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方法文章

利用分流式A4F微流控芯片单步分离大体积样品中的细胞外囊泡

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DOI：

10.3791/66019

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2024年2月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Latvian Biomedical Research and Study Centre, 2Institute of Solid-State Physics, University of Latvia, 3Cellbox labs LTD, Atari, 4Faculty of Materials Science and Applied Chemistry, Institute of General Chemical Engineering, Riga Technical university

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

细胞外囊泡在生物医学应用中具有巨大潜力，但目前的分离方法耗时较长，且难以适用于临床。在本研究中，我们介绍了一种微流控装置，可对大量生物流体进行连续、步骤极少的细胞外囊泡直接分离。

摘要

细胞外囊泡（EVs）在多种生物医学应用中具有巨大潜力，包括诊断、药物递送和再生医学。然而，目前分离EVs的方法仍面临诸多挑战，例如操作复杂、耗时较长，且需要大型设备，这些因素限制了其在临床中的转化应用。为克服这些局限性，我们致力于开发一种基于环烯烃共聚物-非化学计量比硫醇-烯（COC-OSTE）的创新性微流控系统，以实现从大体积样本中连续高效地分离EVs。通过利用基于尺寸和浮力的分离原理，本研究所采用的技术相较于现有方法，在尿液和细胞培养基样本中获得了更窄的EV尺寸分布，从而为未来应用中特定尺寸EV亚群的靶向分离提供了可能。我们创新的COC-OSTE微流控芯片设计，结合分支式非对称流场流分离技术，为大体积样本提供了一种简便且连续的EV分离方案。此外，该微流控芯片具备大规模制造的潜力，可实现良好的可扩展性和一致性，使其有望被整合到常规临床诊断和工业流程中，满足高一致性和高通量的关键需求。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞来源的膜包被颗粒，主要包括两种类型：外泌体（30–200 nm）和微囊泡（200–1000 nm）1。外泌体通过多泡体（MVB）内内涵体膜向内出芽形成，当MVB与细胞膜融合时，将腔内小泡（ILVs）释放到细胞外空间1。相比之下，微囊泡则是通过细胞膜向外出芽并发生断裂而生成2。EVs通过转运蛋白质、核酸、脂质和代谢物，在细胞间通讯中发挥关键作用，反映细胞的生理状态，包括生长、血管生成、转移、增殖以及治疗耐药性3。因此，EVs已成为包括癌症在内的多种疾病的潜在生物标志物和治疗靶点，凸显了其在诊断和药物递送系统中的应用前景4。

为了充分将细胞外囊泡（EVs）应用于疾病诊断和治疗，从各种生物液体中高效分离EVs至关重要5。 常用的方法包括超速离心法（UC）、密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法（SEC）、过滤法以及免疫捕获法6。超速离心法是一种广泛应用的技术，但可能共沉淀出与EVs密度相似的非EV颗粒，并可能导致EV聚集7。尺寸排阻色谱法因其可根据颗粒大小而非密度进行分离，从而获得更高纯度的样品，近年来受到广泛关注8。然而，为最大限度减少乳糜微粒和低密度脂蛋白等非目标颗粒的共分离，必须谨慎选择SEC色谱柱的合适孔径，并优化色谱条件8。尽管这两种方法均有效，但它们耗时较长，且难以实现自动化，尤其对于细胞培养上清或尿液等大体积样本，限制了其在工业规模应用中的可扩展性9。

近年来，非对称场流分离技术（A4F）已发展成为一种强大的分离方法，可用于基于粒径和浮力的微米及纳米级颗粒分离10。A4F 的工作原理依赖于一种在其底部带有微孔膜的微流控通道，该结构可产生指向膜方向的力，称为横向流10。当横向流与系统固有的布朗运动和泊肃叶流相结合时，由于不同颗粒在流动动力学中的位置差异，可实现高效的颗粒分离11。尽管该方法具有诸多优势，但其仅适用于微升级别的样品体积12，且需要额外的聚焦步骤，从而延长了整个过程的时间10。

在过去十年中，微流控技术作为一种快速、高效且临床可靠的细胞外囊泡（EV）分离工具，已受到广泛关注13。然而，大多数为EV分离设计的微流控方法均针对小体积、高浓度的EV样本进行优化，或依赖复杂的分离流程14。此外，在微流控领域，聚二甲基硅氧烷（PDMS）因其光学透明性、生物相容性和易于使用而被公认为金标准材料15。尽管如此，PDMS已知会吸附包括EV在内的小型亲脂性分子，这可能对其在EV研究领域的应用造成不利影响13。

