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方法文章

整体成像技术用于可视化及量化外周晶状体结构、细胞形态与排列组织

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DOI：

10.3791/66017

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2024年1月19日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University, 3Department of Biomedical Engineering, University of Delaware

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案描述了用于可视化晶状体外周结构的新型整体成像技术，并提供了图像定量分析的方法。这些方案可用于相关研究，以更深入地理解晶状体微尺度结构与其发育及功能之间的关系。

摘要

晶状体是一种透明且具有弹性的组织，可通过改变其形状将来自不同距离的光线聚焦到视网膜上。除了包裹整个器官、被称为囊膜的基底膜外，晶状体完全由细胞构成，其前半球表面为单层上皮细胞，主体部分则由大量晶状体纤维细胞组成。在整个生命周期中，上皮细胞在晶状体赤道部的生发区不断增殖，赤道区的上皮细胞随之迁移、伸长并分化为新形成的纤维细胞。赤道区上皮细胞的形态发生显著变化，从随机排列的鹅卵石状细胞转变为排列整齐的六边形细胞，并形成子午排。新形成的晶状体纤维细胞保持六边形细胞形态，并向晶状体的前极和后极方向伸长，形成新的细胞层，覆盖在先前世代的纤维细胞之上。目前对驱动晶状体上皮细胞向纤维细胞发生显著形态发生的机制仍知之甚少。为了更深入地理解晶状体的结构、发育和功能，研究人员已开发出新的成像方案，利用眼晶状体的整体装片来观察其周边结构。本文展示了量化囊膜厚度、上皮细胞面积、细胞核面积与形态、子午排细胞排列顺序与堆积方式以及纤维细胞宽度的方法。这些测量对于阐明晶状体终生生长过程中发生的细胞变化，以及理解随年龄增长或病理状态下发生的变化至关重要。

引言

眼晶状体是位于眼球前部的一种柔韧透明的组织，其功能是将光线精确聚焦于视网膜上。晶状体功能的实现部分归因于其复杂的结构与组织方式1,2,3,4,5,6。包围晶状体组织的是晶状体囊膜，这是一种基底膜，对维持晶状体的结构和生物力学特性至关重要7,8,9。晶状体本身完全由细胞构成，包含两种细胞类型：上皮细胞和纤维细胞。上皮层由一层立方状细胞组成，覆盖晶状体的前半球10。在整个生命过程中，上皮细胞在晶状体囊膜上增殖并向晶状体赤道部迁移。位于前方的上皮细胞处于静止状态，横截面呈鹅卵石状；而在晶状体赤道附近，上皮细胞开始增殖并启动向新纤维细胞分化的进程11,12。赤道部的上皮细胞从随机排列的细胞转变为有序的子午排（meridional rows），细胞呈六边形。这些正在分化的细胞其基底侧保持六边形形态，而顶端侧则收缩并锚定于晶状体的支点（即中心柱，modiolus）4,13,14,15。当赤道部上皮细胞开始伸长形成新的纤维细胞时，细胞的顶端沿前部上皮细胞的顶端表面向晶状体前极迁移，而基底端则沿晶状体囊膜向后极移动。新一代的纤维细胞覆盖在先前生成的细胞层之上，形成同心球壳状的纤维层。在细胞伸长和成熟过程中，纤维细胞的形态发生显著改变11,12,16。这些纤维细胞构成了晶状体的主体质量11,12,16,17,18。

导致晶状体复杂微结构、细胞形态以及独特细胞排列形成的分子机制尚未完全明确。此外，晶状体囊膜和细胞结构对晶状体整体功能（透明性、形状改变）的贡献仍不清楚。然而，通过新的成像方法以及对晶状体结构和细胞特征的定量评估，这些关系正在被逐步阐明2,4,19,20,21,22。目前已开发出可对完整晶状体进行成像的新方案，能够实现对晶状体囊膜、上皮细胞及周边纤维细胞的高空间分辨率可视化。该方案包括对囊膜厚度、细胞大小、细胞核大小及圆形度、经线排列顺序、纤维细胞排列方式和纤维细胞宽度的定量分析方法。这些可视化与图像定量技术可实现深入的形态测量分析，相较于其他可视化方法（如平铺标本或组织切片成像），其优势在于能够保持整体三维组织结构。这些方法为验证新的科学假说提供了可能，并将推动对晶状体细胞模式发育与功能的进一步理解。

