饮食诱导的肥胖糖尿病小鼠的十二指肠-空肠搭桥手术

肥胖和 2 型糖尿病是世界上最常见的慢性疾病，其患病率在年轻人中呈上升趋势¹。减肥手术是治疗肥胖和糖尿病的最有效方法，可促进长期血糖稳定，同时还可以改善与肥胖相关的并发症 ^2,3。减肥手术有几种类型，根据它们是否减少胃容量或肠道吸收进行分类;这些包括限制性、吸收不良和组合性 ^4,5。

十二指肠-空肠旁路术 （DJB） 最初由 Rubino 和 Marescaux 开发，他们证明可以通过连接十二指肠和空肠而不是通过减少胃容量来缓解 2 型糖尿病 ^6,7。DJB 保留整个胃并绕过整个十二指肠和近端空肠。肠道分为胆胰、消化和总肢 ^6,8。DJB 与减肥手术有一些相似之处，包括 Roux-en-Y 胃旁路术 （RYGB）、微型胃旁路术、胆胰旁路术、十二指肠分流术和 DJB 加袖状胃切除术⁹。与 RYGB 相比，DJB 不需要胃肠道吻合，这减少了手术时间并提高了手术成功率。DJB 在改善葡萄糖代谢方面与 RYGB 相似，但不影响体重¹⁰。DJB 手术后，将食物快速输送到远端小肠会刺激胰高血糖素样肽-1 （GLP-1） 的分泌，从而改善葡萄糖代谢 ^11,12。

使用动物模型对于了解代谢、细胞和分子途径至关重要。减肥手术的动物模型有助于我们了解肥胖和糖尿病的潜在机制^13,14。然而，由于物种之间的生理差异，不可能在动物模型中完美复制人类疾病¹⁵。在可用于研究目的的各种动物模型中，饮食诱导的肥胖 （DIO） 小鼠模型与人类肥胖和代谢综合征最相似¹⁶。选择小鼠进行 DJB 手术，以确定手术的可行性并为进一步研究提供技术。本手稿全面总结了 DJB 手术的技术方面和实验细节。

以下描述的所有协议步骤均遵循南方战区司令部总医院动物护理和使用委员会的指导方针，批准编号为 2020112501。

1. 一般术前准备

注意:购买了 30 只 6 周龄雄性 C57BL/6 小鼠。将小鼠饲养在无特异性病原体 （SPF） 实验室中，在 12 小时的光照/黑暗循环下;温度，22 ± 2 °C;湿度为 55-65%。小鼠自由饮水并喂食 60% kcal 脂肪饮食 6 周以诱导肥胖。腹腔注射 40 mg/kg 链脲佐菌素 5 天以诱导糖尿病¹⁷。在 30 只小鼠中，随机筛选 22 只小鼠血糖> 300 mg/dL，并随机分为 DJB （n=15） 和假手术 （n=7） 组。8 只小鼠因血糖不合格而被排除在实验之外。

1. 手术前将小鼠禁食 8 小时。手术前 2 小时撤水。
2. 腹膜内注射 1% 戊巴比妥钠溶液 （6 mL/kg） 和丁丙诺啡 （1 mg/kg）。用镊子触摸老鼠的脚趾或尾巴，确保老鼠没有出现任何明显的抽搐或晃动。在充分麻醉下，小鼠可以在没有补充氧气的情况下自由呼吸。
3. 将小鼠仰卧在无菌板上和立体显微镜下。将眼药膏涂抹在眼睛上。在整个过程中使用电热毯让老鼠保持温暖。使用无菌操作，包括手术衣、无菌手套和高压灭菌器械。
4. 在假对照小鼠中，分别在幽门下方 1 cm 的十二指肠和 Treitz 下方 5 cm 的空肠中做两个切口，然后缝合切口。

