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方法文章

饮食诱导的肥胖糖尿病小鼠十二指肠-空肠旁路手术

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DOI：

10.3791/66049

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2024年10月18日

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1Jinshazhou Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2General Hospital of Southern Theatre Command, 3Department of Cardiovascular Surgery, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, 4Zhongshan Institute for Drug Discovery, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, 5School of Laboratory and Biotechnology, Southern Medical University, 6Guangzhou Hualiang Qingying Biotechnology Co. Ltd

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

十二指肠-空肠旁路（DJB）手术可改善葡萄糖代谢并减轻胰岛素抵抗。本文中，我们介绍一种建立稳定且可靠的小鼠DJB模型的实验方案。

摘要

肥胖和2型糖尿病的流行已成为严重的全球公共卫生问题。肥胖是2型糖尿病、心血管疾病以及某些癌症的主要致病因素。减重手术为肥胖和糖尿病提供了长期且有效的治疗选择。袖状胃切除术（SG）和Roux-en-Y胃旁路术（RYGB）被广泛认为是最常用的减重手术方式。此外，一些探索性的减重手术也显示出良好的治疗效果。十二指肠-空肠旁路术（DJB）特别适用于体重指数较低的糖尿病患者，并已显示出有益的代谢改善作用。然而，由于动物模型有限，其独立于体重变化的代谢益处尚未完全阐明。本文介绍了在饮食诱导的肥胖（DIO）糖尿病小鼠中实施DJB手术的优化护理方案和外科技术。利用小鼠模型有助于更深入地理解DJB手术所诱导的代谢变化本质，同时推动相关临床实践的发展。

引言

肥胖症和2型糖尿病是世界上最常见的慢性疾病，其在年轻个体中的患病率正在上升1。减重手术是治疗肥胖症和糖尿病最有效的方法，能够促进长期血糖稳定，同时改善与肥胖相关的并发症2,3。减重手术有多种类型，根据其是否减少胃容量或肠道吸收能力可分为限制性、吸收不良性和联合性手术4,5。

十二指肠-空肠旁路术（DJB）最初由 Rubino 和 Marescaux 开发，他们证明连接十二指肠与空肠可缓解2型糖尿病，其效果并非源于胃容量的减少6,7。DJB 保留完整的胃，并绕过整个十二指肠及近端空肠。肠道被分为胆胰支、食物支和共同支6,8。DJB 与多种减重手术具有相似之处，包括 Roux-en-Y 胃旁路术（RYGB）、迷你胃旁路术、胆胰分流术、十二指肠转流术以及 DJB 联合袖状胃切除术9。与 RYGB 相比，DJB 无需进行胃肠吻合，从而缩短了手术时间并提高了手术成功率。DJB 在改善葡萄糖代谢方面与 RYGB 相似，但对体重无明显影响10。DJB 术后，食物快速进入远端小肠，刺激胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的分泌，从而改善葡萄糖代谢11,12。

动物模型的使用对于理解代谢、细胞和分子通路至关重要。减重手术的动物模型有助于我们认识肥胖和糖尿病潜在机制13,14。然而，由于物种间的生理差异，无法在动物模型中完全复制人类疾病15。在可用于研究的各种动物模型中，饮食诱导肥胖（DIO）小鼠模型最接近人类肥胖和代谢综合征16。选择小鼠进行十二指肠空肠旁路（DJB）手术旨在评估该手术的可行性，并为后续研究提供技术基础。本文对手术的技术要点和实验细节进行了全面总结。

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方案

以下所述的所有实验方案步骤均遵循中国南部战区总医院动物护理与使用委员会在批准号2020112501下的指导方针。

1. 术前常规准备

注意：购入30只6周龄雄性C57BL/6小鼠。小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）级实验室内，光照周期为12小时明/12小时暗，温度为22 ± 2 °C，湿度为55–65%。小鼠可自由饮水，并饲喂60% kcal脂肪饮食持续6周以诱导肥胖。随后连续5天给予腹腔注射链脲佐菌素（40 mg/kg）以诱导糖尿病17。在30只小鼠中，有22只小鼠随机血糖水平> 300 mg/dL，被随机分配至DJB组（n=15）和假手术组（n=7）。另有8只小鼠因血糖未达标被排除于实验之外。

  1. 手术前对小鼠禁食 8 小时，术前 2 小时撤去饮水。
  2. 经腹腔注射 1% 戊巴比妥钠溶液（6 mL/kg）和丁丙诺啡（1 mg/kg）。用镊子轻触小鼠足趾或尾巴，确认小鼠无明显抽搐或抖动反应。在充分麻醉状态下，小鼠可自由呼吸，无需辅助供氧。
  3. 将小鼠仰卧置于无菌板上，并在体视显微镜下操作。眼部涂抹眼膏以防干燥。使用电热毯在整个手术过程中维持小鼠体温。采用无菌操作技术，包括穿戴无菌手术衣、无菌手套及使用经高压灭菌的器械。
  4. 对于假手术对照组小鼠，在幽门下方 1 cm 处的十二指肠以及屈氏韧带下方 5 cm 处的空肠分别做两个切口，随后缝合切口。