环烯烃共聚物（COC）由于具有良好的生物相容性、对分子的低吸附性以及高化学稳定性，是微流控领域中常用的材料15。然而，COC器件的制备通常涉及复杂的工艺或需要专用设备16。相比之下，非化学计量比的硫醇-烯（OSTE）材料是一种有前景的PDMS替代材料，因其对小分子的吸附更低、化学稳定性更优、易于加工，并且可实现规模化生产17,18。然而，由于与管路连接较为复杂，器件可能发生泄漏19。

本研究旨在设计并制备一种结合OSTE与COC材料以及分叉流场流分离（A4F）原理的微流控装置，用于从尿液或细胞培养基等大体积样本中分离细胞外囊泡（EV）。

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方案

样本采集已获得拉脱维亚大学生命与医学科学研究伦理委员会批准（决定编号 N0-71-35/54）

注意：本研究中使用的材料包含在材料清单文件中。

1. 三维（3D）打印模具的制备

  1. 在 CAD 软件中设计一个蛇形双负模具，上通道尺寸如下：高度 0.5 mm，宽度 1 mm，长度 210 mm。下通道采用相同设计，宽度为 1.5 mm，高度为 0.6 mm，长度为 210 mm。模具的宽度、长度、高度等尺寸及设计等轴测图如图1所示。将设计保存为 .stl 文件。
  2. 在 Z-Suite 中准备该文件，无需添加支撑。使用耐黑色树脂，通过紫外光液晶显示器（UV LCD）3D 打印机打印模具。
  3. 打印完成后，小心地将模具从打印机表面取下。在异丙醇（IPA）中进行超声清洗 20 分钟。
  4. 用 N2 吹干模具。
  5. 使用 ND33 滤光片对模具进行泛光曝光 810 秒，然后将其放入 60 °C 的烘箱中固化 48 小时。

2. PDMS 模具的制备

  1. 按10:1的质量比称取PDMS（每个模具使用16 g弹性体基础剂和1.6 g交联剂）。在行星式离心混合器中混合组分，以500 RPM转速混合1分钟。
  2. 将混合后的PDMS浇注至3D打印模具中，并在-800 mbar的真空干燥器中脱气30分钟，或直至观察不到气泡。
  3. 在液态PDMS表面小心放置一层100 µm厚的聚氯乙烯衬层。
    NOTE: 应从一侧缓慢覆盖衬层至另一侧，以避免产生气泡。
  4. 将含有PDMS的模具放入原位成型夹具（Mold-in-Place Jig）中，并使用设定为0.3 Nm扭矩的扭矩扳手拧紧夹具。
  5. 将夹具放入60 °C烘箱中加热3小时，使PDMS固化。
  6. 使用六角扳手拆卸夹具，并从夹具中取出3D打印模具。
  7. 小心地将PDMS模具从3D打印的母模上脱模，先用手术刀沿模具边缘划开，再用镊子取下模具。
    ​NOTE: 为便于脱模，可使用异丙醇（IPA）；但之后需将模具在60 °C加热10分钟，以蒸发残留的IPA。

