在冷冻电子显微镜（cryoEM）载网上应用支撑层可提高颗粒密度，限制颗粒与气液界面的相互作用，减少电子束诱导的运动，并改善颗粒取向的分布。本文介绍了一种在cryoEM载网上涂覆单层石墨烯以改进冷冻样品制备的可靠方案。
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方法文章
单层石墨烯在冷冻电子显微镜载网中的应用以实现高分辨率结构解析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在冷冻电子显微镜（cryoEM）技术中，纯化的生物大分子被施加到带有穿孔碳膜的载网上；随后通过吸除多余液体，并迅速冷冻形成厚度约为20–100 nm的玻璃态冰层，使分子悬浮于宽度约为1 µm的碳膜孔洞中。将制备好的样品置于低温透射电子显微镜下成像，再通过合适的软件进行图像处理，即可获得接近原子分辨率的结构信息。尽管cryoEM已被广泛采用，样品制备仍是当前cryoEM工作流程中的主要瓶颈，用户常遇到样品在悬浮的玻璃态冰层中行为不佳的问题。近年来，已发展出在cryoEM载网上修饰单层连续石墨烯的方法，该石墨烯层可作为支撑表面，通常能提高成像区域的颗粒密度，并减少颗粒与气液界面之间的相互作用。本文提供了将石墨烯应用于cryoEM载网的详细实验方案，以及快速评估所得载网相对亲水性的方法。此外，我们还描述了一种基于电镜的方法，通过观察石墨烯特有的衍射图样来确认其存在。最后，我们通过使用浓度相对较低的纯样品，快速重构出Cas9复合物在2.7 Å分辨率下的密度图，展示了此类石墨烯支撑载网的实际应用价值。
引言
单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）已发展成为一种广泛用于可视化生物大分子的方法1。在直接电子探测技术2,3,4、数据采集5以及图像处理算法6,7,8,9,10不断进步的推动下，cryoEM 目前已能够对数量迅速增长的大分子复合物解析出接近原子分辨率的三维结构11。此外，利用该方法所具有的单分子特性，研究者可以从同一样品中解析出多种结构12,13,14,15，凸显了利用所获得数据解析结构异质性集合的潜力
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方案
1. 化学气相沉积石墨烯的制备
- 按以下步骤制备石墨烯刻蚀溶液。
- 在50 mL烧杯中，将4.6 g过硫酸铵（APS）溶于20 mL分子级水中，配制成1 M溶液，并用铝箔覆盖。在进行步骤1.2的同时，确保APS完全溶解。
- 准备一段化学气相沉积（CVD）石墨烯用于甲基丙烯酸甲酯（MMA）涂覆。小心地裁剪出一块方形CVD石墨烯。将该方形样品转移至洁净培养皿中的盖玻片（50 mm × 24 mm）上，并在运送至旋涂仪过程中加以覆盖。
注意：一个18 mm × 18 mm的方形样品可制备出25–36个石墨烯包被的载网。
2. 用MMA涂覆CVD石墨烯
- 将旋涂仪的参数设置为高速旋转60秒，转速为2,500 rpm。小心地将CVD石墨烯放置在尺寸合适的卡盘上。
注意：理想情况下，CVD石墨烯应超出所选卡盘边缘1–2 mm，以防止甲基丙烯酸甲酯（MMA）被吸入真空系统。 - 按下取用/吸附按钮以启动真空泵，将CVD石墨烯固定在卡盘上。将MMA滴加至CVD石墨烯方片的中心，盖上盖子，并立即按下开始/停止按钮。对于18 mm × 18 mm的CVD石墨....
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结果
采用本文所述设备（图1）和方案（图2）成功制备石墨烯包覆的冷冻电镜载网后，可在金属箔孔洞上形成单层石墨烯，其特征衍射图样可用于确认。为促进蛋白质在石墨烯表面的吸附，可采用紫外/臭氧处理，在石墨烯表面引入含氧官能团，使其具有亲水性。然而，空气中的碳氢污染物可在紫外/臭氧处理后5分钟内即吸附至石墨烯表面，从而抵消该效果38,39。值得注意的是，紫外/臭氧处理的持续时间以及处理后至 plunge 冷冻前的时间间隔均会影响样品质量。我们通过一种基于表面接触角评估包覆载网亲水性的简便方法展示了这些影响（图3；见步骤12）。
为了展示石墨烯载网在单颗粒冷冻电镜（cryoEM）中的应用，我们将一种无催化活性的RNA引导型DNA内切酶S. pyogenes Cas9（H10A；C80S；.......