在以下实验中，我们使用野生型小鼠和Rosa26-tdTomato小鼠（B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23（杰克逊实验室），背景为C57BL/6J，年龄为6至10周，包含两种性别。tdTomato小鼠可通过表达与突变型MARCKS蛋白N端8个氨基酸融合的tdTomato蛋白，实现活体晶状体中细胞质膜的可视化，该融合蛋白通过N端肉豆蔻酰化和内部半胱氨酸-棕榈酰化位点靶向定位于质膜23。我们还使用了最初由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（位于马里兰州贝塞斯达）Robert Adelstein博士提供的NMIIAE1841K/E1841K小鼠24。如先前所述20，将FvBN/129SvEv/C57Bl6背景的NMIIAE1841K/E1841K 小鼠（缺失CP49串珠状中间丝蛋白，该蛋白维持成熟晶状体纤维细胞形态及整个晶状体的生物力学特性）与C57BL6/J野生型小鼠进行回交。我们对后代进行了基因型筛选，以确认是否存在野生型CP49等位基因。

使用激光扫描共聚焦荧光显微镜，配备 20 倍（数值孔径 NA = 0.8，工作距离 = 0.55 mm，放大倍数 1x）、40 倍（NA = 1.3 油镜，工作距离 = 0.2 mm，1x 放大倍数）或 63 倍（NA = 1.4 油镜，工作距离 = 0.19 mm，1x 放大倍数）物镜进行共聚焦成像。所有图像均采用针孔尺寸设置为 1 艾里单位（Airy Unit）进行采集（相应的光学切片厚度在图注中注明），该参数决定了光学切片的厚度。图像在 Zen 软件中进行处理，导出为 .tif 格式后导入 FIJI ImageJ 软件（imageJ.net）进行分析。

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方案

小鼠饲养于特拉华大学动物实验中心，保持在无病原体的环境中。所有动物实验操作，包括通过吸入 CO2 实施安乐死，均依照特拉华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物实验规程进行。

