细胞外囊泡在生物医学应用中具有巨大潜力，但目前的分离方法耗时较长，且难以适用于临床。在本研究中，我们介绍了一种微流控装置，可对大量生物流体进行连续、步骤极少的细胞外囊泡直接分离。
方法文章
利用分流式A4F微流控芯片单步分离大体积样品中的细胞外囊泡
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）在多种生物医学应用中具有巨大潜力，包括诊断、药物递送和再生医学。然而，目前分离EVs的方法仍面临诸多挑战，例如操作复杂、耗时较长，且需要大型设备，这些因素限制了其在临床中的转化应用。为克服这些局限性，我们致力于开发一种基于环烯烃共聚物-非化学计量比硫醇-烯（COC-OSTE）的创新性微流控系统，以实现从大体积样本中连续高效地分离EVs。通过利用基于尺寸和浮力的分离原理，本研究所采用的技术相较于现有方法，在尿液和细胞培养基样本中获得了更窄的EV尺寸分布，从而为未来应用中特定尺寸EV亚群的靶向分离提供了可能。我们创新的COC-OSTE微流控芯片设计，结合分支式非对称流场流分离技术，为大体积样本提供了一种简便且连续的EV分离方案。此外，该微流控芯片具备大规模制造的潜力，可实现良好的可扩展性和一致性，使其有望被整合到常规临床诊断和工业流程中，满足高一致性和高通量的关键需求。
引言
细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞来源的膜包被颗粒，主要包括两种类型：外泌体（30–200 nm）和微囊泡（200–1000 nm）1。外泌体通过多泡体（MVB）内内涵体膜向内出芽形成，当MVB与细胞膜融合时，将腔内小泡（ILVs）释放到细胞外空间1。相比之下，微囊泡则是通过细胞膜向外出芽并发生断裂而生成2。EVs通过转运蛋白质、核酸、脂质和代谢物，在细胞间通讯中发挥关键作用，反映细胞的生理状态，包括生长、血管生成、转移、增殖以及治疗耐药性3。因此，EVs已成为包括癌症在内的多种疾病的潜在生物标志物和治疗靶点，凸显了其在诊断和药物递送系统中的应用前景4。
为了充分将细胞外囊泡（EVs）应用于疾病诊断和治疗，从各种生物液体中高效分离EVs至关重要5。 常用的方法包括超速离心法（UC）、密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法（SEC）、过滤法以及免疫捕获法6。超速离心法是一种广泛应用的技术，但可能共沉淀出与EVs密度相似的非EV颗粒，并可能导致EV聚集7。尺寸排阻色谱法因其可根据颗粒大小而非密度进行分离，从而获得更高纯度的样品，近年来受到广泛关注8。然而，为最大限度减少乳糜微粒和低密度脂蛋白等非目标颗粒的共分离，必须谨慎选择SEC色谱柱的合适孔径，并优化色谱条件8。尽管这两种方法均有效，但它们耗时较长，且难以实现自动化，尤其对于细胞培养上清或尿液等大体积样本，限制了其在工业规模应用中的可扩展性9。
近年来，非对称场流分离技术（A4F）已发展成为一种强大的分离方法，可用于基于粒径和浮力的微米及纳米级颗粒分离10。A4F 的工作原理依赖于一种在其底部带有微孔膜的微流控通道，该结构可产生指向膜方向的力，称为横向流10。当横向流与系统固有的布朗运动和泊肃叶流相结合时，由于不同颗粒在流动动力学中的位置差异，可实现高效的颗粒分离11。尽管该方法具有诸多优势，但其仅适用于微升级别的样品体积12，且需要额外的聚焦步骤，从而延长了整个过程的时间10。
在过去十年中，微流控技术作为一种快速、高效且临床可靠的细胞外囊泡（EV）分离工具，已受到广泛关注13。然而，大多数为EV分离设计的微流控方法均针对小体积、高浓度的EV样本进行优化，或依赖复杂的分离流程14。此外，在微流控领域，聚二甲基硅氧烷（PDMS）因其光学透明性、生物相容性和易于使用而被公认为金标准材料15。尽管如此，PDMS已知会吸附包括EV在内的小型亲脂性分子，这可能对其在EV研究领域的应用造成不利影响13。
环烯烃共聚物（COC）由于具有良好的生物相容性、对分子的低吸附性以及高化学稳定性，是微流控领域中常用的材料15。然而，COC器件的制备通常涉及复杂的工艺或需要专用设备16。相比之下，非化学计量比的硫醇-烯（OSTE）材料是一种有前景的PDMS替代材料，因其对小分子的吸附更低、化学稳定性更优、易于加工，并且可实现规模化生产17,18。然而，由于与管路连接较为复杂，器件可能发生泄漏19。
本研究旨在设计并制备一种结合OSTE与COC材料以及分叉流场流分离（A4F）原理的微流控装置，用于从尿液或细胞培养基等大体积样本中分离细胞外囊泡（EV）。
方案
样本采集已获得拉脱维亚大学生命与医学科学研究伦理委员会批准（决定编号 N0-71-35/54）
注意：本研究中使用的材料包含在材料清单文件中。
