小鼠白内障手术建模

摘要

该方法通过从成年小鼠体内去除晶状体纤维细胞，保留附有晶状体上皮细胞（LECs）的囊袋，从而在活体中模拟白内障手术。in vivo 手术后不同时间点，采用分子和形态学标准评估损伤反应。

摘要

白内障手术（CS）是治疗白内障的有效方法，而白内障是全球视力障碍的主要原因之一。然而，白内障手术会引起眼部炎症，长期可能导致后囊膜混浊（PCO）和/或晶状体脱位，其原因是术后晶状体上皮细胞（LECs）过度增殖并转化为肌成纤维细胞和/或异常纤维细胞所致。然而，白内障手术引发炎症和PCO的分子机制仍不明确，因为大多数 体外 模型未能重现观察到的 LECs 伤口愈合反应 体内然而，传统的白内障手术动物模型（如兔子）无法进行基因表达的遗传操作以验证相关机制。近期，本实验室及其他研究团队已成功利用转基因小鼠研究驱动炎症信号通路激活以及晶状体上皮细胞（LECs）向间充质细胞转化的分子机制，从而加深了对后发性白内障（PCO）发病机制的理解。本文报道了一种已建立的小鼠白内障手术建模方案，该方案可实现通过RNA测序对LECs在晶状体纤维细胞移除后的转录组反应进行可靠的分析，通过半定量免疫荧光评估蛋白质表达水平，并可结合现代小鼠遗传学工具，验证假设参与急性继发性病变（如炎症）以及后期LECs向肌成纤维细胞和/或异常晶状体纤维细胞转化相关基因的功能。

引言

晶状体是一种高度有序且透明的组织，能够折射光线，将清晰聚焦的图像投射到视网膜上^1,2,3。这一特化的器官被一层连续的基底膜（即晶状体囊）所包裹，使其与眼部其他结构相隔离。晶状体囊的前内表面附着一层晶状体上皮细胞（LECs），这些细胞在晶状体赤道区进一步分化为晶状体纤维细胞，后者构成了晶状体的绝大部分³。当晶状体因衰老、基因突变、紫外线辐射、氧化应激或眼部外伤等因素而失去透明性时，便会发生白内障⁴。白内障是全球范围内导致失明的主要原因之一，尤其在医疗条件较差的国家更为普遍⁵。目前，该疾病通常可通过超声乳化术进行有效治疗，即手术切除混浊的晶状体组织：首先去除中央部分的晶状体囊及其附着的晶状体上皮，随后使用振动探头将晶状体的细胞团块粉碎成较小碎片并吸出，最终保留一个带有部分附着赤道区LECs的囊袋结构¹。术后最常用的视力恢复方法是植入人工晶状体（IOL）。

尽管白内障手术（CS）是一种高度有效且微创的白内障治疗方法，但术后眼部炎症的发生会显著影响患者的术后恢复⁵....

方案

本方案已获得特拉华大学机构动物护理和使用委员会（协议号：#1039-2021-1）的批准。根据眼科和视觉研究中动物使用协会研究视觉与眼科学（ARVO）的规定²⁴，所有眼部存活手术只能在单眼进行。有关本方案中所用试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。提取晶状体纤维 和缝合 的替代方法分别如图2 和 图3所示。

1. 动物

1. 使用任何野生型或基因修饰的实验小鼠品系，其眼睛需具有完整晶状体，适用于本实验操作。
   1. 可采用 C57BL/6 小鼠作为起始品系，因其在形态学和分子水平上的反应均具有高度可重复性^25,26。
      注意：可使用 C57BL/6 或其他小鼠品系。在本视频方案中，选用 FVB 小鼠以获得更清晰的视觉演示效果。
   2. 在其他小鼠品系上研究突变体反应时，应设置品系匹配的对照组。
      注意：经过练习后，即使小鼠晶状体存在白内障，只要晶状体囊完整且晶状体未发生明显液化，也可进行本操作。参见针对转录因子 Si....

结果

根据该手术方法的结果，Duncan 实验室利用这种白内障手术小鼠模型构建了术后晶状体上皮细胞的损伤反应时间进程（图5）。术后6小时，5%的晶状体上皮细胞转录组出现差异表达（图6A），其中包括大量即刻早期反应基因和促炎性细胞因子的上调²³（图6B）。术后24小时，晶状体上皮细胞（LEC）转录组进一步重塑，与未受干预的LEC相比，其转录组中有16%出现差异表达²³。这包括多种参与炎症反应的基因显著上调，如CXCL1、S100a9和CSF3/G-CSF，以及首次检测到纤维化标志物的上调，例如α-平滑肌肌动蛋白、tenascin C和fibronectin^31,32。纤维化标志蛋白以及TGFβ活化调节因子αVβ8整合素在术后48小时显著上调，同时转录组进一步.......

讨论

该手术技术需要高超的小鼠操作和显微外科技能，需经过练习才能掌握。其中最难掌握的是在角膜上放置细小缝线以闭合伤口。假设实验人员从未接触过缝合操作，则建议首先使用绳子和布料进行练习，然后在小型水果上使用粗缝线练习，以掌握打外科方结所需的手部动作。接着，实验人员应在水果上练习使用手术刀做切口，并对切口进行缝合，所用的水果应逐渐变小（例如先用葡萄，再过渡到蓝莓）。此外，实验人员还需使用逐渐变细的材料（如从毛线到细绳再到头发丝）练习打方结缝合，直至能够熟练使用本实验所需的细小10-0尼龙缝线完成方结。

本文介绍了一种模拟白内障手术后晶状体上皮细胞（LECs）所感知损伤的技术，旨在阐明LECs对损伤反应的分子机制。该方法的主要优势包括：（1）LECs的损伤反应发生在活体眼球的生理环境中；（2）该小鼠模型可同时利用遗传学工具和药理学抑制剂，研究晶状体损伤反应的机制以及残留晶状体上皮细胞的表型转变过程；（3）可用于测试潜在的治疗手段，以干预LECs的损伤反应进程，从而预防后发性白内障（PCO）；（4）无需添加外源性因子（如体外激活的TGFβ），即可完整观察LECs对手术损伤的全部反应过程，包括细胞增殖、迁.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5% 红霉素眼膏 USP	Baush Lomb	24208-910-55
1% 硫酸阿托品眼用溶液	Amneal	60219-1748-2
1% 托吡卡胺眼用溶液 USP	Akorn	17478-102-12
10-0 尼龙缝线	Ethicon	7707G
2.5% 盐酸去氧肾上腺素眼用溶液 USP	Akorn	17478-200-12
26 G 1/2 针头 - 直头	BD PrecisionGlide	5111
27 G 45° 弯曲分配尖端 1"	Harfington
平衡盐溶液	Phoenix	57319-555-06
布托啡诺（0.1 mg/kg）	APP Pharmaceticals	401730D
氯己定溶液
持针器 2-110	Duckworth & Kent	2-110-3E
Noyes 剪刀，直头	Fine Science Tools	12060-02
SMZ800 Nikon 型显微镜	Nikon
无菌一次性手术刀 No.11	Feather	2975#11
#5 Dumont 镊子	Electron Microscopy Sciences	72700-D
赛拉嗪/氯胺酮/乙酰丙嗪（35 mg/kg, 80 mg/kg, 0.5 mg/kg）溶液	APP Pharmaceticals	401730D