1. 全晶状体铺片制备与成像

  1. 用于整体成像的晶状体固定
    1. 安乐死后，摘除眼球并如前所述分离晶状体25。分离后立即将晶状体转移至室温下的新鲜1×磷酸盐缓冲液（PBS；1.1 mM KH2PO4，155 mM NaCl，3.0 mM Na2HPO4-7H2O；pH 7.4）中。
      注意：若晶状体在PBS中储存时间过长，细胞形态可能发生改变，因此建议在分离后约10分钟内立即进行固定。
    2. 对于晶状体前部区域的整体成像，将完整晶状体浸入含有0.5 mL新配制的4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS中，置于微量离心管内，室温下固定。30分钟后，用1×PBS洗涤晶状体3次（每次5分钟）。随后进入步骤1.2或在4 °C下保存于1×PBS中。固定后的晶状体最多可保存5天。
    3. 对于晶状体赤道部区域的整体成像，将完整晶状体浸入含有0.5 mL新配制的4% PFA的1×PBS中，置于微量离心管内，室温下固定。1小时后，用1×PBS洗涤晶状体3次（每次5分钟）。随后进入步骤1.3或在4 °C下保存于1×PBS中。固定后的晶状体最多可保存5天。
  2. 晶状体前部区域整体成像（固定或活体）
    1. 对于固定晶状体的整体成像，进入步骤1.2.3。
    2. 对于活体晶状体的整体成像，将晶状体转移至48孔板的一个孔中，孔内含1 mL无酚红的Medium 199培养基，并添加1%抗生素/抗真菌剂。将晶状体在37 °C、5% CO2条件下孵育直至成像。成像前，在Medium 199中加入荧光标记的麦芽凝集素（WGA-640，1:500）和Hoechst 33342（1:500），将晶状体在此溶液中孵育至少10分钟。随后进入步骤1.5。
    3. 为对固定晶状体的囊膜、F-肌动蛋白和细胞核进行染色，将晶状体置于微量离心管中，加入500 µL通透/封闭缓冲液（含0.3% Triton、0.3%牛血清白蛋白（V组分）和3%山羊血清的1×PBS），其中包含WGA-640（1:500）、罗丹明-鬼笔环肽（1:50）和Hoechst 33342（1:500）。4 °C下避光孵育过夜。
    4. 过夜孵育后，用1 mL 1×PBS洗涤晶状体3次（每次5分钟）。随后进行成像。
    5. 为在共聚焦成像时稳定固定晶状体，如前所述在成像皿的琼脂糖上制作晶状体固定凹槽21（图1）。
      1. 使用微波炉加热并轻轻混匀PBS中的2%琼脂糖溶液，直至完全液化。用移液器将250 µL液化后的2%琼脂糖加入玻璃底培养皿（图1A），再用柔性塑料盖玻片将琼脂糖均匀铺平（图1B）。待琼脂糖冷却并完全凝固后，用精细尖头镊子小心移除盖玻片（图1C），然后使用3 mm活检打孔器在培养皿中央的琼脂糖上打孔（图1D）。
      2. 用精细擦拭纸去除多余的琼脂糖（图1E）。用1×PBS保持琼脂糖模具湿润，并在4 °C下保存备用。琼脂糖模具可成功保存长达1周。
    6. 使用胚胎镊子将活体或固定晶状体轻轻转移至含约2 mL 1×PBS（固定晶状体）或无酚红Medium 199（活体晶状体）的琼脂糖凹槽中（图1F），然后将培养皿置于倒置显微镜载物台上。为确认晶状体前部朝向物镜，可通过观察细胞核染色判断。若未观察到细胞核，则可能是后部朝向物镜。
    7. 若需翻转晶状体，使用弯头镊子轻轻将晶状体旋转约180°，使前部朝向物镜。使用共聚焦显微镜采集图像。
    8. 为观察晶状体囊膜，使用40×物镜（步长0.3 µm）采集z轴层扫图像，首张图像应在囊膜表面之前（由WGA染色指示），末张图像应在上皮细胞顶面之后。为观察上皮细胞，使用63×物镜（步长0.3 µm）采集z轴层扫图像以观察晶状体上皮细胞。
      注意：这些显微镜参数可实现充分的三维（3D）图像重建，这对于囊膜厚度或上皮细胞面积的图像定量至关重要。如前所述4，也可通过穿透上皮细胞单层对活体tdTomato标记晶状体的缝合线进行成像。
  3. 晶状体赤道部上皮细胞与纤维细胞染色
    1. 将固定晶状体置于微量离心管中，加入0.5 mL通透/封闭液（含3% BSA、3%山羊血清和0.3% Triton的溶液），其中包含罗丹明-鬼笔环肽（1:300）、WGA-640（1:250）和Hoechst 33342（1:500）。4 °C下避光孵育过夜。
    2. 过夜孵育后，用1 mL 1×PBS洗涤晶状体3次（每次5分钟）。
    3. 如前所述制作晶状体固定的琼脂糖楔形模具4,10。
      1. 简要步骤：将约5–6 mL熔融的2%琼脂糖（溶于1×PBS）倒入玻璃底培养皿（FD35-100，WPI）中，形成琼脂糖楔形结构（图2A）。待琼脂糖凝固后（图2B），用锋利刀片切出三角形凹槽（图2C）。取出琼脂糖楔块，并向培养皿中加入1 mL 1×PBS（图2D）。
      2. 吸除切割过程中残留的琼脂糖碎屑。每个培养皿可制作多个不同尺寸的楔形凹槽以适配不同大小的晶状体（图中未示出）。储存琼脂糖模具时，向模具表面加入1 mL 1×PBS，并在4 °C下保存。楔形模具可保存长达1周。
    4. 使用弯头镊子将晶状体放入含1 mL 1×PBS的琼脂糖楔形凹槽中，并调整位置，使晶状体赤道部朝下，紧贴共聚焦物镜上方的显微镜玻璃（图2E-F）。为确认赤道部处于焦平面，观察细胞核排列，确保赤道部细胞核呈行状排列。赤道部上皮细胞还可通过其不规则的排列和形态进行识别。此外，经F-肌动蛋白染色可见，经线行细胞精确对齐且呈六边形。
    5. 若视野中细胞核呈随机分布，则晶状体前部朝向物镜；若无法观察到细胞核，则晶状体后部很可能朝向物镜。若晶状体未稳定于赤道位置，应重新调整方向，使用弯头镊子旋转晶状体，直至观察到晶状体赤道部精确对齐的细胞核。
    6. 使用激光扫描共聚焦显微镜对晶状体赤道部上皮细胞和纤维细胞进行成像（20×物镜，NA = 0.8，步长0.5 µm；和/或40×油镜，NA = 1.3，步长0.4 µm）。在采集z轴层扫图像前旋转图像方向，使赤道部上皮细胞位于上方，其下依次为经线行细胞和纤维细胞。

