利用人工寄主从寄生蜂Trichogramma dendrolimi中提取毒液

摘要

本文介绍了一种利用聚乙烯薄膜和氨基酸溶液制备的人工寄主提取Trichogramma dendrolimi毒液的实验方案。

摘要

寄生蜂是一类多样化的膜翅目昆虫，作为害虫生物防治的宝贵资源具有重要意义。为了确保成功寄生，寄生蜂会向宿主体内注入毒液，以抑制宿主的免疫反应，并调控其发育、代谢甚至行为。据估计，寄生蜂的物种数量超过60万种，其多样性远超其他有毒动物，如蛇类、芋螺和蜘蛛。寄生蜂毒液是一种尚未充分开发的生物活性分子来源，在害虫防治和医学领域具有潜在应用价值。然而，由于无法采用直接刺激或电刺激方式取毒，且因其体型微小导致解剖困难，寄生蜂毒液的采集极具挑战性。Trichogramma 是一类体型微小（约0.5 mm）的卵寄生蜂，广泛应用于农业和林业中鳞翅目害虫的生物防治。本文报道了一种利用人工宿主提取 T. dendrolimi 毒液的方法。该人工宿主由聚乙烯薄膜和氨基酸溶液制成，并接种 Trichogramma 寄生蜂以完成寄生过程。随后收集并浓缩毒液。该方法能够大量提取 Trichogramma 毒液，同时避免了传统毒囊解剖过程中常见的组织污染问题。这一创新方法为研究 Trichogramma 毒液提供了便利，推动了相关新研究及潜在应用的发展。

引言

寄生蜂是一类具有寄生性的膜翅目昆虫，在生物防治中具有重要的资源价值¹。寄生蜂种类繁多，估计物种数量超过60万种²。其多样性远超其他有毒节肢动物，如蛇类、芋螺、蜘蛛、蝎子和蜜蜂。毒液是寄生蜂实现寄生的重要因子之一。为了成功寄生，寄生蜂会将毒液注入宿主体内，调控宿主的行为、免疫、发育和代谢过程³。此外，寄生蜂毒液在分子结构、作用靶点和生物学功能方面表现出显著的多样性，反映了其与宿主之间复杂的协同进化关系。因此，寄生蜂毒液是一种宝贵但尚未被充分重视的活性分子资源，可用于杀虫剂开发或医学用途⁴。与蛇类、芋螺、蜘蛛、蝎子和蜜蜂的毒液不同，寄生蜂毒液无法通过直接刺激或电刺激的方式采集⁵。目前提取寄生蜂毒液的主要方法是解剖毒液囊。然而，寄生蜂个体通常较小，对其解剖操作需要较高的技术水平。因此，若能建立一种高效且便捷的寄生蜂毒液采集方法，将极大促进寄生蜂毒液的研究。

Trichogramma（膜翅目：赤眼蜂科）是一类微小的（体长约0.5 mm）寄生蜂⁶。这类寄生蜂是应用最广泛的生物防治制剂之一，尤其用于防治农业和林业中多种鳞翅目害虫的卵。例如，在中国广泛应用的赤眼蜂种类之一——T. dendrolimi，已被大量用于防控多种农林害虫，如Dendrolimus superans、Ostrinia furnacalis和Chilo suppressalis。先前的研究表明，Trichogramma寄生蜂可将其卵注入人工寄主中⁷。人工寄主可由石蜡⁸、琼脂⁹、Parafilm膜¹⁰或塑料薄膜¹¹等材料制成。在人工寄主中，能够有效诱导Trichogramma产卵的溶液成分可十分简单，例如氨基酸或无机盐¹²。基于T. dendrolimi能够寄生人工寄主的特性，本研究提出一种利用人工寄主提取寄生蜂毒液的新方法。该方法旨在克服当前提取技术中产量低、纯度低以及易受污染等缺陷。通过该方法，可大量提取高纯度的T. dendrolimi毒液，满足科学研究以及杀虫或医学用途生物活性分子筛选的需求。

方案

1. 昆虫饲养

1. 喂养 Corcyra cephalonica 在26 ± 1°C温度和40% ± 10%相对湿度条件下，以玉米粉为培养基质。
2. 品种 T. dendrolimi 使用吉林昆虫饲养室室内饲养的卵来源的品系 Corcyra cephalonica 作为宿主. 用10%蔗糖水喂养成年黄蜂 黑腹果蝇 在温度26 ± 1 °C、相对湿度70% ± 10%、光周期（L）: 暗周期（D）为14小时:10小时的条件下培养试管。

2. 聚乙烯塑料薄膜卵卡的制备

1. 取一块长度为 16 cm、宽度为 12 cm、厚度为 20 µm 的聚乙烯塑料薄膜。使用玻璃研磨棒按照标准 96 孔 PCR 板布局压出 30 个直径为 2–3 mm、高度约为 3 mm 的半球形凸起。
   注意：使用玻璃研磨棒压出 30 个半球形凸起时需注意施加的压力，压力过大可能刺穿塑料薄膜，导致提取无毒的研磨棒被污染。
2. 将压制成型的聚乙烯塑料薄膜两面暴露于紫外（UV）光下照射 1 小时，进行消毒。
3. 在半球形表面加入少量 10% 聚乙烯醇。

