本文介绍一种磁分离辅助的高速均质化方法，用于大规模制备来源于内体的纳米囊泡，作为一种新型的外泌体模拟物（EMs），其具有与天然细胞外囊泡（EVs）相同的生物学来源，以及相似的结构、形态和蛋白质组成。
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本文内容
摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）在生理与病理研究、疾病诊断和治疗中已受到广泛关注；然而，由于缺乏可放大的生产工艺，其临床转化受到限制。因此，本方案提供了一种磁分离辅助的高速均质化方法，用于大规模制备来源于内体的纳米囊泡，作为一类新型的内体来源外泌体模拟物（EMs），其产量约为传统超速离心方法的100倍。在该方法中，磁性纳米颗粒（MNPs）通过内吞作用被亲代细胞摄取，并随后在其内体中富集。然后，通过低渗处理和磁分离收集并纯化载有MNPs的内体。利用高速均质器将载有MNPs的内体破碎为单分散的纳米囊泡。所获得的内体来源囊泡具有相同的生物学来源和结构，可通过纳米颗粒追踪分析、透射电子显微镜和蛋白质印迹法进行表征。其形态和蛋白质组成与天然EVs相似，表明EMs有望成为用于临床转化的低成本、高产量的天然EVs替代物。
引言
细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有细胞分泌的微小囊泡，大小范围为30-150 nm，含有丰富的生物活性物质。根据来源细胞的不同，EVs表现出高度异质性，具有多种源自亲代细胞的特异性成分1。EVs被释放到体液中，并可转运至远端部位，被靶细胞摄取后发挥功能2，这一特性可用于递送多种生物活性分子和药物，应用于组织修复、肿瘤诊断与治疗以及免疫调节3,4。然而，体液中其他具有相似生物物理特性的生物纳米颗粒（如脂蛋白）和纳米囊泡（如非内体来源的EVs）不可避免地会影响EVs的分离与纯化。迄今为止，超速离心法仍是EVs分离的金标准，此外还发展了蔗糖密度梯度离心、超滤、聚乙二醇沉淀、层析以及免疫磁珠分离等多种分离方法5。目前限制EVs治疗产品临床转化和商业化的主要瓶颈在于缺乏能够实现高通量、可重复分离EVs的技术6,7,8。传统的EVs分离技术（如超速离心和尺寸排阻层析）存在产率低（1 × 107–1 × 108/1 × 106 个细胞）、生....
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方案
注意：该方法的示意图见图1。
1. 透射电镜样品制备与分离
- 磁性纳米颗粒的细胞内化
- 细胞培养
- 重悬 1 × 106 大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）、293T细胞或小鼠卵巢上皮癌细胞（ID8），置于含10%胎牛血清（FBS）和5%青霉素-链霉素溶液（P/S）的DMEM完全培养基中，每六孔板加入2 mL（参见 材料表).
- 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞过夜2.
注意：贴壁后细胞数量约为 1 × 106.
- 磁性纳米颗粒的内吞作用
- 将每个六孔板中的培养基体积减少至1 mL。用10 nm聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒（IONPs）与细胞共培养（参见 材料表) 浓度为 100 µg/1 × 106 细胞并在含5% CO₂的环境中37 °C孵育2 孵育12小时，以使细胞充分内吞IONPs。
- 细胞培养
- 内体的分离与匀浆化
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结果
通过磁分离辅助高速均质化制备胞外囊泡模拟物（EM）的工作流程如图1所示。细胞通过内吞作用将10 nm的聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒（IONPs）摄入，并特异性地富集于内体中（图3A）。经低渗缓冲液处理并进行匀浆后，负载IONPs的内体从细胞中释放，并通过磁分离进行收集。分离得到的内体进一步通过高速均质化重新构建为单分散的纳米囊泡，即EMs。我们探索了多个关键参数（如均质化速度和时间），以确定最优的EM制备条件（图2）。最终，综合考虑所制备EMs的粒径和产率，选择140 × g 的均质速度处理5分钟作为优化条件。游离的IONPs以及负载IONPs的EMs通过第二轮磁分离从终产物溶液中去除，从而获得不含IONPs的EMs。该方法可从亲代细胞的内体高效制备出高度均一且单分散的纳米囊泡，其生物学来源与天然细胞外囊泡（EVs）相同。
为了将超速离心法获得的细胞外囊泡（EVs）与本方法生成的细胞膜囊.......