2. 图像分析方法

  1. 晶状体囊厚度测量
    1. 使用40倍物镜（步长0.3 µm）获取的活体tdTomato标记晶状体（WGA标记）或固定后经WGA和鬼笔环肽（rho-phalloidin）标记的晶状体的z轴层扫图像，在三维重建的XZ视图中生成光学二维投影，并以.tif格式保存。使用Zen软件处理图像。
    2. 在FIJI ImageJ软件中打开XZ切片（.tif）图像。
    3. 为测量晶状体囊厚度，使用直线工具（见图3A、B）。通过选择编辑 > 选项 > 线宽，将线宽设置为50像素。该线宽经实验确定可在当前显微镜设置下提供较高的信噪比。在其他显微镜/显微镜设置下，或使用其他物种的晶状体时，最佳线宽可能有所不同。随后，从囊膜顶部表面画线至上皮细胞基底区域下方。
    4. 按Ctrl + T将该线保存为感兴趣区域（ROI）。
    5. 将各通道分离为图像、颜色和拆分通道的标签页。
    6. 按Ctrl + K测量囊膜通道沿该直线的荧光强度。
    7. 在电子表格中，以距离为横坐标（x轴）绘制强度值曲线，并确定代表囊膜表面和上皮细胞基底区域的囊膜与F-actin的强度峰值。
    8. 接着，通过计算囊膜与上皮细胞荧光强度峰值之间的距离，得出囊膜厚度（图3C、D）。
  2. 细胞面积分析
    1. 使用63倍油镜（NA = 1.4；步长0.3 µm）获取活体tdTomato标记晶状体或经鬼笔环肽标记的固定晶状体的z轴层扫图像，分析共聚焦z轴层扫图像中上皮细胞中段（侧向）区域处于焦平面的XY视图切片。注意，可通过tdTomato膜染料或定位于细胞侧膜的鬼笔环肽信号观察到侧膜。
      注：由于晶状体存在曲率（如XZ视图所示；图4A-C），并非所有上皮细胞在图像中均处于焦平面。上皮细胞中段区域指细胞侧膜（图4D-E）和细胞核（图4G-I）均清晰对焦的区域。
    2. 将图像导出为.tif格式，并在FIJI ImageJ中打开。
    3. 为在FIJI ImageJ中设置分析尺度，使用直线工具在共聚焦图像中标定比例尺长度的线段。
    4. 记录该线段的像素长度及比例尺的实际长度。在工具栏菜单中选择“分析”，然后点击设置尺度。在“像素距离”中输入线段的像素数，在“已知距离”中输入比例尺的实际长度。
    5. 以tdTomato或罗丹明鬼笔环肽染色作为细胞边界的指示，使用多边形工具手动勾勒图像中处于焦平面的一群细胞。仅勾勒侧膜清晰可见的细胞（图4E），避免勾勒部分可见的细胞（如位于图像边缘的细胞）。按Ctrl+T保存ROI。在工具栏菜单中选择“编辑”，然后点击清除外部。随后在FIJI ImageJ中按Ctrl + M测量总细胞面积（ROI）。
    6. 通过将ROI面积除以细胞总数计算平均细胞面积。一种简单的细胞计数方法是统计细胞核数量。切换至细胞核通道（蓝色）。在ROI菜单中选择已保存的细胞轮廓（图4G）。通过“编辑”菜单点击清除外部，保留ROI内区域（图4H）。使用多点工具，通过点击单个细胞核进行计数。
  3. 细胞核面积与形态分析
    1. 进行细胞核面积与形态分析时，分析z轴层扫共聚焦图像中tdTomato标记的上皮细胞中段（侧向）区域处于焦平面的XY平面光学切片。选择细胞核面积最大的共聚焦图像z轴切片（图5A）进行分析；此切片代表细胞核的中部区域。
      注：由于晶状体曲率影响，并非所有细胞核均处于焦平面，这在XZ视图中可见（图4G和图5A）。
    2. 选择一组清晰对焦的细胞核子集，并保存为ROI。
    3. 使用清除外部功能。在ROI内，使用自由手绘选择工具（左侧第四个工具按钮），仔细描画细胞核边界（图5B）。每次描画后按Ctrl+T将单个细胞核轮廓保存至ROI窗口。仅描画完整可见且彼此不接触的细胞核。
