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基于离子半导体测序平台的胃癌多基因单核苷酸多态性检测

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DOI：

10.3791/66058

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2024年5月10日

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1Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2Research and Development Department, Guangzhou Darui Biotechnology Co., Ltd, 3Key Laboratory of Antibody Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 4Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, Southern Medical University

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摘要

本方案介绍了基于离子半导体测序平台检测胃癌样本中单核苷酸多态性所需的完整实验流程。同时详细描述了目标序列、连接接头、文库扩增与纯化步骤，以及质量控制标准。

摘要

胃癌是一种常见的异质性肿瘤。大多数患者在确诊时已处于胃癌晚期，通常需要接受化疗。尽管5-氟尿嘧啶（5-FU）被广泛用于治疗，但其治疗敏感性和药物耐受性仍需进一步明确，这凸显了个体化用药的重要性。药物遗传学可指导个体化治疗的临床实施。单核苷酸多态性（SNP）作为一种遗传标志物，有助于选择合适的化疗方案和剂量。某些SNP与叶酸代谢相关，而叶酸代谢正是5-FU的作用靶点。Methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR）rs1801131和rs1801133、dihydrofolate reductase（DHFR）rs1650697和rs442767、methionine synthase（MTR）rs1805087、gamma-glutamyl hydrolase（GGH）rs11545078以及solute carrier family 19 member 1（SLC19A1）rs1051298已在多种癌症及抗叶酸类抗肿瘤药物中被研究，对5-FU的应用具有潜在的预测和指导意义。离子流半导体高通量测序技术可快速检测与胃癌相关的SNP。在DNA链每次发生碱基延伸时，会释放一个H+，引起局部pH变化。离子传感器可检测pH变化，并将化学信号转化为数字信号，从而实现边合成边测序。该技术具有样本需求量少、操作简便、成本低和测序速度快等优势，有利于通过SNP指导个体化化疗。

引言

胃癌是全球公共卫生领域的一项沉重负担。根据国际癌症研究机构（IARC）发布的《2020年全球癌症统计》，胃癌是全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第四大原因。在全球范围内，按年龄标化发病率计算，东亚地区无论男性还是女性的发病率均最高1。胃癌的发生具有隐匿性，意味着患者在早期通常没有任何明显或特异性的症状。在所有胃癌患者中，在未开展常规筛查的国家，80%–90%的患者要么在确诊时已处于肿瘤无法手术的晚期阶段，要么在术后5年内出现复发2。

对于晚期或转移性胃癌，化疗是主要的治疗手段，可提高患者的生存率和生活质量。对于转移性胃癌患者的初始治疗，含铂类与氟尿嘧啶类药物的联合方案是首选的一线化疗方案3。氟尿嘧啶类药物主要包括5-氟尿嘧啶（5-FU）以及口服氟尿嘧啶衍生物，如卡培他滨和替加氟。5-FU的主要作用靶点是叶酸代谢相关酶，通过抑制DNA合成来减缓肿瘤组织的生长。然而，药物不良反应限制了其应用，其中最常见的副作用包括腹泻、黏膜炎、骨髓抑制和手足综合征。已有研究报道，治疗反应及药物不良反应与叶酸代谢通路中的因素密切相关。值得注意的是，rs1801131位点的纯合突变已被确认为手足综合征的预测指标（p = 4.1 × 10-6，OR = 9.99，95% CI：3.84–27.8）4。尽管氟尿嘧啶类药物在抗肿瘤化疗中广泛应用，但其耐药性是临床常见的难题，常导致胃癌治疗失败。例如，仅使用5-FU治疗的晚期结直肠癌患者总体缓解率仅为10%–15%5。此外，氟尿嘧啶类药物的毒性也不容忽视。5-FU引起的毒性反应主要包括腹泻、手足综合征、口腔炎、中性粒细胞减少、血小板减少、神经毒性，甚至可能导致死亡6。接受氟尿嘧啶类药物治疗的患者中，有10%–30%会出现严重的治疗相关毒性，而致死性毒性发生率为0.5%–1%7。

一项针对晚期胃癌患者的生活质量研究发现，接受基于5-FU化疗的患者中，应答率低于50%8。因此，了解与5-FU化疗敏感性相关的因素，对于实现精准治疗、在最小化毒性的前提下最大化应答率和治疗效果尤为重要。考虑到5-FU与叶酸代谢密切相关，叶酸代谢通路中酶的遗传变异可能是影响因素之一。人类基因组序列变异约有90%源于DNA中的单碱基突变，即单核苷酸多态性（SNPs）9。当SNPs导致叶酸代谢酶的性质发生改变时，可能导致胃癌患者对氟尿嘧啶的疗效、毒性和化疗耐药性出现个体差异。

亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）主要用于将5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-MTHF）转化为5-甲基四氢叶酸。5-FU的代谢产物5-FdUMP可与5,10-MTHF及胸苷酸合成酶（TS）形成无活性的三元复合物，抑制TS活性，导致dTMP缺乏10。5,10-MTHF的积累可增强5-FU对TS的抑制作用，该效应与MTHFR活性相关。MTHFR基因的rs1801131和rs1801133是两种最常见的多态性位点，与较低的酶活性相关（其中rs1801133导致酶活性降低75%，rs181131导致酶活性降低30%），并可引起5,10-MTHF的积累11。

二氢叶酸还原酶（DHFR）是叶酸代谢和DNA合成中的关键酶。DHFR利用NADPH将二氢叶酸还原为四氢叶酸（THF），后者用于携带一碳单位。DHFR的单核苷酸多态性（SNPs） DHFR 可能影响其表达，改变四氢叶酸（THF）的活性和含量，进而影响叶酸代谢及5-FU的敏感性。 DHFR rs1650697 点突变发生于主要启动子区 DHFR 基因，可提高 DHFR 的表达水平12一项研究发现，SNP rs442767 与抗叶酸类抗肿瘤药物（如培美曲塞和甲氨蝶呤）的疗效及毒性相关。关于SNP rs442767，一个 GT 基因型表示来自双亲的同源染色体上同一基因座分别遗传了一个G等位基因和一个T等位基因。类似地，基因型 GG 和 TT 表示相应地遗传了两个G等位基因或两个T等位基因。与基因型相比 GT+TT, GG 与无事件生存率降低和风险增加相关13这表明 rs442767 可能对 5-FU 产生一定的潜在影响。

甲硫氨酸合酶（MTR）催化同型半胱氨酸重新甲基化为甲硫氨酸，在叶酸代谢中发挥重要作用。MTR rs1805087 是 MTR 基因最常见的多态性位点。MTR rs1805087 在蛋白质的潜在功能位点引起甘氨酸被天冬氨酸取代，可能降低 MTR 的活性。携带 G 等位基因的个体血浆叶酸水平升高，血浆同型半胱氨酸水平降低14。相反，有研究显示 rs1805087 与 5-FU 疗效之间无统计学显著关联，但该研究聚焦于结直肠癌且样本量较小。rs1805087 与 5-FU 在胃癌患者中疗效之间的关系仍有待进一步探讨15。

γ-谷氨酰水解酶（GGH）是一种溶酶体酶，可调控细胞内叶酸浓度。蝶酰谷氨酸是叶酸的同义词，由蝶呤、对氨基甲基苯甲酸和谷氨酸组成。生物体内存在两种形式的叶酸：单谷氨酸叶酸和多谷氨酸化叶酸。四氢叶酸多谷氨酸（THF-多谷氨酸）在GGH的催化作用下转化为单谷氨酸叶酸，依次释放出单谷氨酸（mono-Glu）或二谷氨酸（di-Glu）16。一项关于局部进展期胃癌患者中GGH表达水平的研究显示，高GGH表达可降低5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-MTHF）和胸苷酸合酶（TS）水平，这意味着这些患者仅需较小剂量的5-氟尿嘧啶（5-FU）即可实现对TS的抑制作用17。GGH是接受术后S-1辅助化疗（S-1为5-FU的前体药物）的局部进展期胃癌患者的预后生物标志物，并在维持细胞内叶酸稳态中发挥重要作用18。GGH rs11545078为错义突变，导致第127位的苏氨酸（Thr）被异亮氨酸（Ile）取代。一项针对GGH底物特异性的研究提示，与野生型相比，rs11545078突变导致甲氨蝶呤（其结构与叶酸相似）的Km值升高、催化效率降低19。因此，探讨rs11545078与5-FU临床疗效之间的关系，是理解药物耐药机制的一项有前景的策略。

溶质载体家族19成员1（SLC19A1），又称还原型叶酸转运蛋白，是一种典型的促进性跨膜蛋白，负责转运哺乳动物细胞无法自身合成的还原型叶酸 从头合成 合成，用于评估肿瘤对5-FU的反应20然而，关于5-FU与 SLC19A1 多态性21在接受培美曲塞（一种叶酸类似物）治疗的非小细胞肺癌患者中，位于 SLC19A1 该基因增加了所有药物不良反应的风险，并降低了总体生存率22,23. SLC19A1 rs1051298 是位于叶酸代谢相关基因3'非翻译区的一个变异位点，可能有助于解释个体对5-FU治疗反应差异的部分原因。本研究旨在评估rs1051298与胃癌患者5-FU耐药性之间的关联。