3. OSTE-COC 上层通道的制备

  1. 按1.09:1的质量比称取OSTE（制备5个装置需要1.56 g A组分和1.44 g B组分）。将组分在行星式离心混合器中混合：以750 RPM转速混合5分钟，然后以750 RPM转速脱气5分钟。
  2. 将混合好的OSTE转移至离心管中，在真空干燥器中于-800 mbar条件下脱气30分钟。
  3. 将带有2个16个微型鲁尔接头的COC载片在异丙醇（IPA）中超声清洗10分钟，随后用N2小心吹干。
  4. 将清洁后的COC载片放入等离子体刻蚀仪中，使平面朝上放置，并在700 W功率、0.133 mbar压力下使用800 SCCM氧气等离子体处理表面2分钟。
  5. 将经氧化处理的COC载片放置在用于上层通道的PDMS模具上，确保处理过的表面与PDMS的结构化表面接触。将组件装入原位成型夹具中，并使用设定为0.3 Nm扭矩的扭矩扳手拧紧夹具。
  6. 将压力系统连接至6 bar的压缩空气管线。取装有脱气后OSTE的离心管，按照压力系统的说明，使用内径（ID）为0.8 mm的聚四氟乙烯（PTFE）管进行组装。
  7. 将PTFE管连接至PDMS模具的入口，利用压力系统中压电泵维持的1000 mbar压力填充装置。将夹具玻璃面朝上放入掩模对准仪中，使用ND33滤光片进行850 mJ剂量的曝光。
  8. 曝光后，使用六角扳手拆卸夹具，并小心地将带有结构化OSTE层的COC载片从PDMS模具上取下。
  9. 将结构化的OSTE与一片25 mm × 75 mm、孔径为50 nm、孔密度为11.8%的膜接触，确保通道完全被膜覆盖。
    注：在操作过程中尤其需要注意保持膜尽可能平整。
  10. 将组件膜面朝上置于设定为60°C的加热板上，在膜上方放置一块干净的玻璃载片，并从上方施加1.6 kPa的压力以确保均匀键合。加热过夜。
    ​注：此步骤之后，尤其需要评估键合效果和通道形变情况。

4. OSTE-COC 底层通道的制备与装置组装

  1. 按1.09:1的质量比混合OSTE（制备5个装置需要1.56 g的A组分和1.44 g的B组分）。在行星式离心混合器中混合组分：以750 RPM转速混合5分钟，然后以750 RPM转速脱气5分钟。
  2. 将混合好的OSTE转移至离心管中，在真空干燥器中于-800 mbar下脱气30分钟。
  3. 将COC载片在异丙醇（IPA）中超声清洗10分钟，并用N2小心吹干。
  4. 将清洁后的COC载片放入等离子刻蚀仪中，在700 W功率、0.133 mbar压力条件下，使用800 SCCM的氧气等离子体处理表面2分钟。
  5. 将经氧化处理的COC载片放置在PDMS模具上，用于底部通道，确保处理过的表面与PDMS的结构化表面接触。将组件放入原位成型夹具中，使用扭矩扳手以0.3 Nm的扭矩拧紧夹具。
  6. 取装有脱气后OSTE的离心管，按照压力系统说明，使用内径为0.8 mm的PTFE管进行组装。
  7. 将PTFE管连接至PDMS模具的入口，利用1000 mbar的压力填充装置。将夹具玻璃面朝上放入光刻对准仪中，使用ND33滤光片进行1100 mJ剂量的曝光。
  8. 曝光后，使用六角扳手拆卸夹具，并小心地将带有结构化OSTE层的COC载片从PDMS模具上取下。
  9. 将结构化的OSTE层与顶部通道组件结合，使顶部和底部层的设计相互对齐，并确保OSTE底层与膜接触。
  10. 将组件插入原位成型夹具中，使用鳄鱼夹均匀施加1.6 kPa的压力。将夹具置于60°C烘箱中过夜。
    ​注意：夹子位置不均匀可能导致键合不均。

5. 设备评估

  1. 键合完成后，使用显微镜对器件进行目视检查，观察是否存在可视缺陷，例如通道变形或键合失败。
  2. 通过施加 30 mbar 压力，使 0.02 µm 过滤的去离子水流经无缺陷器件的通道，进行测试。观察流道和鲁尔接口是否存在泄漏以及水流情况。
    ​注意：若未检测到泄漏且通道内水流畅通无阻，可认为器件适用于后续实验。