    4. 完成所有细胞核描画后，按Ctrl+M测量各个细胞的核面积和形态参数（如圆形度）。
    5. 将数据复制粘贴至电子表格，计算平均核面积和圆形度（图5C）。
  4. 经线行上皮细胞排列分析
    1. 为测量经线行排列紊乱程度，使用20倍物镜（步长0.5 µm）采集图像。
    2. 在图像中识别晶状体支点/中轴（fulcrum/modiolus）。支点是上皮细胞顶端在赤道区初始纤维细胞分化和伸长过程中收缩形成的锚定点区域。根据XZ视图中明亮的F-actin信号（图6A中箭头所示）以及XY视图单个光学切片中细胞组织结构的变化来识别支点（图6B中红色虚线所示）。
      注：此外，支点上方的上皮细胞可见基底和顶端区域的F-actin染色，而支点下方仅可见伸长细胞的基底区域（图6A）。支点上方的上皮细胞排列不规则，常形成玫瑰花结样结构，而支点下方的纤维细胞则呈平行排列，表现为细胞膜处明亮的F-actin染色（图6B）。
    3. 在2月龄小鼠中确定支点后，选择XY平面中距支点约4.5–5 µm（朝向晶状体囊方向）的单个光学切片。该距离的选择依据是：在2月龄小鼠中，当经线行细胞核位于支点外侧约5 µm时，所有细胞核均处于焦平面。将该单个光学切片保存为.tif文件，并在FIJI中打开。
      注：该分析目前仅在2月龄小鼠中进行，因此尚不能确定该距离是否会随年龄变化。
    4. 在进行图像分析前，参照步骤2.2.2在ImageJ中将尺度单位设置为µm。
    5. 通过识别细胞核排列，在FIJI中使用自由手绘线工具手动勾勒整个经线行区域（感兴趣区域/ROI），如图7A所示。按Ctrl+T保存ROI。在工具栏菜单中选择“编辑”，然后点击清除外部。在FIJI ImageJ中按Ctrl + M测量总细胞面积（ROI）。
    6. 在FIJI ImageJ中使用自由手绘线工具，勾勒由F-actin染色显示的紊乱区域。紊乱区域的判定标准包括行分支、排列不规则及行错位（图7B），如先前研究所述20。
    7. 在FIJI ImageJ中按Ctrl + M测量所勾勒的紊乱区域/斑块面积。在电子表格中汇总总紊乱面积。
    8. 将总紊乱面积除以ROI面积，再乘以100，得到紊乱区域百分比。若未观察到紊乱，则将紊乱区域值记为0%。
  5. 经线行邻近细胞数量分析
    1. 为测量邻近细胞数量，使用40倍油镜（步长0.4 µm）采集的F-actin染色图像。
    2. 选择晶状体囊内侧经线行细胞基底区域的光学切片（XY平面），该区域F-actin在经线行细胞整个周长周围富集，所有经线行细胞均清晰对焦且位于同一平面。
    3. 统计每个经线行细胞相邻的细胞数量（图8）。在电子表格中计算具有六个相邻细胞的细胞平均百分比。
      注：可使用20倍物镜确定相邻细胞数量，但使用40倍物镜更易于观察六边形结构。
  6. 赤道区纤维细胞图像分析
    1. 使用20倍物镜（步长0.5 µm）对罗丹明鬼笔环肽染色的晶状体进行z轴层扫共聚焦成像。
    2. 根据步骤2.4.2所述方法识别支点。确定支点后，选择一个单光学切片。为标准化分析并便于不同晶状体间比较，量化支点内侧约10 µm处（XY平面）的纤维细胞宽度（图9A）。
    3. 将原始图像导出至FIJI ImageJ。在FIJI ImageJ中，画一条横跨多个相邻纤维细胞的直线（通常长约300–400 µm），用于测量F-actin染色峰之间的距离（线扫描分析；图9A中粉红色线）。
    4. 在FIJI中按Ctrl+K获取沿扫描线的荧光强度分布。随后将数据导出至电子表格，计算峰间距离（示例见图9A-B）。该距离对应于纤维细胞宽度。