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讨论
作为无细胞治疗的替代方案和纳米级药物递送系统，细胞外囊泡（EVs）尚未达到其临床预期，主要障碍之一是缺乏可规模化且可重复的生产与纯化方法6。因此，已开发出多种类型的细胞膜囊泡（EMs）作为具有类似生物学复杂性的EV类似物14。迄今为止，最常用的EM实例是来源于细胞质膜的纳米囊泡。此类纳米囊泡可通过直接挤出完整亲代细胞而相对简便地制备17。然而，由于存在两个缺陷，来源于细胞质膜的纳米囊泡无法真实再现天然EVs：第一，这些纳米囊泡的生物学来源为细胞质膜，其脂质和蛋白质组成与天然EVs存在差异；第二，存在来自非EV细胞器及细胞碎片的蛋白质、核酸和脂质等污染物，导致EM不可避免地具有异质性。在本方法中，我们先将细胞与氧化铁纳米颗粒（IONPs）共孵育，通过磁性分离收集载有IONPs的内体，再通过高速均质化生成单分散的纳米囊泡，最后通过第二轮磁性分离获得不含IONP的EMs。此外，我们通过探究不同参数（如均质化速度和时间）对EM大小和产率的影响，优化了EM的制备条件。该方案利用了一个有趣的生物学现象：磁性.......
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披露
D.W. 和 P.G. 是由中国科学院基础医学与癌症研究所（IBMC）提交的一项专利申请的共同发明人。其他作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者感谢中国科学院基础医学与癌症研究所（IBMC）共享仪器核心设施提供的仪器支持。本研究得到国家自然科学基金委员会（NSFC；82172598）、中国浙江省自然科学基金（LZ22H310001）、中国浙江省卫生健康委员会551卫生人才培养项目、杭州市科学技术局农业与社会发展研究项目（2022ZDSJ0474）以及钱塘交叉学科研究基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Annexin 抗体 | ABclonal | A11235 | Western 印迹 |
| BCA 检测试剂盒 | Beyotime | P0012 | 蛋白浓度测定 |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western 印迹 |
| CD63 抗体 | ABclonal | A19023 | Western 印迹 |
| 用于 Western 印迹和免疫沉淀的细胞裂解液 | Beyotime | P0013 | Western 印迹 |
| 离心机 | Beckman | Allegra X-30R | 细胞离心 |
| CO2 培养箱 | Thermo | 细胞培养 | |
| 共聚焦激光扫描荧光显微镜 | NIKON | A1 HD25 | 荧光图像拍摄 |
| DMEM 基础培养基 (1x) | GIBCO | C11995500BT | 细胞培养 |
| 动态光散射 (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | 粒径分析 |
| 电动玻璃匀浆器 | SCIENTZ(中国宁波) | DY89-II | 低速匀浆 |
| 外泌体去除型 FBS | System Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | 细胞培养 |
| 高速匀浆器 | SCIENTZ(中国宁波) | XHF-DY | 高速匀浆 |
| 磁力架 | 拓恒机电科技(中国上海) | NA | 磁性分离 |
| 通用细胞膜标记用 PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒 | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | 试剂盒包含溶于乙醇的 PKH26 细胞连接剂和稀释液 C |
| 聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒 (IONPs) | 中科创明技术(中国北京) | Mag1100-10 | 细胞培养 |
| 氯化钾 | 阿拉丁 | 7447-40-7 | 细胞低渗处理 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Beyotime | P1030 | 蛋白酶抑制 |
| 柠檬酸钠 | 阿拉丁 | 7447-40-7 | 细胞低渗处理 |
| 透射电子显微镜 (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | 形态学成像 |
| 超速离心机 | Beckman | Optima XPN-100 | 外泌体离心 |
| ZetaView 纳米颗粒 追踪分析仪 | Particle Metrix | PMX120 | 纳米颗粒追踪分析 |
参考文献
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977(2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).....
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重印与许可