一种基于半导体测序的试剂盒用于基因的定性检测 体外 (图1），可检测5个基因中的7个选定SNP，包括MTHFR基因的rs1801131和rs1801133突变 MTHFR 基因，rs1650697 和 rs442767 突变 DHFR 基因，rs1805087 突变 MTR 基因，rs11545078 突变 GGH 基因和rs1051298 SLC19A1 胃癌患者肿瘤组织样本中基因的检测。首先提取样本中的核酸，通过PCR特异性扩增目标片段。在DNA片段两端连接通用测序接头，构建可用于测序的文库。随后通过PCR扩增测序文库，形成测序模板。对阳性模板进行富集，以满足测序要求。利用半导体测序系统，将DNA链固定在半导体芯片的微孔中。DNA聚合酶以单链DNA为模板，依据碱基互补配对原则合成互补DNA链。每当DNA链延伸一个碱基时，会释放一个质子，引起局部pH值变化。离子传感器检测pH变化，并将化学信号转化为数字信号，从而实现实时碱基读取，最终获得每条DNA片段的碱基序列。通过生物信息学分析，将这些序列比对至人类基因组参考图谱。当胃癌相关基因发生突变时，其对应的DNA碱基序列会发生改变，由此获取相关基因的突变信息。

检测结果可显示基因突变状态，为临床医生选择合适的化疗药物种类和剂量以及预测胃癌患者的耐药性提供参考。然而，检测结果仅作为临床参考，不建议作为患者个体化治疗的唯一依据。临床医生应结合患者的病情、药物适应证、治疗反应及其他实验室检测指标进行综合判断。

方案

本研究中使用的所有方案以及通过上消化道内镜检查或手术获得的胃癌组织样本（步骤1），均于2023年7月24日经医学伦理委员会审核批准（NFEC-2023-298）。此外，本方案专门用于演示胃癌中的多基因检测，不涉及队列间的比较，因此未设定特定的患者纳入或排除标准。患者/受试者均已签署书面知情同意书，同意参与本研究。

1. 胃癌组织包埋块的制备

  1. 根据规定的操作指南，配置组织包埋系统，包括石蜡储存器和分配装置，以及温控板和冷板。
  2. 从脱水机中取出已准备好的待包埋组织，并将其放入包埋中心的存储槽中。
  3. 根据组织大小选择合适的包埋模具，倒入足量熔化的石蜡以完全覆盖组织，然后将模具置于温控板上。
  4. 从组织盒中取出组织，将胃黏膜垂直放置于包埋模具底部，以确保切片平面能贯穿所有组织层。在模具内对组织进行正确对齐。
  5. 将组织盒置于模具上方，随后再次倒入石蜡，直至填满模具。
  6. 将包埋好的模具放置于冷板上，待石蜡完全凝固后，将包埋组织块从模具中折下。

2. 从样本中提取核酸

  1. 使用核酸提取和纯化试剂盒从石蜡包埋的组织样本中提取核酸。
  2. 使用核酸定量仪对提取的核酸进行定量。建议核酸浓度大于 2 ng/µL。
    注意：此处使用的材料见材料表。