6. 设备设置

  1. 用两个5 mL注射器各吸入2 mL经过20 nm滤膜过滤的3% H2O2，并将注射器安装到注射泵上（使用移动箭头调整至所需位置，插入注射器，并用顶部压杆固定）。
    警告！操作H2O2时务必小心。请穿戴实验服、防护橡胶手套和护目设备。
  2. 使用注射器针头将14 cm长、内径800 µm的PTFE管连接至注射器，并通过鲁尔接头将其连接至装置的入口。
  3. 将20 cm长、内径200 µm的聚醚醚酮（PEEK）管连接至出口。
  4. 将PEEK管的另一端连接至废液容器。装置设置如图3所示。
  5. 启动注射泵，设置每个入口的流速为500 µL/min（在仪器屏幕上操作：设置 > 系统设置 > 注射器（制造商：医用注射器，注射器：5 mL）> 返回按钮 > 参数（选择：推注，重复：1，体积：1.5 mL，流速：500 µL/min）> 返回按钮 > 返回按钮）。将流出液收集至废液容器中。
  6. 取两个新的5 mL注射器，各吸入2 mL经过20 nm滤膜过滤的70%乙醇。
  7. 将先前的注射器更换为装有乙醇的注射器，并按照步骤6.5所述相同参数启动注射泵。
  8. 使用新的5 mL注射器，各吸入5 mL经过20 nm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）。
  9. 将先前的注射器更换为装有PBS的注射器，并重复步骤6.1和6.5，用4 mL PBS冲洗装置。
    注意：请确保将系统设置参数更改为体积：4 mL（在仪器屏幕上操作：设置 > 参数 >（选择：体积：4 mL））。
  10. 断开装置上的管路，并用鲁尔封堵头封闭每个入口和出口。
    注意：保持装置内留有PBS，并在封闭前使用移液枪向每个入口和出口补充少量PBS，以避免引入气泡。
  11. 将装置在室温（RT）下避光静置过夜。
  12. 次日，用4 mL经过20 nm滤膜过滤的PBS冲洗装有PBS的装置（操作如步骤6.8所述）。
  13. 从两个出口收集最后1 mL流出液，置于2 mL低吸附蛋白管中，4 °C保存，作为装置引入颗粒的空白对照。
  14. 移除装有PBS的注射器，更换为装有空气的新的5 mL注射器。
  15. 用4 mL空气吹扫装置，直至所有液体完全排出装置和管路。

7. 使用标准化乳胶微球进行设备测试

  1. 使用1.0 µm聚苯乙烯微球和0.1 µm羧基微球制备标准化微球样品。向一个15 mL离心管中加入500 µL的1.0 µm聚苯乙烯微球标准品、1 µL的0.1 µm羧基微球标准品以及9499 µL的20 nm滤过的PBS缓冲液（最终1.0 µm和0.1 µm微球混合液的浓度分别为5 × 10⁸ 个微球/mL和3.6 × 10¹⁰ 个微球/mL）。
  2. 将微球样品涡旋振荡30秒，不使用时置于+4 °C保存。
  3. 取两个新的5 mL注射器，其中一个加入1.5 mL标准化微球混合液，另一个加入1.5 mL的20 nm滤过的PBS缓冲液。
  4. 移除先前连接的注射器，将装有微球混合液的注射器连接至第一进样管路，另一个装有PBS的注射器连接至第二进样管路。
  5. 移除废液容器，并为每条出样管路准备至少五个0.5 mL的微量离心管。
  6. 将注射泵系统的启动参数设置为体积：1 mL；流速：250 µL/min。
    注意：根据用户需求，可设置不同的流速，例如250 µL/min、200 µL/min、150 µL/min、100 µL/min和50 µL/min。建议进行预实验以选择最适合目标结果的流速。
  7. 启动注射泵，收集流出液——每个微量离心管中收集5至6滴。
    ​注意：若同一装置需多次使用，请按照步骤6.8所述冲洗装置，并更换所有连接件、堵头和针头。将使用过的连接件、堵头和针头置于20 nm滤过的70%乙醇中浸泡至少30分钟；随后转移至含有20 nm滤过的去离子水的离心管中，充分震荡，再转移至含有20 mL 20 nm滤过的去离子水的培养皿中。将培养皿置于摇床上以100 rpm振荡至少30分钟，之后将各部件转移至干燥的培养皿中静置干燥（至少12小时），方可再次使用。

