利用分流式A4F微流控芯片单步分离大体积样品中的细胞外囊泡

摘要

细胞外囊泡在生物医学应用中具有巨大潜力，但目前的分离方法耗时较长，且难以适用于临床。在本研究中，我们介绍了一种微流控装置，可对大量生物流体进行连续、步骤极少的细胞外囊泡直接分离。

摘要

细胞外囊泡（EVs）在多种生物医学应用中具有巨大潜力，包括诊断、药物递送和再生医学。然而，目前分离EVs的方法仍面临诸多挑战，例如操作复杂、耗时较长，且需要大型设备，这些因素限制了其在临床中的转化应用。为克服这些局限性，我们致力于开发一种基于环烯烃共聚物-非化学计量比硫醇-烯（COC-OSTE）的创新性微流控系统，以实现从大体积样本中连续高效地分离EVs。通过利用基于尺寸和浮力的分离原理，本研究所采用的技术相较于现有方法，在尿液和细胞培养基样本中获得了更窄的EV尺寸分布，从而为未来应用中特定尺寸EV亚群的靶向分离提供了可能。我们创新的COC-OSTE微流控芯片设计，结合分支式非对称流场流分离技术，为大体积样本提供了一种简便且连续的EV分离方案。此外，该微流控芯片具备大规模制造的潜力，可实现良好的可扩展性和一致性，使其有望被整合到常规临床诊断和工业流程中，满足高一致性和高通量的关键需求。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞来源的膜包被颗粒，主要包括两种类型：外泌体（30–200 nm）和微囊泡（200–1000 nm）¹。外泌体通过多泡体（MVB）内内涵体膜向内出芽形成，当MVB与细胞膜融合时，将腔内小泡（ILVs）释放到细胞外空间¹。相比之下，微囊泡则是通过细胞膜向外出芽并发生断裂而生成²。EVs通过转运蛋白质、核酸、脂质和代谢物，在细胞间通讯中发挥关键作用，反映细胞的生理状态，包括生长、血管生成、转移、增殖以及治疗耐药性³。因此，EVs已成为包括癌症在内的多种疾病的潜在生物标志物和治疗靶点，凸显了其在诊断和药物递送系统中的应用前景⁴。

为了充分将细胞外囊泡（EVs）应用于疾病诊断和治疗，从各种生物液体中高效分离EVs至关重要⁵。 常用的方法包括超速离心法（UC）、密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法（SEC）、过滤法以及免疫捕获法⁶。超速离心法是一种广泛应用的技术，但可能共沉淀出与EVs密度相似的非EV颗粒，并可能导致EV聚集⁷。尺寸排阻色谱法因其可根据颗粒大小而非密度进行分离....

方案

样本采集已获得拉脱维亚大学生命与医学科学研究伦理委员会批准（决定编号 N0-71-35/54）

注意：本研究中使用的材料包含在材料清单文件中。

1. 三维（3D）打印模具的制备

1. 在 CAD 软件中设计一个蛇形双负模具，上通道尺寸如下：高度 0.5 mm，宽度 1 mm，长度 210 mm。下通道采用相同设计，宽度为 1.5 mm，高度为 0.6 mm，长度为 210 mm。模具的宽度、长度、高度等尺寸及设计等轴测图如图1所示。将设计保存为 .stl 文件。
2. 在 Z-Suite 中准备该文件，无需添加支撑。使用耐黑色树脂，通过紫外光液晶显示器（UV LCD）3D 打印机打印模具。
3. 打印完成后，小心地将模具从打印机表面取下。在异丙醇（IPA）中进行超声清洗 20 分钟。
4. 用 N₂ 吹干模具。
5. 使用 ND33 滤光片对模具进行泛光曝光 810 秒，然后将其放入 60 °C 的烘箱中固化 48 小时。

2. PDMS 模具的制备

1. 按10:1的质量比称取P....

结果

我们采用3D打印的双负模（图1），通过软光刻技术（图2A）制备了一种微流控装置，用于基于分支场流分离（bifurcated A4F）原理的高通量EV分离（图2B、C）。该装置需要配备泵和流通池站（图3），以实现EV的自动化分离。首先，为验证该装置的概念可行性，我们制备了直径分别为100 nm和1000 nm的聚苯乙烯微球混合物，分别代表囊泡和细小细胞碎片¹⁰。对微球混合物在有无分支流条件下，以不同流速进行了实验，以研究线性流速对分离效率的影响。在所有实验中，小尺寸微球的回收率始终保持稳定且高于90%¹⁰，表明该装置在EV回收方面具有良好的潜力。

随后，我们评估并比较了 COC-OSTE 装置从复杂生物流体中无需过多预处.......