2. 十二指肠空肠搭桥术:外科手术

1. 将剑突的脱毛膏涂抹在腹部，以去除该区域的毛发。擦去面霜，确保皮肤干净。用碘和酒精溶液交替擦洗该区域 3 次。
2. 用无菌窗帘盖住鼠标，让手术区域暴露在外，并从剑突到腹部做一个 2 厘米的切口。
3. 使用腹部牵开器露出腹腔。用湿棉签推开腹部脂肪，将肝脏移至头部侧，以完全暴露胃和肠道。
4. 胃和幽门位于肝脏下方，Treitz 韧带位于十二指肠远端。用 6-0 丝缝合线双结扎空肠，位于 Treitz 韧带远端 5 cm 处（图 1A）。在两个结扎的中点切开空肠，并用 10-0 丝缝合空肠残端（图 1B）。
   注意:避免扭曲肠系膜血管。
5. 沿肠道将近端空肠切口拉至空肠 5 cm，形成空肠-空肠吻合。将两条肠子水平对齐，然后使用 10-0 丝缝合线进行侧吻合（图 1C）。
   注意:手术期间，用生理盐水保持肠道湿润以减少水分流失。这将防止肠道卷曲并使缝合更容易。
6. 固定肠道的两端并将切口切成相等的长度（图 1D）。用全层连续缝合缝合后肠壁的第二层。
   注意:切口长度约为 0.5-0.6 厘米，针距为 ~0.5 毫米。
7. 固定肠道两端并缝合肠前壁。用简单的连续缝合线缝合前壁的第一层，用水平内翻缝合第二层（图 1E-F）。
   注意:用棉签擦拭肠道内容物，以防止腹腔感染。
8. 将远端空肠切口拉入幽门下方 1 cm 处的十二指肠，以创建十二指肠-空肠吻合术（图 1G）。使用与步骤 2.6-2.7 相同的方法缝合它（图 1H-K）。
   注意:检查吻合口角的缝合线以减少吻合口渗漏。
9. 用微型镊子连接肠道，然后用微型剪刀剪断肠道。用 6-0 丝缝合线双结扎十二指肠，距十二指肠-空肠吻合口的远端 2 毫米。用微型剪刀在中点剪开，并用 10-0 丝缝合线缝合残端（图 1L）。
   注意:胃十二指肠血管垂直于胰头分支，并与幽门相邻，需要仔细探查横切面的血管。找到了胆总管和十二指肠的汇合处，注意不要损伤胰腺或胆总管。
10. 用 30 °C 盐水冲洗腹腔。将肠道返回腹腔。用 6-0 丝绸分别缝合肌肉和皮肤。然后，用碘伏对皮肤进行消毒。
11. 手术后，在背部皮下注射 30 °C 生理盐水 （30 mL/kg） 以防止脱水。肌肉注射青霉素 （10 mg/kg） 以防止感染。

图 1:十二指肠-空肠旁路手术。 （A） 空肠位置 Treitz 韧带远端 5 cm。（B） 用 6-0 丝对空肠进行双重结扎，切开结扎线的中间。（C） 空肠-空肠吻合术。（D） 切开 0.5-0.6 cm，缝合后壁。（E-F）完全空肠-空肠吻合术。（G） 将远端空肠拉至幽门下方 1 cm 处的十二指肠。（H） 十二指肠-空肠吻合术。（I） 用 0.5-0.6 cm 的切口切开十二指肠-空肠吻合口，并用简单的连续缝合线缝合后壁。（J-K）完全十二指肠-空肠吻合术。（L） 在从十二指肠-空肠吻合口远端到 2 mm 处，用 6-0 丝双结扎十二指肠并切开结扎线的中间。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 一般术后护理