8. 使用尿液样本进行设备测试

  1. 按照步骤 6.1–6.15 所述准备设备。
  2. 使用无菌尿液容器收集每位供体的晨尿 100 mL，并在采集后 2 小时内送至实验室进行处理。
  3. 将每份尿液样本分装至两个 50 mL 离心管中，在室温下以 2'000 x g 离心 15 分钟。
  4. 收集上清液，弃去沉淀。
  5. 将上清液在室温下以 10'000 x g 离心 30 分钟，以去除大颗粒和细胞碎片。
  6. 收集上清液，弃去沉淀。
  7. 按照步骤 6.6 所述清洗设备。
  8. 将 5 mL 注射器更换为装有预处理尿液样本的 20 mL 注射器（用于样品入口），以及另一个装有 20 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 DEPC-PBS 的 20 mL 注射器（用于缓冲液入口）。将注射泵设置更改为 BDPlastipak；注射器：cc；体积：20 mL；流速：250 µL/min（最佳流速），设置方法与步骤 6.2 所述相同。启动注射泵，并将每个出口的穿流液分别收集至不同的 50 mL 管中。
  9. 使用 100,000 分子量截留浓度管，在 4 °C 条件下以 3,000 x g 将每份穿流液分别浓缩至 100 µL。
  10. 将浓缩液转移至 0.5 mL 微量离心管中。
  11. 涡旋震荡浓缩样品 30 秒，然后离心 10 秒。
  12. 将样品分装，每管转移 25 µL，做好标记后于 -80 °C 冻存以长期保存。

9. 使用条件培养基进行设备测试

  1. 按照步骤 6.1–6.15 所述准备设备。
  2. 将细胞在 37 °C、5% CO2 的加湿环境中培养，直至总细胞数达到 1 亿，具体参照 Bajo-Santos 等人20 的方法。将细胞传代至一个 T175 悬浮培养瓶中，加入 100 mL 无血清培养基（补充 2% B-27 血清替代物），在 37 °C、5% CO2 的加湿环境中继续培养 48 小时。
  3. 收集细胞悬液，在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，以去除细胞。
  4. 收集上清液，并在 +4 °C 下以 3,000 x g 再次离心 30 分钟，以去除大颗粒和细胞碎片。
  5. 收集上清液并置于 +4 °C 保存，直至进行分离操作，但保存时间不得超过 3 小时。
  6. 将样品入口的 5 mL 注射器更换为装有已制备条件培养基的 20 mL 注射器，缓冲液入口更换为装有 20 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 的 20 mL 注射器。
  7. 按照步骤 7.8 所述设置泵站参数。
  8. 启动注射泵，分别用独立的 50 mL 离心管收集每个出口的流出液。
  9. 使用 100,000 分子量截留的浓缩管，在 +4 °C 下以 3,000 x g 将每份流出液分别浓缩至 150 µL。
  10. 将浓缩液转移至 0.5 mL 微量离心管中。
  11. 涡旋震荡浓缩样品 30 秒。
  12. 将浓缩样品短暂离心 10 秒。
  13. 将样品分装，每管转移 25 µL，标记后于 -80 °C 冻存，用于长期保存。

10. 使用超速离心法分离细胞外囊泡

  1. 使用固定角转子离心机，在 +4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 20 mL 尿液或条件培养基 70 分钟。
  2. 弃去上清液，并将沉淀重悬于 20 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 中。
  3. 再次离心，操作同步骤 10.1 所述。
  4. 弃去上清液，并将沉淀重悬于 12 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 中。
  5. 使用水平转子，在 +4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 70 分钟。
  6. 弃去上清液。
    注意：此次弃去上清液时需格外小心，建议使用移液器操作。
  7. 将沉淀重悬于 100 µL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 中。
  8. 分装样品后，进入第 12 节进行细胞外囊泡（EV）表征；否则，将样品储存于 -80 °C 待后续使用。

11. 使用尺寸排阻色谱法（SEC）分离EVs

  1. 使用100 kDa分子量截留值（MWCO）离心过滤装置，在+4 °C、3,000 x g条件下离心15分钟，将20 mL尿液或条件培养基浓缩至500 µL。
  2. 将浓缩液转移至尺寸排阻色谱柱（SEC柱，上样范围35 nm）。
  3. 将经20 nm滤膜过滤的PBS加入色谱柱，并收集15个0.5 mL的组分。
  4. 按照制造商说明书，使用动态光散射（DLS）系统分析各组分。
  5. 合并选定的组分；选择衰减系数低于11且大于40 nm的颗粒占总颗粒数至少30%的组分。
  6. 使用3 kDa分子量截留值（MWCO）离心过滤装置，在+4 °C、14,000 x g条件下离心15分钟，将选定组分浓缩至100 µL。
  7. 分装样品，并进入第12节进行细胞外囊泡（EV）表征；否则，储存于-80 °C备用。