1. 三维（3D）打印模具的制备
- 在 CAD 软件中设计一个蛇形双负模具，上通道尺寸如下：高度 0.5 mm，宽度 1 mm，长度 210 mm。下通道采用相同设计，宽度为 1.5 mm，高度为 0.6 mm，长度为 210 mm。模具的宽度、长度、高度等尺寸及设计等轴测图如图1所示。将设计保存为 .stl 文件。
- 在 Z-Suite 中准备该文件，无需添加支撑。使用耐黑色树脂，通过紫外光液晶显示器（UV LCD）3D 打印机打印模具。
- 打印完成后，小心地将模具从打印机表面取下。在异丙醇（IPA）中进行超声清洗 20 分钟。
- 用 N2 吹干模具。
- 使用 ND33 滤光片对模具进行泛光曝光 810 秒，然后将其放入 60 °C 的烘箱中固化 48 小时。
2. PDMS 模具的制备
- 按10:1的质量比称取PDMS（每个模具使用16 g弹性体基础剂和1.6 g交联剂）。在行星式离心混合器中混合组分，以500 RPM转速混合1分钟。
- 将混合后的PDMS浇注至3D打印模具中，并在-800 mbar的真空干燥器中脱气30分钟，或直至观察不到气泡。
- 在液态PDMS表面小心放置一层100 µm厚的聚氯乙烯衬层。
NOTE: 应从一侧缓慢覆盖衬层至另一侧，以避免产生气泡。 - 将含有PDMS的模具放入原位成型夹具（Mold-in-Place Jig）中，并使用设定为0.3 Nm扭矩的扭矩扳手拧紧夹具。
- 将夹具放入60 °C烘箱中加热3小时，使PDMS固化。
- 使用六角扳手拆卸夹具，并从夹具中取出3D打印模具。
- 小心地将PDMS模具从3D打印的母模上脱模，先用手术刀沿模具边缘划开，再用镊子取下模具。
NOTE: 为便于脱模，可使用异丙醇（IPA）；但之后需将模具在60 °C加热10分钟，以蒸发残留的IPA。
3. OSTE-COC 上层通道的制备
- 按1.09:1的质量比称取OSTE（制备5个装置需要1.56 g A组分和1.44 g B组分）。将组分在行星式离心混合器中混合：以750 RPM转速混合5分钟，然后以750 RPM转速脱气5分钟。
- 将混合好的OSTE转移至离心管中，在真空干燥器中于-800 mbar条件下脱气30分钟。
- 将带有2个16个微型鲁尔接头的COC载片在异丙醇（IPA）中超声清洗10分钟，随后用N2小心吹干。
- 将清洁后的COC载片放入等离子体刻蚀仪中，使平面朝上放置，并在700 W功率、0.133 mbar压力下使用800 SCCM氧气等离子体处理表面2分钟。
- 将经氧化处理的COC载片放置在用于上层通道的PDMS模具上，确保处理过的表面与PDMS的结构化表面接触。将组件装入原位成型夹具中，并使用设定为0.3 Nm扭矩的扭矩扳手拧紧夹具。
- 将压力系统连接至6 bar的压缩空气管线。取装有脱气后OSTE的离心管，按照压力系统的说明，使用内径（ID）为0.8 mm的聚四氟乙烯（PTFE）管进行组装。
- 将PTFE管连接至PDMS模具的入口，利用压力系统中压电泵维持的1000 mbar压力填充装置。将夹具玻璃面朝上放入掩模对准仪中，使用ND33滤光片进行850 mJ剂量的曝光。
- 曝光后，使用六角扳手拆卸夹具，并小心地将带有结构化OSTE层的COC载片从PDMS模具上取下。
- 将结构化的OSTE与一片25 mm × 75 mm、孔径为50 nm、孔密度为11.8%的膜接触，确保通道完全被膜覆盖。
注：在操作过程中尤其需要注意保持膜尽可能平整。 - 将组件膜面朝上置于设定为60°C的加热板上，在膜上方放置一块干净的玻璃载片，并从上方施加1.6 kPa的压力以确保均匀键合。加热过夜。
注：此步骤之后，尤其需要评估键合效果和通道形变情况。
4. OSTE-COC 底层通道的制备与装置组装
- 按1.09:1的质量比混合OSTE（制备5个装置需要1.56 g的A组分和1.44 g的B组分）。在行星式离心混合器中混合组分：以750 RPM转速混合5分钟，然后以750 RPM转速脱气5分钟。
- 将混合好的OSTE转移至离心管中，在真空干燥器中于-800 mbar下脱气30分钟。
- 将COC载片在异丙醇（IPA）中超声清洗10分钟，并用N2小心吹干。
- 将清洁后的COC载片放入等离子刻蚀仪中，在700 W功率、0.133 mbar压力条件下，使用800 SCCM的氧气等离子体处理表面2分钟。
- 将经氧化处理的COC载片放置在PDMS模具上，用于底部通道，确保处理过的表面与PDMS的结构化表面接触。将组件放入原位成型夹具中，使用扭矩扳手以0.3 Nm的扭矩拧紧夹具。
- 取装有脱气后OSTE的离心管，按照压力系统说明，使用内径为0.8 mm的PTFE管进行组装。
- 将PTFE管连接至PDMS模具的入口，利用1000 mbar的压力填充装置。将夹具玻璃面朝上放入光刻对准仪中，使用ND33滤光片进行1100 mJ剂量的曝光。