3. Trichogramma dendrolimi 寄生作用

1. 使用 CO₂ 麻醉后，将 T. dendrolimi 雌性成蜂放入收集盒中，蜂数约为 3000 头。
2. 将薄膜卵卡的凸面朝向收集盒，并用橡皮筋固定边缘。
3. 在每个半圆形突起处添加 4 µL 氨基酸溶液（6 g/L 亮氨酸、4 g/L 苯丙氨酸、4.25 g/L 组氨酸），然后覆盖一张长 16 cm、宽 12 cm 的平展聚乙烯塑料薄膜。用橡皮筋将两层塑料膜紧密覆盖在收集盒上。
4. 让 T. dendrolimi 成蜂自由寄生 4–8 小时，并通过湿润的棉球提供 10% 蔗糖水。

4. 收集T. dendrolimi 毒液

1. 从人工卵卡的内突起处获取寄生氨基酸溶液，并转移至1.5 mL离心管盖中。
2. 用直径为25 mm、孔径为10 µm的尼龙网覆盖管盖，将尼龙网与离心管紧密固定。将离心管直立放置，使用小型离心机进行短时离心（1360 × g，10 s），收集滤过液（约100 µL的T. dendrolimi毒液）。
3. 使用双辛可宁酸（BCA）检测试剂盒（材料表）测定收集的T. dendrolimi毒液浓度。
4. 将毒液于-80 °C保存，用于后续分析。

5. SDS-PAGE 分析

1. 将 30 µL 的 T. dendrolimi 毒液加入 10 µL 的 4x 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液（材料表）中，在 95 °C 下加热 10 分钟。
2. 以 130 V 电压进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，持续 120 分钟。
3. 使用蛋白质染色装置（材料表）对 SDS-PAGE 凝胶进行染色和脱色。

结果

采用蛋白检测试剂盒测定代表性毒液样品的蛋白浓度，结果如表1所示。结果显示，通过该方法收集的毒液蛋白浓度范围为0.35 µg/µL至0.46 µg/µL，而氨基酸溶液的阴性对照组蛋白浓度仅为0.03 µg/µL至0.05 µg/µL。该方法收集的毒液蛋白浓度显著高于阴性对照组，表明该方法能够有效收集寄生蜂毒液。此外，寄生时间与蛋白浓度之间无明显相关性，因为不同批次的寄生蜂可能具有不同的活力。

此外，通过 SDS-PAGE 分析了 T. dendrolimi 的毒液，结果显示其毒液蛋白的分子量范围从低于 10 kDa 到超过 130 kDa（图 1）。然而，当对氨基酸阴性对照进行 SDS-PAGE 分析时，发现其中不含任何蛋白质（补充图 1），这进一步证明通过该方法收集的蛋白确实是寄生蜂的毒液蛋白。

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讨论

本文介绍了一种利用人工寄主提取T. dendrolimi毒液的方法。毒液采集实验的关键要点如下。（1）在制备过程中，必须使用适当浓度的CO₂对T. dendrolimi进行快速麻醉。若CO₂浓度过低，则不足以迅速麻醉Trichogramma；反之，若浓度过高，可能导致Trichogramma死亡，从而降低其对人工寄主的寄生能力。（2）必须确保氨基酸溶液的无菌性，因为溶液污染可能对寄生效率产生不利影响。（3）人工卵卡的寄生操作应在黑暗条件下进行，以促进寄生行为。（4）建议直接进行后续实验，或立即将样品冷冻，以保持毒液活性并防止降解。

建议通过观察产下的卵来判断寄生情况。若在显微镜下未观察到产卵，则可能未成功提取毒液。该技术的局限性在于需要大量寄生蜂。单次毒液提取约需3,000只寄生蜂，增加了工作量。

先前提取寄生蜂毒液的方法是解剖毒液囊。然而，寄生蜂体型微小；例如，Trichogramma 的体长...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 μm 尼龙网	Millipore	NY1002500	用于过滤卵
10% 聚乙烯醇	Aladdin	P139533	用于吸引  T. dendrolimi  产卵
10% 蔗糖水	国药集团化学试剂	10021463	饲喂 Trichogramma dendrolimi
4x LDS 上样缓冲液	Ace Hardware	B23010301	SDS-PAGE
收集盒	Deli	8555	用于 T. dendrolimi 寄生
Future PAGE  4–12% (12 孔)	Ace Hardware	J70236502X	SDS-PAGE
GenScript eStain L1 蛋白染色仪	GenScript	L00753	SDS-PAGE
玻璃研磨棒	Applygen	tb6268	半圆形突起结构
L-亮氨酸	Solarbio	L0011	人工寄主组分
L-组氨酸	Aladdin	A2219458	人工寄主组分
L-苯丙氨酸	Solarbio	P0010	人工寄主组分
微型离心机	Scilogex	D1008	离心
MOPS-SDS 电泳缓冲液	Ace Hardware	B23021	SDS-PAGE
Omni-Easy 即用型 BCA 蛋白检测试剂盒	上海雅酶生物医药科技	ZJ102	用于测定毒液蛋白浓度
96 孔 PCR 板布局	Thermo Fisher	AB1400L	半圆形突起结构
聚乙烯塑料薄膜	苏州奥庞贸易	001c5427	人工卵卡
预染色蛋白 Marker (10–180 kDa)	伊菲克生物技术	YWB007	SDS-PAGE
橡胶圈	广州千睿生物科技	009	固定塑料薄膜与收集盒
硅胶垫片，96 孔，圆孔型	生工生物	F504416-0001	半圆形突起结构