3. 测序文库的制备

  1. 实验前准备
    1. 打开超净工作台内的紫外灯，灭菌30分钟。随后关闭紫外灯，打开风机通风10分钟。
    2. 从-20 ± 5 °C冰箱中取出核酸样品，核对并记录样本编号、核酸条形码及分配给该样本的特定标签编号。经确认后将其置于离心管架上，室温（RT）溶解，并以2,500 × g离心10秒，备用。
  2. 目标片段的PCR扩增
    1. 从定制的胃癌多基因联合检测试剂盒中取出片段捕获反应液、胃癌扩增引物和融合扩增引物，置于冰上融化。融化后振荡混匀，离心10秒，并准备无核酸酶水。详细引物信息见表1。
      注意：该试剂盒尚未商业化，如需进一步信息请联系作者。
    2. 准备0.2 mL PCR反应管，按照补充表1依次加入试剂，涡旋混匀5秒，瞬时离心10秒（固定2,500 × g），确保管壁和管盖无明显液滴。RNA样本需先逆转录为cDNA，再用于后续文库构建。cDNA产物应按照补充表2依次加入各管中。
    3. 将每根反应管放入热循环仪中。DNA样本按照表2所述程序进行扩增；cDNA产物则按照表3所述程序进行扩增。
  3. 引物序列的消化
    1. 取出引物消化酶，置于冰上融化。扩增完成后，取出上述反应管，每管加入2 µL引物消化酶，确保总体积为22 µL。
    2. 涡旋混匀PCR管中的反应液，瞬时离心10秒（固定2,500 × g）。
    3. 将每根反应管放入热循环仪中，运行表4中详细描述的程序。
  4. 接头连接
    1. 将接头连接试剂置于冰上溶解。准备1.5 mL微量离心管，按照表5混合各组分，并标记为接头混合物X。
      注意：接头连接试剂包括P1接头和编号为1至48的特异性接头X，设计用于唯一标记不同样本。添加特异性接头时，每次仅打开一个管子，防止特异性接头交叉污染。稀释后的特异性接头混合物可于-20 ± 5 °C保存备用。在测序流程中，样本并非单独处理，而是将多个带有不同特异性接头标记的样本合并为统一文库进行测序。该方法可在后续分析中根据其特异性接头序列区分各样本。
    2. 从热循环仪中取出已消化的引物产物（22 µL），按照表6依次加入试剂，涡旋混匀5秒，低速离心10秒（固定2,500 × g），确保管壁和管盖无明显液滴。
    3. 将反应管放入热循环仪中。DNA样本运行表7中详细描述的扩增程序；cDNA产物运行表8中详细描述的扩增程序。
  5. 连接产物的纯化与扩增
    1. 提前从2–8 °C冰箱中取出DNA纯化磁珠，充分涡旋混匀，瞬时离心10秒（固定2,500 × g），并在室温平衡30分钟。
    2. 准备1.5 mL低吸附微量离心管，将连接反应产物转移至相应管中。
    3. 每管加入45 µL DNA纯化磁珠，充分涡旋混匀，瞬时离心10秒，室温孵育5分钟。
    4. 将管子置于磁力架上静置3分钟。弃去上清液，避免吸出磁珠。
    5. 向微量离心管中加入300 µL新配制的75%乙醇，轻轻旋转管体4次（每次180°）。待溶液澄清后，迅速吸弃上清液，避免吸出磁珠。重复洗涤一次。
    6. 将1.5 mL微量离心管从磁力架上取下，短暂离心（10秒，固定2,500 × g）。再放回磁力架，吸除残留液体，确保管壁无残留液体。
    7. 打开每根1.5 mL微量离心管的管盖，在室温干燥5分钟。注意观察磁珠干湿状态。磁珠干燥后表面应无水渍。若磁珠过湿，可适当延长干燥时间。若磁珠表面出现裂纹，应立即盖上管盖，并继续下一步文库扩增与纯化。
  6. 文库的扩增与纯化
    1. 提前将PCR相关试剂置于冰上溶解，涡旋混匀后离心10秒。从磁力架上取下1.5 mL微量离心管，按照表9将PCR试剂加入管中，盖紧管盖后涡旋混匀5秒。短暂离心（10秒），确保管壁和管盖无明显液滴。
    2. 将上述产物转移至新的PCR管中，放入热循环仪中孵育。DNA样本运行表10中详细描述的扩增程序；cDNA产物运行表11中详细描述的扩增程序。
    3. 准备新的1.5 mL低吸附微量离心管。孵育结束后，将PCR管离心10秒，将产物从PCR管转移至EP管中。
    4. 每管加入25 µL DNA纯化磁珠，充分涡旋混匀，低速离心后室温孵育5分钟。
    5. 将管子置于磁力架上静置3分钟，待溶液澄清后，将上清液转移至新的微量离心管中，避免吸出磁珠。
    6. 每管加入60 µL DNA纯化磁珠，充分涡旋混匀，低速离心后室温孵育5分钟。
    7. 将管子置于磁力架上静置3分钟，待溶液澄清后，弃去上清液，避免吸出磁珠。
    8. 向管中加入300 µL新配制的75%乙醇，轻轻旋转管体4次（每次180°）。待溶液澄清后，迅速吸弃上清液，避免吸出磁珠。重复洗涤一次。
    9. 将1.5 mL微量离心管从磁力架上取下，短暂离心（10秒），再插入磁力架中，吸除残留液体，确保管壁无残留液体。
    10. 打开1.5 mL管的管盖，在室温干燥5分钟。注意观察磁珠干湿状态。磁珠干燥后表面应无水渍。若磁珠过湿，可适当延长干燥时间。若磁珠表面出现裂纹，应立即盖上管盖。
    11. 向管中加入50 µL洗脱液，充分涡旋混匀，短暂离心（5秒，固定2,500 × g），室温静置5分钟。
    12. 将管子置于磁力架上静置3分钟，待溶液澄清后，小心将液体转移至新管中，并标记文库名称。
    13. 将文库暂时存放于2–8 °C冰箱中待定量检测，或长期保存于-20 ± 5 °C冰箱中。