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结果

前囊膜、上皮细胞区域和核区域
为了分析晶状体囊膜厚度，我们使用WGA对活体或固定晶状体中的晶状体囊膜进行染色。通过在活体晶状体中标记tdTomato以显示细胞膜（图2A），或在固定晶状体中使用鬼笔环肽-罗丹明（rhodamine-phalloidin）染色标记细胞膜处的F-肌动蛋白（F-actin）（图2B），来识别晶状体上皮细胞。在正交（XZ）投影中，WGA与tdTomato/鬼笔环肽-罗丹明的染色信号可用于进行荧光强度的峰对峰线扫描分析。WGA通道中的主峰代表囊膜表面，而tdTomato/鬼笔环肽-罗丹明通道中的主峰则代表上皮细胞的基底区域。通过计算这两个峰之间的距离，即可获得囊膜厚度。线扫描分析显示，9周龄小鼠活体晶状体的囊膜厚度为11.2 µm，固定晶状体的囊膜厚度为12.5 µm。这些观察到的囊膜厚度数据与以往研究结果具有代表性的一致性2,4。

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讨论

本文所述方案能够实现对晶状体前部和赤道区周围晶状体结构及细胞的高空间分辨率可视化。本研究展示了利用完整（活体或固定）晶状体对晶状体周围结构进行可视化的技术，其中晶状体整体的三维结构得以保留。此外，还提供了使用公开可用的FIJI ImageJ软件进行形态计量学定量分析的简便方法。整体封片的可视化与定量方法已在先前的研究中应用。这些方法有助于我们理解前囊膜及细胞对晶状体形状变化或衰老的响应2,4。这些技术还被用于研究因晶状体形状改变或衰老引起的赤道区纤维细胞扩展2,4，以及确定NMIIA在形成精确的六边形结构和周围纤维细胞有序排列中的作用20。

整体成像可实现高空间分辨率 正面 晶状体结构成像。在晶状体前部区域，整体封片成像相较于平铺封片成像具有优势，可避免可能破坏囊膜结构完整性及/或上皮...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作获得了国家眼科研究所资助项目R01 EY032056（授予CC）和R01 EY017724（授予VMF），以及美国普通医学科学国家研究所P20GM139760号资助项目的支持。S.T.I.获得了美国国立卫生研究院普通医学科学国家研究所T32-GM133395培训资助，该资助属于化学-生物学交叉领域博士前培训项目的一部分，同时还获得了特拉华大学研究生学者奖的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3 mm 活检打孔器Acuderm IncNC9084780
琼脂糖Apex BioResearch Products20-102GP
抗真菌/抗生素CytivaSV30079.01
牛血清白蛋白（V 级组分）Prometheus25-529
精密擦拭纸Kimwipe
玻璃底培养皿（Fluorodish）World Precision InternationalFD35-100
Hoescht 33342Biotium40046
激光扫描共聚焦显微镜 880Zeiss
MatTek 成像培养皿MatTek Life SciencesP35G-1.5-14
多聚甲醛 Electron Microscopy Sciences100503-917
PBSGenClone25-507B
无酚红 Medium 199 培养基Gibco11043023
罗丹明-鬼笔环肽Thermo Fisher00027
Triton X-100Sigma-Aldrich11332481001
WGA-640BiotiumCF 640R

参考文献

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