讨论

本文介绍的微流控装置为从生物液体中分离和提取细胞外囊泡（EVs）提供了一种颇具前景的方法，解决了现有金标准方法（如超速离心法UC和尺寸排阻色谱法SEC）的一些关键局限性¹²。已知UC和SEC方法操作繁琐、耗时较长，且产率较低，因此在需要大量EVs的高通量应用中适用性较差^21,22。相比之下，所描述的微流控装置能够以极少的人工干预连续处理多达20 mL的生物液体，有望成为工业或临床环境中的变革性工具。该微流控装置的一个关键优势在于，相较于涉及人工操作的传统方法，它能够实现EV分离过程的标准化并提高可重复性。通过大规模生产减少EV分离装置制造过程中的变异性，可更有效地控制装置性能并保持一致性，这对于基于EV的治疗和诊断应用至关重要。此外，该装置可通过适合的基材进行反应注塑成型，兼容大体积制造，进一步增强了其在规模化生产和广泛应用方面的潜力。

为了确保可重复性和稳定的性能，必须制定详尽且明确的实验方案，以规范芯片的制备及其在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 µm 羧酸盐 FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	储存浓度：3.6 x 1013 个微珠/毫升（依批号而定）
0.5 mL 微型离心管	Starstedt	72.704
1 mL 鲁尔锥形注射器，一次性使用，不带针头	射线	TUB1ML
1.0 µm 多苯乙烯荧光微球	Invitrogen	#F13083	储存浓度：1 × 10¹⁰ 个微珠/毫升（依批号而定）
10 mL 血清移液管	Sarstedt	86.1254.001
15 mL（100k）Amicon Ultra 离心滤器	默克密理博	UFC910024
2.0 mL 蛋白质低吸附管	Eppendorf	30108132
20 mL 注射器	BD PlastikPak	10569215
250 µm ID 聚醚醚酮管	达尔文微流控	CIL-1581
3 kDa 截留分子量离心过滤装置	默克密理博，	UFC200324
5 mL 医用注射器（无针头）	安徽宏宇五洲医疗	159646
50 mL 一次性离心管	Sarstedt	62.547.254
70 Ti 固定角转子超速离心机	贝克曼库尔特	337922
800 µm ID 聚四氟乙烯管	达尔文微流控	LVF-KTU-15
96孔微孔板，平底，中等结合力	Greiner Bio-One	655001	ELISA 板
B-27添加剂（50倍浓度），无血清	赛默飞世尔科技	17504044
牛血清白蛋白	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Topas 显微镜载玻片平台	微流控芯片店	10000002
COC Topas 显微镜载玻片平台 2 x 16 Mini Luer	微流控芯片店	10000387
Elveflow OB1 压力控制器	Elvesys 集团
鲁尔接头	达尔文微流控	CS-10000095
Suss MA/BA6 掩模对准器	SUSS MicroTec 集团
Mixer Thinky ARE-250	Thinky Corporation
NanoSight NS300	马尔文帕纳科	NS300	纳米颗粒分析仪
光学显微镜 Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 水晶透明	Mercene Labs
PBS片剂，无钙/无镁，Fisher Bioreagents，100 g	Fisher Scientific	BP2944-100
PC膜（50 nm孔径，11.8%密度）	it4ip 股份有限公司，比利时，鲁汶-拉-讷夫
无菌培养皿	Sarstedt	82.1472.001
等离子体灰化仪 GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm 柱	Izon	SP5	SEC柱
QSIL 216 硅胶弹性体试剂盒	PP&S
树脂增韧型黑色	Zortrax
SW40 Ti 摆动转子超速离心机	Beckman Coulter	331301
注射泵	DK Infusetek	ISPLab002
T175 悬浮培养瓶	Sarstedt	83.3912.502
TIM4-Fc 蛋白	Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）	SigmaAldrich	T0440-100ML	辣根过氧化物酶底物
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
Optima L100XP 超速离心机	贝克曼库尔特
超声波清洗仪 P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
通用微孔板分光光度计	Bio-Tek 仪器	71777-1
尿液采集杯，150 mL，无菌	APTACA	2120_SG
Whatman Anotop 25 注射器滤器	SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	马尔文帕纳科		动态光散射（DLS）系统
Zortrax Inkspire	Zortrax