2. 十二指肠空肠旁路术：手术操作

  1. 从剑突至腹部涂抹脱毛膏，以去除该区域的毛发。擦去脱毛膏，并确保皮肤清洁。用碘伏溶液和酒精溶液交替擦拭手术区域三次。
  2. 用无菌手术巾覆盖小鼠，暴露手术区域，从剑突至腹部做一条长约2 cm的切口。
  3. 使用腹部牵开器暴露腹腔。用湿润的棉签推开腹部脂肪，并将肝脏移向头侧，以充分暴露胃和肠管。
  4. 胃和幽门位于肝脏下方，屈氏韧带位于远端十二指肠。在屈氏韧带远端5 cm处，用6-0丝线对空肠进行双重结扎（图1A）。在两处结扎的中点切断空肠，并用10-0丝线缝合空肠残端（图1B）。
    注：操作时避免扭转肠系膜血管。
  5. 将近端空肠切口沿肠管方向向远端拉动5 cm，形成空肠-空肠吻合。将两段肠管水平对齐，然后用10-0丝线行侧侧吻合（图1C）。
    注：术中用生理盐水保持肠管湿润，以减少水分丢失，防止肠管卷曲，便于缝合。
  6. 固定肠管两端，将切口修剪至等长（图1D）。用全层连续缝合法缝合后壁第二层。
    注：切口长度约为0.5–0.6 cm，针距约为0.5 mm。
  7. 固定肠管两端，缝合肠管前壁。前壁第一层采用连续单纯缝合，第二层采用水平内翻缝合（图1E-F）。
    注：用棉签清除肠内容物，防止腹腔感染。
  8. 将远端空肠切口向下拉入十二指肠，在幽门下方1 cm处形成十二指肠-空肠吻合（图1G）。采用与步骤2.6–2.7相同的方法进行缝合（图1H-K）。
    注：检查吻合口角部缝合情况，以减少吻合口漏的发生。
  9. 用显微镊夹住肠管并用显微剪剪断。在十二指肠-空肠吻合口远端2 mm处，用6-0丝线对十二指肠进行双重结扎。用显微剪在中点剪断，并用10-0丝线缝合残端（图1L）。
    注：胃十二指肠血管垂直分支于胰腺头部，并邻近幽门，需仔细探查横断面的血管。定位胆总管与十二指肠汇合处，注意避免损伤胰腺或胆总管。
  10. 用30 °C生理盐水冲洗腹腔，将肠管复位至腹腔内。分别用6-0丝线缝合肌肉层和皮肤层，然后用碘伏消毒皮肤。
  11. 术后在背部皮下注射30 °C生理盐水（30 mL/kg），以预防脱水；肌肉注射青霉素（10 mg/kg）以预防感染。

消化道解剖、使用尺子进行测量的过程、实验手术设置、分步操作。
图1：十二指肠-空肠旁路手术操作。（A）空肠位于屈氏韧带远端5 cm处的位置。（B）使用6-0丝线对空肠进行双重结扎，并在结扎线中间切断。（C）空肠-空肠吻合。（D）做一0.5–0.6 cm的切口，并缝合后壁。（E–F）完成空肠-空肠吻合。（G）将远端空肠拉至幽门下方1 cm处与十二指肠连接。（H）十二指肠-空肠吻合。（I）做一0.5–0.6 cm的切口，切断十二指肠-空肠吻合口，并用连续单纯缝合法缝合后壁。（J–K）完成十二指肠-空肠吻合。（L）在距十二指肠-空肠吻合口远端2 mm处，使用6-0丝线对十二指肠进行双重结扎，并在结扎线中间切断。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 一般术后护理

  1. 术后将小鼠置于电热毯上以防止低体温。待小鼠能够自由爬行并完全清醒后，再放回笼中。
  2. 术后当天限制食物和饮水，并于小鼠背部皮下注射 2 mL 生理盐水。术后第 1 天，给予 10 mL 10% 葡萄糖与功能性饮料（1:1 比例）混合液，不给予食物，并皮下注射 1 mL 生理盐水。
  3. 术后第 2 天和第 3 天，给予小鼠 20 mL 10% 葡萄糖与功能性饮料的混合液。术后第 4 天起，给予小鼠纯水和高脂饮食。应根据术后恢复情况按以下顺序进行过渡性喂养：液体、半流质或固体食物。
  4. 术后镇痛：术后第 1 至第 3 天，每 12 小时皮下注射一次丁丙诺啡（0.1 mg/kg），之后每日一次，持续至术后第 5 天。
  5. 术后观察小鼠的进食情况、活动状态、粪便及伤口愈合情况。

