冠牙髓及穿孔部位。

结果

上述操作在3只6至8周龄C57BL/6小鼠的右侧上颌第一磨牙上进行，左侧上颌第一磨牙则作为对照保留。空白对照、12小时牙髓炎和24小时牙髓炎样本的组织学与免疫荧光结果用于演示。

根据 Goldman 等人¹⁵ 的 CT 分析方案，通过显微 CT 及重建模型确认了牙髓暴露，如图 4 A-C 所示。对对照侧和手术侧的上颌第一磨牙进行了矢状切面 HE 染色（图 5）。结果显示伤口边缘处存在牙髓组织坏死及细胞形态结构的破坏。坏死主要集中在穿孔附近的牙髓组织，而未打开侧的牙髓组织形态正常。术后 24 小时，大部分牙髓组织（包括根髓）在形态上仍保持完整（图 5）。

对照组中IL-6¹⁴的表达水平较低，在12 h时伤口周围可见少量IL-...

讨论

牙髓作为牙齿内唯一的软组织，在维持牙齿生物活性方面发挥着关键作用，但其敏感性极高。近年来，在牙髓治疗中优先采用保留活髓的策略，这就需要对牙髓炎症的机制有全面的理解¹⁶。牙髓炎中炎症微环境的时空动态变化以及牙髓内固有细胞类型之间的相互作用，使得通过体外（in vitro）研究难以深入探究¹¹。相比之下，体内（in vivo）研究能够模拟人体内的生理环境，因而更具优势。利用实验小鼠，特别是基因过表达或基因敲低的小鼠，是验证科学假设的有效手段。然而，实验室中常用的C57小鼠由于体型小且不配合，给牙齿施加刺激带来了困难¹⁷。为解决这一问题，有必要对一种新型开口器进行详细说明，以帮助研究人员在小鼠口腔内顺利操作。此外，本文还阐述了使用该开口器通过暴露小鼠第一磨牙牙髓建立牙髓炎模型的实验方案，为后续研究提供了有价值的参考指南。

经过多次迭代，成功设计出一种可扩展且易于制作的开口器。开口器的尺寸及其三视图示意图见

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>动物
C57/B6J 小鼠	Gempharmatech 实验动物有限公司	C57/B6J	用于建立牙髓暴露
<强>仪器设备
1 mL 注射器	成都新津士峰医疗器械 &安普&仪器有限公司	SB1-074(IV)	用于药物注射。
8# C+ 文件	Readysteel	0010047	用于暴露髓室顶。
麻醉混合溶液			10% 盐酸氯胺酮 + 5% 赛拉嗪 + 85% 无菌等渗盐水
DAPI染色液	Beyotime	C1005	用于免疫荧光染色中细胞核的复染。
牙科高速手机	京源电子商务技术	WJ-422	在牙髓暴露处应用。
重型钢丝钳	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	无	应用等离子弧切割。
苏木精和伊红染色试剂盒	Biosharp	BL700B	用于载玻片的组织学分析。
IL-6 抗体	Novus	NBP2-89149	应用于免疫荧光染色以检测牙髓炎症。
氯胺酮（盐酸氯胺酮）	Vet One，美国爱达荷州博伊西	C3N VT1	100 mg/kg，腹腔注射。用于麻醉时。
医用穿刺	3M	1530	在小鼠固定中应用。
正畸弓丝	上海微容医疗器械有限公司	K417	8 的直径µm
圆形牙科钻头（0.6 mm）	Shofu global	072208	用于去除釉质及浅层牙本质。
幼嫩组织弯钳	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	无	进行弧形弯曲操作。