- 曝光后，使用六角扳手拆卸夹具，并小心地将带有结构化OSTE层的COC载片从PDMS模具上取下。
- 将结构化的OSTE层与顶部通道组件结合，使顶部和底部层的设计相互对齐，并确保OSTE底层与膜接触。
- 将组件插入原位成型夹具中，使用鳄鱼夹均匀施加1.6 kPa的压力。将夹具置于60°C烘箱中过夜。
注意：夹子位置不均匀可能导致键合不均。
5. 设备评估
- 键合完成后，使用显微镜对器件进行目视检查，观察是否存在可视缺陷，例如通道变形或键合失败。
- 通过施加 30 mbar 压力，使 0.02 µm 过滤的去离子水流经无缺陷器件的通道，进行测试。观察流道和鲁尔接口是否存在泄漏以及水流情况。
注意：若未检测到泄漏且通道内水流畅通无阻，可认为器件适用于后续实验。
6. 设备设置
- 用两个5 mL注射器各吸入2 mL经过20 nm滤膜过滤的3% H2O2，并将注射器安装到注射泵上（使用移动箭头调整至所需位置，插入注射器，并用顶部压杆固定）。
警告！操作H2O2时务必小心。请穿戴实验服、防护橡胶手套和护目设备。 - 使用注射器针头将14 cm长、内径800 µm的PTFE管连接至注射器，并通过鲁尔接头将其连接至装置的入口。
- 将20 cm长、内径200 µm的聚醚醚酮（PEEK）管连接至出口。
- 将PEEK管的另一端连接至废液容器。装置设置如图3所示。
- 启动注射泵，设置每个入口的流速为500 µL/min（在仪器屏幕上操作：设置 > 系统设置 > 注射器（制造商：医用注射器，注射器：5 mL）> 返回按钮 > 参数（选择：推注，重复：1，体积：1.5 mL，流速：500 µL/min）> 返回按钮 > 返回按钮）。将流出液收集至废液容器中。
- 取两个新的5 mL注射器，各吸入2 mL经过20 nm滤膜过滤的70%乙醇。
- 将先前的注射器更换为装有乙醇的注射器，并按照步骤6.5所述相同参数启动注射泵。
- 使用新的5 mL注射器，各吸入5 mL经过20 nm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 将先前的注射器更换为装有PBS的注射器，并重复步骤6.1和6.5，用4 mL PBS冲洗装置。
注意：请确保将系统设置参数更改为体积：4 mL（在仪器屏幕上操作：设置 > 参数 >（选择：体积：4 mL））。 - 断开装置上的管路，并用鲁尔封堵头封闭每个入口和出口。
注意：保持装置内留有PBS，并在封闭前使用移液枪向每个入口和出口补充少量PBS，以避免引入气泡。 - 将装置在室温（RT）下避光静置过夜。
- 次日，用4 mL经过20 nm滤膜过滤的PBS冲洗装有PBS的装置（操作如步骤6.8所述）。
- 从两个出口收集最后1 mL流出液，置于2 mL低吸附蛋白管中，4 °C保存，作为装置引入颗粒的空白对照。
- 移除装有PBS的注射器，更换为装有空气的新的5 mL注射器。
- 用4 mL空气吹扫装置，直至所有液体完全排出装置和管路。
7. 使用标准化乳胶微球进行设备测试
- 使用1.0 µm聚苯乙烯微球和0.1 µm羧基微球制备标准化微球样品。向一个15 mL离心管中加入500 µL的1.0 µm聚苯乙烯微球标准品、1 µL的0.1 µm羧基微球标准品以及9499 µL的20 nm滤过的PBS缓冲液（最终1.0 µm和0.1 µm微球混合液的浓度分别为5 × 10⁸ 个微球/mL和3.6 × 10¹⁰ 个微球/mL）。
- 将微球样品涡旋振荡30秒，不使用时置于+4 °C保存。
- 取两个新的5 mL注射器，其中一个加入1.5 mL标准化微球混合液，另一个加入1.5 mL的20 nm滤过的PBS缓冲液。
- 移除先前连接的注射器，将装有微球混合液的注射器连接至第一进样管路，另一个装有PBS的注射器连接至第二进样管路。
- 移除废液容器，并为每条出样管路准备至少五个0.5 mL的微量离心管。
- 将注射泵系统的启动参数设置为体积：1 mL；流速：250 µL/min。
注意：根据用户需求，可设置不同的流速，例如250 µL/min、200 µL/min、150 µL/min、100 µL/min和50 µL/min。建议进行预实验以选择最适合目标结果的流速。 - 启动注射泵，收集流出液——每个微量离心管中收集5至6滴。
注意：若同一装置需多次使用，请按照步骤6.8所述冲洗装置，并更换所有连接件、堵头和针头。将使用过的连接件、堵头和针头置于20 nm滤过的70%乙醇中浸泡至少30分钟；随后转移至含有20 nm滤过的去离子水的离心管中，充分震荡，再转移至含有20 mL 20 nm滤过的去离子水的培养皿中。将培养皿置于摇床上以100 rpm振荡至少30分钟，之后将各部件转移至干燥的培养皿中静置干燥（至少12小时），方可再次使用。