4. 构建文库的定量分析

  1. 使用核酸定量仪对文库进行定量。若文库浓度 ≥ 0.2 ng/µL，则符合要求；否则需重新构建文库。
  2. 取等体积的 DNA（或 RNA）混合后进行定量。根据定量结果，使用以下公式将混合溶液稀释至 100 pmol/L。
    稀释计算公式；文库浓度计算公式；教学图表。
    注意：也可先根据公式将文库稀释至 100 pmol/L，再通过荧光定量 PCR 进行定量。然后根据 PCR 仪器的定量结果，等量混合 DNA（或 RNA）文库。
  3. 按 4:1 的比例混合 100 pmol/L 的 DNA 文库和 RNA 文库。使用 DNA 与 RNA 文库的混合液进行计算机测序。

5. 测序

  1. 参照通用测序反应试剂盒说明书24,25（半导体测序法）进行测序。

6. 样品质量控制

  1. 胃癌DNA的阳性质量对照：取胃癌DNA阳性对照，按照试剂盒说明书进行检测。该对照由试剂盒提供。结果显示可检测到MTHFR、DHFR、MTR、GGH和SLC19A1基因的突变型。
  2. 胃癌DNA的阴性质量对照：取胃癌DNA阴性对照，按照试剂盒说明书进行检测。该对照由试剂盒提供。结果显示可检测到MTHFR、DHFR、MTR、GGH和SLC19A1基因的野生型。
    注意：以上两种情况均需满足判定标准，否则需重新检测。

7. 数据分析

  1. 在 Torrent Suite 软件中运行相应的插件（Variant Caller、Coverage Analysis 和 Ion Reporter 软件），以获得样本的分析结果。根据插件的分析结果判断样本检测结果。

结果

检测结果的判定依赖于阳性判断值，该值也被视为参考区间。采用半导体测序法检测所收集的临床样本。当MTHFR、DHFR、MTR、GGH和SLC19A1基因的突变频率值≥ 5%时，检测结果为相应基因的突变型；当突变频率值< 5%时，检测结果为相应基因的野生型26。

可依据以下标准判断检测结果是否可信。首先，若DNA测序结果的平均覆盖深度≥ 500，且RNA测序结果的比对读段数≥ 20000，则检测结果可信27；否则建议重新检测。其次，胃癌DNA阳性对照的平均覆盖深度应≥ 500，检测结果应显示MTHFR基因的rs1801131和rs1801133位点突变、DHFR基因的rs1650697和rs442767位点突变、MTR基因的rs1805087位点突变、GGH基因的rs11545078位点突变以及SLC19A1基因的rs1051298位点突变为阳性；否则建议重新检测。第三，胃癌DNA阴性对照的平均覆盖深度应≥ 500，检测结果应显示本试剂盒检测范围内的所有位点均为野生型；否则建议重新检测。最后，若文库浓度低于0.2 ng/µL，可能由于样本中DNA或RNA发生降解，或实验过程中未严格遵循操作流程、使用了过期试剂所致。上述情况可能导致测序质量下降或失败，建议重新构建文库。

使用该试剂盒，需遵循一系列步骤，从临床样本中构建测序文库。随后在离子半导体测序平台上进行测序，并利用ANNOVAR对结果进行注释。测序完成后，通过一份文件汇总每个样本的突变类型。若某种突变类型未被列出，则表明该样本未发生此种特定突变。补充表3提供了此类情况的典型示例。表12包含了本次检测到的SNP的基本信息。通过在多个数据库（如1000基因组计划（1000g2015aug；https://www.internationalgenome.org/；表13）和外显子组聚合联盟（ExAC；https://gnomad.broadinstitute.org/；表14））中采用基于过滤器的注释方法对各个SNP进行分析，可以发现不同SNP在不同人群中具有显著差异的分布。