1. 手术后，将小鼠放在电热毯上以防止体温过低。让老鼠自由爬行，直到完全清醒，然后再回到笼子里。
2. 术后当天，限制食物和水，皮下注射 2 mL 生理盐水到小鼠背部。术后第一天，不吃东西，给 10 mL 10% 葡萄糖和功能性饮料（比例 1:1），皮下注射 1 mL 生理盐水。
3. 在术后第 2 天和第 3 天，用 20 mL 10% 葡萄糖和功能性饮料的混合物喂养小鼠。第四天后，给小鼠纯净水和高脂肪饮食。应根据术后恢复状态按以下顺序进行过渡喂养:溶液、半液体或固体食物。
4. 术后镇痛:从第 1 天到第 3 天每 12 小时注射丁丙诺啡 （0.1 mg/kg），然后每天一次，直到第 5 天。
5. 手术后，观察小鼠的摄食条件、活动、粪便和伤口愈合情况。

图 2:DJB 手术示意图。 （A） 十二指肠-空肠吻合术。（B） 空肠-空肠吻合术。（C） 胆胰肢体。（D） 消化肢。（E） 共同肢体。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:DJB 手术解剖。 （A） 十二指肠-空肠吻合术。（B） 空肠-空肠吻合术。（C） 胆胰肢体。（D） 消化肢。（E） 共同肢体。 请单击此处查看此图的较大版本。

4. 术后代谢参数评估

1. 体重测量
   1. 测量前将小鼠禁食 8 小时。每周一在手术前后称量小鼠，持续 8 周。
2. 食物摄入量测量
   1. 每个笼子里放一只老鼠。在 24 小时前后测量每个笼子中的固体食物量。两个值之间的差异代表每日食物摄入量。
3. 随机血糖测量
   1. 在每周一次的测量星期一上午 8:00，从小鼠尾巴的尖端收集一滴血，并将其涂抹在插入血糖仪的葡萄糖条上。
4. 口服葡萄糖耐量试验
   1. DJB 手术后 8 周，在口服葡萄糖耐量试验前将小鼠禁食 8 小时。从小鼠尾巴的尖端收集一滴血，并将其放在插入血糖仪的葡萄糖条上。口服 20% D-葡萄糖 （2 g/kg）。测量灌胃后 0、15、30、60、90、120、150 和 180 分钟的血糖水平。

一般条件
DJB 手术的平均手术时间为 84.5 ± 2.6 分钟。15 只小鼠接受了 DJB 手术，9 只小鼠存活。如 表 1 所示，大多数死亡发生在手术期间或随后的 7 天内。术后死亡原因为术后 1 天出血 （n=2），术后 4 天吻合口瘘 （n=1），术后 7 天吻合口梗阻 （n=2），术后 3 周原因不明 （n=1）。

在本实验之前的 8 周内，我们每周对 10 只小鼠进行 DJB 手术作为预实验以简化手术。如图 4 所示，我们获得了预实验期间小鼠每周存活率的趋势。我们观察到存活率的逐渐提高，表明需要强化手术培训才能掌握 DJB 技术。

图 4:DJB 手术后 7 天小鼠的存活率。 数据显示了预实验对 DJB 小鼠存活率的好处。数据显示为术后 7 天的生存率 （%）。 请单击此处查看此图的较大版本。

体重、食物摄入量和葡萄糖稳态
小鼠在手术前和手术后 8 周的体重和食物摄入量相似。与假对照小鼠相比，DJB 小鼠在手术后 8 周没有明显的体重减轻 （P > 0.05; 图 5A）。DJB 和假对照手术后 7 天后每日食物摄入量减少，3 周后恢复到术前水平 （P > 0.05; 图 5B）。我们观察到 DJB 手术后空腹血糖水平和葡萄糖耐量有所改善 （P < 0.01; 图 5C、5D）。

图 5:DJB 对体重、每日食物摄入量、随机血糖和口服葡萄糖耐量试验的影响。 数据显示为 SD ±平均值，n=6。ns:不显著;** p <0.01（Mann-Whitney 和 ANOVA 检验）。 请单击此处查看此图的较大版本。

作者声明没有利益冲突。