8. 使用尿液样本进行设备测试
- 按照步骤 6.1–6.15 所述准备设备。
- 使用无菌尿液容器收集每位供体的晨尿 100 mL，并在采集后 2 小时内送至实验室进行处理。
- 将每份尿液样本分装至两个 50 mL 离心管中，在室温下以 2'000 x g 离心 15 分钟。
- 收集上清液，弃去沉淀。
- 将上清液在室温下以 10'000 x g 离心 30 分钟，以去除大颗粒和细胞碎片。
- 收集上清液，弃去沉淀。
- 按照步骤 6.6 所述清洗设备。
- 将 5 mL 注射器更换为装有预处理尿液样本的 20 mL 注射器（用于样品入口），以及另一个装有 20 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 DEPC-PBS 的 20 mL 注射器（用于缓冲液入口）。将注射泵设置更改为 BDPlastipak；注射器：cc；体积：20 mL；流速：250 µL/min（最佳流速），设置方法与步骤 6.2 所述相同。启动注射泵，并将每个出口的穿流液分别收集至不同的 50 mL 管中。
- 使用 100,000 分子量截留浓度管，在 4 °C 条件下以 3,000 x g 将每份穿流液分别浓缩至 100 µL。
- 将浓缩液转移至 0.5 mL 微量离心管中。
- 涡旋震荡浓缩样品 30 秒，然后离心 10 秒。
- 将样品分装，每管转移 25 µL，做好标记后于 -80 °C 冻存以长期保存。
9. 使用条件培养基进行设备测试
- 按照步骤 6.1–6.15 所述准备设备。
- 将细胞在 37 °C、5% CO2 的加湿环境中培养，直至总细胞数达到 1 亿，具体参照 Bajo-Santos 等人20 的方法。将细胞传代至一个 T175 悬浮培养瓶中，加入 100 mL 无血清培养基（补充 2% B-27 血清替代物），在 37 °C、5% CO2 的加湿环境中继续培养 48 小时。
- 收集细胞悬液，在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，以去除细胞。
- 收集上清液，并在 +4 °C 下以 3,000 x g 再次离心 30 分钟，以去除大颗粒和细胞碎片。
- 收集上清液并置于 +4 °C 保存，直至进行分离操作，但保存时间不得超过 3 小时。
- 将样品入口的 5 mL 注射器更换为装有已制备条件培养基的 20 mL 注射器，缓冲液入口更换为装有 20 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 的 20 mL 注射器。
- 按照步骤 7.8 所述设置泵站参数。
- 启动注射泵，分别用独立的 50 mL 离心管收集每个出口的流出液。
- 使用 100,000 分子量截留的浓缩管，在 +4 °C 下以 3,000 x g 将每份流出液分别浓缩至 150 µL。
- 将浓缩液转移至 0.5 mL 微量离心管中。
- 涡旋震荡浓缩样品 30 秒。
- 将浓缩样品短暂离心 10 秒。
- 将样品分装，每管转移 25 µL，标记后于 -80 °C 冻存，用于长期保存。
10. 使用超速离心法分离细胞外囊泡
- 使用固定角转子离心机，在 +4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 20 mL 尿液或条件培养基 70 分钟。
- 弃去上清液，并将沉淀重悬于 20 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 中。
- 再次离心，操作同步骤 10.1 所述。
- 弃去上清液，并将沉淀重悬于 12 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 中。
- 使用水平转子，在 +4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 70 分钟。
- 弃去上清液。
注意：此次弃去上清液时需格外小心，建议使用移液器操作。 - 将沉淀重悬于 100 µL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 中。
- 分装样品后，进入第 12 节进行细胞外囊泡（EV）表征；否则，将样品储存于 -80 °C 待后续使用。
11. 使用尺寸排阻色谱法（SEC）分离EVs
- 使用100 kDa分子量截留值（MWCO）离心过滤装置，在+4 °C、3,000 x g条件下离心15分钟，将20 mL尿液或条件培养基浓缩至500 µL。
- 将浓缩液转移至尺寸排阻色谱柱（SEC柱，上样范围35 nm）。