12. 细胞外囊泡表征

  1. 从冷冻柜中取出待测样品，并在冰块上或 +4 °C 条件下缓慢解冻。
  2. 进行纳米颗粒追踪分析（NTA）以测定颗粒大小分布及数量13。采用高亲和力T细胞膜蛋白4（TIM-4）双夹心酶联免疫吸附测定法（dsELISA）14，确认样品中外泌体（EV）的存在。

13. 纳米颗粒跟踪分析（NTA）

  1. 将解冻的EV样本涡旋振荡30秒，离心10秒，然后取1 µL转移至含有999 µL经20 nm滤膜过滤的PBS的2 mL微量离心管中，进行1000倍稀释。另保留1 mL用于稀释的PBS，以检测其中是否含有颗粒物。将所有样品在测量前储存于+4 °C。
    注意：使用前需将PBS通过0.02 nm滤膜过滤。
  2. 将EV样本或空白对照涡旋振荡30秒，用注射器将其注入检测模块。向模块中加入约0.7 mL样本，并将其放入仪器中。
  3. 按照仪器制造商的操作说明，使用纳米颗粒分析仪对样本进行测量。

14. 针对EV标志物的双抗夹心ELISA

  1. 配制浓度为 1 µg/mL 的 TIM4-Fc 蛋白溶液。向每个所需孔中加入 100 µL 溶液，于 +4 °C 摇床中以 200 RPM 振荡孵育过夜。
  2. 次日，配制洗涤液（1× TBS + 0.05% Tween20 + 2 mM CaCl2）。
  3. 弃去各孔中的全部液体。向每孔加入 200 µL 洗涤液，在室温下以 200 RPM 振荡 5 分钟后弃去液体。重复此步骤两次。
  4. 配制封闭液（1× TBS + 0.05% Tween20 + 1% 牛血清白蛋白）。向每孔加入 200 µL 封闭液，室温下以 200 RPM 振荡孵育 1 小时。
  5. 按步骤 14.3 所述方法洗涤各孔。
  6. 在洗涤缓冲液中配制每种样品稀释液各 220 µL（最佳 EV 浓度为 2.7 × 105 EVs/µL）。每孔加入 100 µL 稀释后的样品，设置两个重复孔。室温下以 200 RPM 振荡孵育 90 分钟。
  7. 按步骤 14.3 所述方法洗涤各孔。
  8. 向每孔加入 100 µL 对应的一抗抗体。使用适当的 EV 标记物以确认 EV 及污染物4。室温下以 200 RPM 振荡孵育 2 小时。注意：若使用二抗抗体，则重复步骤 14.7–14.8，但将二抗抗体的孵育时间缩短至 1 小时。
  9. 按步骤 14.3 所述方法洗涤各孔。
  10. 向每孔加入 100 µL 辣根过氧化物酶底物，混匀 1 分钟后，室温孵育 30 分钟。
  11. 向每孔加入 1 M H2SO4 以终止反应。
  12. 使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。

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结果

我们采用3D打印的双负模（图1），通过软光刻技术（图2A）制备了一种微流控装置，用于基于分支场流分离（bifurcated A4F）原理的高通量EV分离（图2B、C）。该装置需要配备泵和流通池站（图3），以实现EV的自动化分离。首先，为验证该装置的概念可行性，我们制备了直径分别为100 nm和1000 nm的聚苯乙烯微球混合物，分别代表囊泡和细小细胞碎片10。对微球混合物在有无分支流条件下，以不同流速进行了实验，以研究线性流速对分离效率的影响。在所有实验中，小尺寸微球的回收率始终保持稳定且高于90%10，表明该装置在EV回收方面具有良好的潜力。

随后，我们评估并比较了 COC-OSTE 装置从复杂生物流体中无需过多预处...

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讨论

本文介绍的微流控装置为从生物液体中分离和提取细胞外囊泡（EVs）提供了一种颇具前景的方法，解决了现有金标准方法（如超速离心法UC和尺寸排阻色谱法SEC）的一些关键局限性12。已知UC和SEC方法操作繁琐、耗时较长，且产率较低，因此在需要大量EVs的高通量应用中适用性较差21,22。相比之下，所描述的微流控装置能够以极少的人工干预连续处理多达20 mL的生物液体，有望成为工业或临床环境中的变革性工具。该微流控装置的一个关键优势在于，相较于涉及人工操作的传统方法，它能够实现EV分离过程的标准化并提高可重复性。通过大规模生产减少EV分离装置制造过程中的变异性，可更有效地控制装置性能并保持一致性，这对于基于EV的治疗和诊断应用至关重要。此外，该装置可通过适合的基材进行反应注塑成型，兼容大体积制造，进一步增强了其在规模化生产和广泛应用方面的潜力。

为了确保可重复性和稳定的性能，必须制定详尽且明确的实验方案，以规范芯片的制备及其在...