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讨论
冷冻电镜（CryoEM）样品制备涉及诸多技术挑战，大多数实验流程要求研究人员极其小心地手动操作脆弱的载网，以避免造成损伤。此外，任何样品是否适合玻璃化冷冻都难以预测；颗粒常常与气液界面或覆盖在载网表面的固体支撑膜发生相互作用，这可能导致颗粒出现优势取向，或无法进入成像孔洞，除非使用非常高的蛋白浓度24。在有孔的CryoEM载网上覆盖一层连续的单层石墨烯，已被证明在改善显微照片中颗粒分布、提高低浓度下的颗粒数量，以及减少因气液界面相互作用导致的优势取向方面具有巨大潜力30。
现有用于冷冻电镜载网的石墨烯包被方案存在一个局限性，即包被过程需要大量手动操作，这可能影响包被质量并增加载网之间的变异性。在本研究中，我们对已有方案进行了轻微改进，用于在冷冻电镜载网上包被单层石墨烯30。
本方案中的关键步骤包括：在CVD石墨烯上涂覆MMA，使用APS溶解CVD石墨烯的铜基底，以及将石墨烯转移至冷冻电.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
样品在MIT.nano的冷冻电镜设施中制备并成像，所用显微镜由Arnold和Mabel Beckman基金会资助购置。接触角成像设备在MIT Metropolis创客空间打印完成。我们感谢颜宁（Nieng Yan）实验室和韩一模（Yimo Han）实验室以及MIT.nano工作人员在本方法应用过程中提供的支持。特别感谢高冠慧（Guanhui Gao）博士和Sarah Sterling博士富有洞见的讨论与反馈。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金R01-GM144542、5T32-GM007287以及美国国家科学基金会（NSF）CAREER基金2046778的支持。Davis实验室的研究还获得了阿尔弗雷德·P·斯隆基金会、James H. Ferry基金、MIT J-Clinic以及Whitehead家族的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 250 mL 烧杯（3个） | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL 烧杯（2个） | Corning | 1000-50 | |
| 丙酮 | Fisher | A949-4 | |
| 铝箔 | Fisher | 15-078-292 | |
| 过硫酸铵 | Fisher | (I17874 | |
| 50 mm × 24 mm 盖玻片 | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| 化学气相沉积石墨烯（CVD graphene） | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow 放电仪 | Ted-Pella | 91000S | |
| 乙醇 | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| 平头镊子 | Fisher | 50-239-60 | |
| 玻璃切割刀 | Grainger | 21UE26 | |
| 玻璃培养皿及盖子 | VWR | 75845-544 | |
| 玻璃血清移液管 | Fisher | 13-676-34D | |
| 载网储存盒 | EMS | 71146-02 | |
| 加热板 | Fisher | 07-770-108 | |
| 异丙醇 | Sigma | W292907 | |
| 吸水纸（Kimwipe） | Fisher | 06-666 | |
| 实验室剪刀 | Fisher | 13-806-2 | |
| 甲基丙烯酸甲酯 EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| 分子生物学级水 | Corning | 46-000-CM | |
| 负向操作镊子（2个） | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 移液器 | Rainin | 17014392 | |
| P200 移液器 | Rainin | 17008652 | |
| 封口膜（Parafilm） | Fisher | 13-374-12 | |
| 移液器吸头 | Rainin | 30389291 | |
| 带多孔碳膜的 Quantifoil 载网 | EMS | Q2100CR1 | |
| 旋涂仪 | SetCas | KW-4A | 配卡盘 SCA-19-23 |
| 直尺 | ULINE | H-6560 | |
| 温度计 | Grainger | 3LRD1 | |
| 紫外/臭氧清洗仪 | BioForce | SKU: PC440 | |
| 真空干燥器 | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| 沃特曼滤纸（Whatman paper） | VWR | 28297-216 |
参考文献
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife
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