- 将经20 nm滤膜过滤的PBS加入色谱柱，并收集15个0.5 mL的组分。
- 按照制造商说明书，使用动态光散射（DLS）系统分析各组分。
- 合并选定的组分；选择衰减系数低于11且大于40 nm的颗粒占总颗粒数至少30%的组分。
- 使用3 kDa分子量截留值（MWCO）离心过滤装置，在+4 °C、14,000 x g条件下离心15分钟，将选定组分浓缩至100 µL。
- 分装样品，并进入第12节进行细胞外囊泡（EV）表征；否则，储存于-80 °C备用。
12. 细胞外囊泡表征
- 从冷冻柜中取出待测样品，并在冰块上或 +4 °C 条件下缓慢解冻。
- 进行纳米颗粒追踪分析（NTA）以测定颗粒大小分布及数量13。采用高亲和力T细胞膜蛋白4（TIM-4）双夹心酶联免疫吸附测定法（dsELISA）14，确认样品中外泌体（EV）的存在。
13. 纳米颗粒跟踪分析（NTA）
- 将解冻的EV样本涡旋振荡30秒，离心10秒，然后取1 µL转移至含有999 µL经20 nm滤膜过滤的PBS的2 mL微量离心管中，进行1000倍稀释。另保留1 mL用于稀释的PBS，以检测其中是否含有颗粒物。将所有样品在测量前储存于+4 °C。
注意：使用前需将PBS通过0.02 nm滤膜过滤。 - 将EV样本或空白对照涡旋振荡30秒，用注射器将其注入检测模块。向模块中加入约0.7 mL样本，并将其放入仪器中。
- 按照仪器制造商的操作说明，使用纳米颗粒分析仪对样本进行测量。
14. 针对EV标志物的双抗夹心ELISA
- 配制浓度为 1 µg/mL 的 TIM4-Fc 蛋白溶液。向每个所需孔中加入 100 µL 溶液，于 +4 °C 摇床中以 200 RPM 振荡孵育过夜。
- 次日，配制洗涤液（1× TBS + 0.05% Tween20 + 2 mM CaCl2）。
- 弃去各孔中的全部液体。向每孔加入 200 µL 洗涤液，在室温下以 200 RPM 振荡 5 分钟后弃去液体。重复此步骤两次。
- 配制封闭液（1× TBS + 0.05% Tween20 + 1% 牛血清白蛋白）。向每孔加入 200 µL 封闭液，室温下以 200 RPM 振荡孵育 1 小时。
- 按步骤 14.3 所述方法洗涤各孔。
- 在洗涤缓冲液中配制每种样品稀释液各 220 µL（最佳 EV 浓度为 2.7 × 105 EVs/µL）。每孔加入 100 µL 稀释后的样品，设置两个重复孔。室温下以 200 RPM 振荡孵育 90 分钟。
- 按步骤 14.3 所述方法洗涤各孔。
- 向每孔加入 100 µL 对应的一抗抗体。使用适当的 EV 标记物以确认 EV 及污染物4。室温下以 200 RPM 振荡孵育 2 小时。注意：若使用二抗抗体，则重复步骤 14.7–14.8，但将二抗抗体的孵育时间缩短至 1 小时。
- 按步骤 14.3 所述方法洗涤各孔。
- 向每孔加入 100 µL 辣根过氧化物酶底物，混匀 1 分钟后，室温孵育 30 分钟。
- 向每孔加入 1 M H2SO4 以终止反应。
- 使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。
结果
我们采用3D打印的双负模（图1），通过软光刻技术（图2A）制备了一种微流控装置，用于基于分支场流分离（bifurcated A4F）原理的高通量EV分离（图2B、C）。该装置需要配备泵和流通池站（图3），以实现EV的自动化分离。首先，为验证该装置的概念可行性，我们制备了直径分别为100 nm和1000 nm的聚苯乙烯微球混合物，分别代表囊泡和细小细胞碎片10。对微球混合物在有无分支流条件下，以不同流速进行了实验，以研究线性流速对分离效率的影响。在所有实验中，小尺寸微球的回收率始终保持稳定且高于90%10，表明该装置在EV回收方面具有良好的潜力。
随后，我们评估并比较了 COC-OSTE 装置从复杂生物流体中无需过多预处理即可分离大量（>1 mL）外泌体（EVs）的潜力。为此，采用来自10名健康供体的尿液（图4）以及两种不同前列腺细胞系的细胞培养上清液（图5）作为样本模板，同时采用三种不同方法平行分离 EVs：超速离心法（UC）、尺寸排阻色谱法（SEC）以及基于 A4F 微流控技术的 OSTE-COC 装置。分离后，采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定颗粒总数及其粒径分布。平均而言，与 UC 相比，OSTE-COC 装置从生物流体中回收的总颗粒数更高；但仅当合并两个出口的颗粒数时，差异才具有统计学意义（图4A）。为与其他系统进行性能比较，应将 R 与 L 出口合并考虑。如 图4 所示，L 与 R 出口联合回收 EVs 的性能优于 UC 和 SEC。其中，L 出口设计用于捕获小尺寸 EV 组分，而 R 出口则用于收集较大尺寸 EV 组分及其他尺寸相近的分子。有趣的是，使用 OSTE-COC 装置的 R 出口进行回收的效率略高于单独使用 SEC 或 UC（图4A）。CD63 表达水平也呈现出类似趋势（图4C）。该结果表明，OSTE-COC 装置在总 EV 回收方面更具效率。除 UC 外，不同方法获得的 EV 粒径分布相似，而 UC 的粒径分布更偏向较大颗粒（图4B）。