十二指肠转位术示意图，消化道与胆胰支解剖结构，手术步骤示意图。
图 2：DJB 手术示意图。 (A) 十二指肠-空肠吻合。(B) 空肠-空肠吻合。(C) 胆胰支。(D) 消化支。(E) 共同支。 请点击此处查看该图的放大版本。

解剖的蠕虫解剖结构，标注了各部分（A-E）及测量比例尺；生物学研究。
图3：DJB 手术的解剖结构。（A）十二指肠-空肠吻合口。（B）空肠-空肠吻合口。（C）胆胰支。（D）消化支。（E）共同支。请点击此处查看该图的高清版本。

4. 术后代谢参数的评估

  1. 体重测量
    1. 在测量前将小鼠禁食 8 小时。在手术前和手术后 8 周内，每周一测量小鼠体重。
  2. 食物摄入量测量
    1. 每笼饲养一只小鼠。在 24 小时前后分别测量每笼中固体食物的量。两次数值之差即为每日食物摄入量。
  3. 随机血糖测量
    1. 在每周一上午 8:00，从小鼠尾尖采集一滴血液，滴加到已插入血糖仪的血糖试纸上。
  4. 口服葡萄糖耐量试验
    1. DJB 手术后 8 周，进行口服葡萄糖耐量试验前将小鼠禁食 8 小时。从小鼠尾尖采集一滴血液，滴加到已插入血糖仪的血糖试纸上。给予 20% D-葡萄糖溶液口服（2 g/kg）。在灌胃后 0、15、30、60、90、120、150 和 180 分钟时测量血糖水平。

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结果

一般情况
DJB 手术的平均手术时间为 84.5 ± 2.6 分钟。共有 15 只小鼠接受了 DJB 手术，其中 9 只存活。如表 1所示，大多数死亡发生在手术期间或术后 7 天内。术后死亡原因为：术后第 1 天出血（n=2），术后第 4 天吻合口漏（n=1），术后第 7 天吻合口梗阻（n=2），以及术后三周原因不明死亡（n=1）。

在本实验开始前的8周内，我们每周对10只小鼠进行一次DJB手术，作为预实验以简化操作流程。如图4所示，我们获得了预实验期间小鼠每周存活率的变化趋势。观察结果显示，存活率呈逐步上升趋势，表明掌握DJB技术需要进行强化的手术训练。

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讨论

1953年，Varco等人18实施了首例空肠-回肠旁路手术，标志着减重外科的开端。自那时以来，外科医生已开展了大量减重手术。这些手术可实现体重下降，并改善代谢相关并发症4,19,20。此外，1967年，Mason和Ito21完成了首例Roux-en-Y胃旁路术（RYGB），该术式能有效减轻体重并改善代谢综合征。与RYGB类似，十二指肠转流术（DJB）是一种保留胃的RYGB改良术式，将小肠分为胆胰支、食物通道支和共同支。DJB手术可在不依赖食物摄入量减少或体重下降的情况下，实现显著且持久的血糖控制22,23。因此，DJB已被推荐作为体重指数较低的2型糖尿病患者合适的减重手术选择24。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了中国广东省科学技术计划项目（编号：202002020069）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腹部拉钩F.S.T17000-03Colibri 拉钩 -3cm，拉钩范围 1.5cm/3cm 长
1% 戊巴比妥钠溶液广州化学试剂厂/ 将 500mg 戊巴比妥钠粉末溶于 50ml 生理盐水中，配制成 1% 戊巴比妥钠溶液。
注射用青霉素钠华北制药股份有限公司F2062121青霉素
丁丙诺啡广州化学试剂厂/镇痛
丁丙诺啡广州大冢制药有限公司/镇痛药
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液LEAGENER00522缓冲溶液
棉签好正医疗60220610棉拭子
脱毛膏VeetAAPR-S222脱毛乳霜
耳标ZEYASUS304耳标标记
电热毯ZOSENZS-CWDRT加热垫
电子天平梅特勒-托利多20060902-6称量体重
肠内营养粉雅培实验室/营养粉
眼膏广州大冢制药有限公司/保护眼睛
血糖仪罗氏6993788001评估血糖水平
GraphPad Prism 9.4.1 版GraphPad Softwareversion 9.4.1用于统计分析的软件
高脂饮食（高脂 [60FDC] 纯化啮齿类动物饲料）Dyets11225260kcal% 高脂饮食
微型镊子金钟医疗18-1140微型镊
微型持针器金钟医疗EMT-160-Z持针器
微型剪刀金钟医疗YBC010微型剪
显微镜相机LAPSUNE 2000视频采集
眼科剪刀金钟医疗Y00030手术剪
戊巴比妥广州化学试剂厂/麻醉
氯化钠注射液广州大冢制药有限公司B21L0301NaCl 0.9%
体视显微镜ZEISSStemi 305双目体视显微镜
链脲佐菌素SigmaS110910-1gSTZ
缝合线灵桥缝线ZS-LQPMRZ5/0Prolene 6/0，Prolene 10/0
组织镊金钟医疗H1701手术镊

参考文献

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