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披露

A.A.、G.M. 和 R.R. 是 Cellbox Labs, LLC 的创始人、董事会成员及股权持有者

致谢

感谢所有参与本研究的捐赠者，以及拉脱维亚基因组数据库工作人员提供的样本。拉脱维亚大学固体物理研究所作为卓越中心，获得了欧盟“地平线2020”框架计划H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2（资助协议编号739508）项目CAMART2的资助。本研究得到了拉脱维亚科学委员会项目No. lzp-2019/1-0142和项目No. lzp-2022/1-0373的支持。

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材料

本文使用的材料清单
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0.1 µm 羧酸盐 FluoSpheresInvitrogen#F8803储存浓度：3.6 x 1013 个微珠/毫升（依批号而定）
0.5 mL 微型离心管Starstedt72.704
1 mL 鲁尔锥形注射器，一次性使用，不带针头射线TUB1ML
1.0 µm 多苯乙烯荧光微球Invitrogen#F13083储存浓度：1 × 10¹⁰ 个微珠/毫升（依批号而定）
10 mL 血清移液管Sarstedt86.1254.001
15 mL（100k）Amicon Ultra 离心滤器默克密理博UFC910024
2.0 mL 蛋白质低吸附管Eppendorf30108132
20 mL 注射器BD PlastikPak10569215
250 µm ID 聚醚醚酮管达尔文微流控CIL-1581
3 kDa 截留分子量离心过滤装置默克密理博，UFC200324
5 mL 医用注射器（无针头）安徽宏宇五洲医疗159646
50 mL 一次性离心管Sarstedt62.547.254
70 Ti 固定角转子超速离心机贝克曼库尔特337922
800 µm ID 聚四氟乙烯管达尔文微流控LVF-KTU-15
96孔微孔板，平底，中等结合力Greiner Bio-One655001ELISA 板
B-27添加剂（50倍浓度），无血清赛默飞世尔科技17504044
牛血清白蛋白SigmaAldrichA7906-100G
COC Topas 显微镜载玻片平台微流控芯片店10000002
COC Topas 显微镜载玻片平台 2 x 16 Mini Luer 微流控芯片店10000387
Elveflow OB1 压力控制器Elvesys 集团
鲁尔接头达尔文微流控 CS-10000095
Suss MA/BA6 掩模对准器SUSS MicroTec 集团
Mixer Thinky ARE-250Thinky Corporation
NanoSight NS300马尔文帕纳科NS300纳米颗粒分析仪 
光学显微镜 Nikon Eclipse LV150NNikon Metrology NV
OSTE 322 水晶透明Mercene Labs
PBS片剂，无钙/无镁，Fisher Bioreagents，100 gFisher ScientificBP2944-100
PC膜（50 nm孔径，11.8%密度）it4ip 股份有限公司，比利时，鲁汶-拉-讷夫
无菌培养皿Sarstedt82.1472.001
等离子体灰化仪 GIGAbatch 360 MPVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm 柱IzonSP5SEC柱
QSIL 216 硅胶弹性体试剂盒PP&S
树脂增韧型黑色Zortrax
SW40 Ti 摆动转子超速离心机Beckman Coulter331301
注射泵DK InfusetekISPLab002
T175 悬浮培养瓶Sarstedt83.3912.502
TIM4-Fc 蛋白Adipogen LifeSciencesAG-40B-0180B-3010
TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）SigmaAldrichT0440-100ML辣根过氧化物酶底物
Tween20SigmaAldrichP1379-100ML
Optima L100XP 超速离心机贝克曼库尔特
超声波清洗仪 P 60 HElma Schmidbauer GmbH
通用微孔板分光光度计Bio-Tek 仪器71777-1
尿液采集杯，150 mL，无菌APTACA2120_SG
Whatman Anotop 25 注射器滤器SigmaAldrich68092002
Zetasizer Nano ZS马尔文帕纳科动态光散射（DLS）系统 
Zortrax InkspireZortrax

参考文献

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