在细胞培养基培养中也观察到了类似的结果。在两种情况下，与SEC或UC方法相比，该装置两个端口的总颗粒回收率均表现出更优的性能（如图5A、B所示）。值得注意的是，源自PC3细胞的EVs表现出独特的粒径分布特征，与其他实验组相比，L-PORT端口的分布更为均一（图5C、D）。此外，对CD63表达的分析进一步证实了使用COC-OSTE装置可实现更高的EV回收率（如图5E、F所示）。本研究中所比较的不同方法在分离特性方面的总结见表1。
图1：3DP 蛇形双负模具的尺寸与等距视图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：COC-OSTE微流控器件。（A）OSTE-COC器件制备主要步骤示意图。（B）器件工作原理。（C）完成器件的图像。比例尺：15 mm。本图经Priedols等10和Bajo-Santos等20许可修改。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：装置的实验配置。 注射泵位于左侧，OSTE-COC装置位于中间，回收站位于右侧。该图已获许可修改自 Priedols 等人10 和 Bajo-Santos 等人20。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：采用超速离心法（UC）、尺寸排阻色谱法（SEC）和COC-OSTE装置从10名供体尿液中分离的细胞外囊泡（EV）的粒径分布及颗粒回收率。（A）通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定各分离方法回收的颗粒数量。数据以均值±标准差表示。统计学显著性以 * 表示（p<0.05）。（B）箱形图显示通过NTA评估的所有尿液样本中平均颗粒尺寸分布，须线表示最小值和最大值。P值来源于与UC组的比较，**** 表示高度显著性（p<0.0001）。（C）采用双夹心酶联免疫吸附测定法（dsELISA）评估各分离方法回收样本中CD63的平均含量，并计算其在所有样本中的中位数与范围。L-port：左端口；R-port：右端口。本图经Bajo-Santos等20许可修改。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：采用不同方法从PC3和LNCaP细胞中分离的细胞外囊泡（EVs）的表征结果。（A）通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定的从PC3培养基中回收的颗粒数量，以均值±标准差表示。（B）通过NTA测定的从LNCaP细胞培养基中回收的颗粒数量，表示为均值±标准差。（C）通过NTA测定PC3培养物来源EVs的中位颗粒尺寸分布及其范围。（D）从LNCaP培养物中分离的EVs的中位尺寸分布及其范围。（E）采用双夹心酶联免疫吸附测定法（dsELISA）检测每种分离方法获得的PC3细胞系来源EV中CD63表达的中位值及范围。（F）每种分离方法获得的LNCaP来源EV中CD63表达的中位值及范围（通过dsELISA测定）。UC：超速离心；SEC：尺寸排阻色谱；L-port：左端口；R-port：右端口。本图经Bajo-Santos等20许可修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
| UC | SEC | COC-OSTE | |
| 每样本处理时间 | ++/+++ | +++ | + |
| 通量 | ++ | + | +++ |
| 每样本成本 | + | +++ | ++ |
| 纯度 | + | +++ | ++ |
| 自动化程度 | ++ | + | +++ |
| EV 得率 | ++ | ++ | +++ |
| 尺寸选择性 | + | ++ | ++ |
表1. 三种方法（UC、SEC和COC-OSTE装置）分离EVs特性的比较。 UC：超速离心；SEC：尺寸排阻色谱；COC-OSTE：环烯烃共聚物-非化学计量硫醇-烯。+：低；++：中；+++：高。* 取决于装置。
讨论
本文介绍的微流控装置为从生物液体中分离和提取细胞外囊泡（EVs）提供了一种颇具前景的方法，解决了现有金标准方法（如超速离心法UC和尺寸排阻色谱法SEC）的一些关键局限性12。已知UC和SEC方法操作繁琐、耗时较长，且产率较低，因此在需要大量EVs的高通量应用中适用性较差21,22。相比之下，所描述的微流控装置能够以极少的人工干预连续处理多达20 mL的生物液体，有望成为工业或临床环境中的变革性工具。该微流控装置的一个关键优势在于，相较于涉及人工操作的传统方法，它能够实现EV分离过程的标准化并提高可重复性。通过大规模生产减少EV分离装置制造过程中的变异性，可更有效地控制装置性能并保持一致性，这对于基于EV的治疗和诊断应用至关重要。此外，该装置可通过适合的基材进行反应注塑成型，兼容大体积制造，进一步增强了其在规模化生产和广泛应用方面的潜力。
为了确保可重复性和稳定的性能，必须制定详尽且明确的实验方案，以规范芯片的制备及其在实验中的使用。该芯片在设计时已考虑工业化生产的可行性。然而，在实验室环境中进行器件制备时，需特别注意避免气泡的产生，确保键合精确且牢固，并在高于实际实验预期的流速下进行充分测试。这一预防措施对于COC-OSTE器件尤为重要，因为若键合不成功，尤其是在较高流速下，器件容易发生泄漏。此外，由于OSTE是一种光敏材料，器件制备过程应在黄光环境下进行，以避免不必要的紫外光暴露。由于该技术仍处于初期发展阶段，研究人员应尝试不同的流速，以确定其特定应用下的最佳参数设置，因为目前尚未建立针对这一新型方法的标准化操作流程，且根据我们的结果，液体黏度会显著影响EV的分离效率。遵循这些指导原则并解决标准化方面的挑战，将有助于充分发挥该微流控器件在各类科研领域和应用中的潜力。
利用微流控装置分离细胞外囊泡（EV）的方法具有高度可调性和可优化性，便于针对性能进行广泛改进和故障排查。为提高颗粒分离效果，研究人员可尝试更长的通道、不同孔隙率和孔密度的膜材料，以及调整通道尺寸。若小颗粒出口处出现大量大颗粒，可尝试提高缓冲液入口流速；而若大颗粒出口中混有较多小颗粒，则建议尝试更长的通道或使用孔径更大的膜。针对颗粒吸附问题，可通过调节流速、表面修饰、调整OSTE材料组分或改变紫外光曝光时间来解决。对于存在不稳定或泄漏问题的装置，降低流速并确保正确粘合是关键步骤。为尽量减少EV的损伤，研究人员可降低流速、在装置灭菌后更彻底地用PBS洗涤，并考虑采用更小孔径的膜或改进模具设计技术与材料。通过上述优化措施，可对微流控装置进行精细调节，充分释放其在EV研究及相关领域中的广泛应用潜力。此外，为优化装置性能，可在上游对样品进行表征，包括密度和黏度测定，以相应调整流动参数。同时，必须特别关注样品本身的性质，因为生物流体本身已被证实不具备无菌性23。 因此，在临床应用中使用前，应对样品进行灭菌处理予以充分考虑。
尽管存在这些挑战，微流控装置在各个研究领域仍具有巨大的潜力。该装置能够从大量高度异质的样本中持续分离细胞外囊泡（EVs），为自动化创造了条件，有助于实现高通量应用，并推动对来自多种来源的EVs进行更深入的分析。将这一微流控模块整合到不同的设备中，例如中空纤维细胞生物反应器 cartridge 或高分辨率流式细胞仪，可使EVs的应用更贴近工业需求，并推动药物递送、诊断学和化妆品等领域的创新4。总体而言，这一微流控装置代表了EVs研究领域的重要进展，为EVs的分离提供了一种高效且标准化的方法，在广泛的科研和工业应用中展现出广阔前景。
披露
A.A.、G.M. 和 R.R. 是 Cellbox Labs, LLC 的创始人、董事会成员及股权持有者
致谢
感谢所有参与本研究的捐赠者，以及拉脱维亚基因组数据库工作人员提供的样本。拉脱维亚大学固体物理研究所作为卓越中心，获得了欧盟“地平线2020”框架计划H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2（资助协议编号739508）项目CAMART2的资助。本研究得到了拉脱维亚科学委员会项目No. lzp-2019/1-0142和项目No. lzp-2022/1-0373的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 µm 羧酸盐 FluoSpheres | Invitrogen | #F8803 | 储存浓度：3.6 x 1013 个微珠/毫升（依批号而定） |
| 0.5 mL 微型离心管 | Starstedt | 72.704 | |
| 1 mL 鲁尔锥形注射器，一次性使用，不带针头 | 射线 | TUB1ML | |
| 1.0 µm 多苯乙烯荧光微球 | Invitrogen | #F13083 | 储存浓度：1 × 10¹⁰ 个微珠/毫升（依批号而定） |
| 10 mL 血清移液管 | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| 15 mL（100k）Amicon Ultra 离心滤器 | 默克密理博 | UFC910024 | |
| 2.0 mL 蛋白质低吸附管 | Eppendorf | 30108132 | |
| 20 mL 注射器 | BD PlastikPak | 10569215 | |
| 250 µm ID 聚醚醚酮管 | 达尔文微流控 | CIL-1581 | |
| 3 kDa 截留分子量离心过滤装置 | 默克密理博， | UFC200324 | |
| 5 mL 医用注射器（无针头） | 安徽宏宇五洲医疗 | 159646 | |
| 50 mL 一次性离心管 | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 70 Ti 固定角转子超速离心机 | 贝克曼库尔特 | 337922 | |
| 800 µm ID 聚四氟乙烯管 | 达尔文微流控 | LVF-KTU-15 | |
| 96孔微孔板，平底，中等结合力 | Greiner Bio-One | 655001 | ELISA 板 |
| B-27添加剂（50倍浓度），无血清 | 赛默飞世尔科技 | 17504044 | |
| 牛血清白蛋白 | SigmaAldrich | A7906-100G | |
| COC Topas 显微镜载玻片平台 | 微流控芯片店 | 10000002 | |
| COC Topas 显微镜载玻片平台 2 x 16 Mini Luer | 微流控芯片店 | 10000387 | |
| Elveflow OB1 压力控制器 | Elvesys 集团 | ||
| 鲁尔接头 | 达尔文微流控 | CS-10000095 | |
| Suss MA/BA6 掩模对准器 | SUSS MicroTec 集团 | ||
| Mixer Thinky ARE-250 | Thinky Corporation | ||
| NanoSight NS300 | 马尔文帕纳科 | NS300 | 纳米颗粒分析仪 |
| 光学显微镜 Nikon Eclipse LV150N | Nikon Metrology NV | ||
| OSTE 322 水晶透明 | Mercene Labs | ||
| PBS片剂，无钙/无镁，Fisher Bioreagents，100 g | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| PC膜（50 nm孔径，11.8%密度） | it4ip 股份有限公司，比利时，鲁汶-拉-讷夫 | ||
| 无菌培养皿 | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| 等离子体灰化仪 GIGAbatch 360 M | PVA TePla America, LLC | ||
| qEVoriginal/35 nm 柱 | Izon | SP5 | SEC柱 |
| QSIL 216 硅胶弹性体试剂盒 | PP&S | ||
| 树脂增韧型黑色 | Zortrax | ||
| SW40 Ti 摆动转子超速离心机 | Beckman Coulter | 331301 | |
| 注射泵 | DK Infusetek | ISPLab002 | |
| T175 悬浮培养瓶 | Sarstedt | 83.3912.502 | |
| TIM4-Fc 蛋白 | Adipogen LifeSciences | AG-40B-0180B-3010 | |
| TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺） | SigmaAldrich | T0440-100ML | 辣根过氧化物酶底物 |
| Tween20 | SigmaAldrich | P1379-100ML | |
| Optima L100XP 超速离心机 | 贝克曼库尔特 | ||
| 超声波清洗仪 P 60 H | Elma Schmidbauer GmbH | ||
| 通用微孔板分光光度计 | Bio-Tek 仪器 | 71777-1 | |
| 尿液采集杯，150 mL，无菌 | APTACA | 2120_SG | |
| Whatman Anotop 25 注射器滤器 | SigmaAldrich | 68092002 | |
| Zetasizer Nano ZS | 马尔文帕纳科 | 动态光散射（DLS）系统 | |
| Zortrax Inkspire | Zortrax |
参考文献
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