胃癌检测工作流程图；核酸提取、PCR、测序过程。
图1：实验方案流程图。 采用半导体测序法进行胃癌多基因检测的流程图。请点击此处查看此图的放大版本。

染色体位置引物设计区间左引物右引物
chr111854475chr1:11854175-11854775ACAGGATGGG
GAAGTCACAG		AAACCGGAAT
GGTCACAAAG
11856377chr1:11856077-11856677CTTCAGGTCA
GCCTCAAAGC		TCCCTGTGGT
CTCTTCATCC
chr579950780chr5:79950480-79951080CGCCGCACAT
AGTAGGTTCT		CTTCCTCCTC
CAGCCCTATC
79951495chr5:79951195-79951795CTTGGGTCAC
CTGCACAGTA		ATTTTGAAGC
ACCCAAGCTG
chr1237048499chr1:237048199-237048799GTCAAAGGCC
AGTCCCTTCT		CTCCCTTCAC
CAACTGTGCT
chr863938763chr8:63938463-63939063CAGTGAAGTT
CAGCGGCAT		TATTTTCCTGT
GTGGGGCAC
chr2146934825chr21:46934525-46935125CCAACCTGAG
ATGGCTTTTC		TCCTTGGTGC
TCTTGCTTTT

表1：五个基因中选定的七个SNP位点所用引物。 本表格展示了与胃癌中5-FU耐药相关的SNP位点引物位置信息。

温度时间循环次数
99 °C2 min1 个循环
99 °C15 s22 个循环
60 °C4 min
10 °C保持1 个循环

表2：DNA扩增的热循环程序。 显示了温度、时间和循环次数等热反应条件。

步骤温度时间循环次数
激活酶99 °C2 min1 次循环
变性99 °C15 s30 次循环
退火与延伸60 °C4 min
保存10 °C保持1 次循环

表3：cDNA扩增的热循环程序。 显示了温度、时间和循环次数等热反应条件。

温度时间循环次数
50 °C10 min1 cycle
55 °C10 min1 cycle
60 °C20 min1 cycle
10 °C保持1 cycle

表4：引物序列消化的热循环程序。 显示了温度、时间和循环次数等热反应条件。

组分体积
P1 接头1.5 μL
特异性接头 X1.5 μL
无核酸酶水3 μL
反应体系总体积6 μL
X：表示特异性接头编号

表5：制备接头混合物时添加试剂的顺序。请按照此处提供的顺序将试剂加入离心管中。

组分体积
连接缓冲液4 μL
接头混合物 X2 μL
DNA 连接酶2 μL
反应体系总体积30 μL

表6：向消化引物产物中添加试剂的顺序。 按照此处提供的顺序将试剂加入试管中。

温度时间循环次数
22 °C30 min1 cycle
72 °C10 min1 cycle
10 °C保持1 cycle

表7：DNA接头连接的热循环程序。 显示了温度、时间和循环次数等热反应条件。

温度时间循环次数
22 °C30 min1 cycle
68 °C5 min1 cycle
72 °C5 min1 cycle
10 °C保持1 cycle

表8：cDNA连接接头的热循环程序。 显示了温度、时间和循环次数等热反应条件。

组分体积
文库扩增反应溶液50 μL
文库引物混合物2 μL
反应体系总体积52 μL

表9：扩增试剂的添加顺序。 请按照此处提供的顺序将试剂加入试管中。

温度时间循环次数
98 °C2 min1 个循环
98 °C15 s5 个循环
60 °C1 min
10 °C保持1 个循环

表10：DNA文库扩增的热循环程序。 显示了温度、时间和循环次数等热反应条件。

温度时间循环次数
98 °C2 min1 个循环
98 °C15 s5 个循环
64 °C1 min
10 °C保持1 个循环

表11：扩增cDNA文库的热循环程序。 显示了温度、时间和循环次数等热反应条件。

rs1801131rs1801133rs1650697rs442767rs1805087rs11545078rs1051298
参考等位基因TGAGAGG
替代等位基因GAGTGAA
功能区域
基因及版本		外显子区外显子区5'非翻译区上游区域外显子区外显子区3'非翻译区
基因名称
基因及版本		MTHFRMTHFRDHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
基因详情
.refGene版本		..NG_023304.1:
g.5020T>G		...NM_001205206.1:
c.*64C>T;
NM_001205207.1:
c.*746C>T;
NM_194255.2:c.
*746C>T
外显子功能
.refGene版本		非同义突变；
单核苷酸变异		非同义突变；
单核苷酸变异		..非同义突变；
单核苷酸变异		非同义突变；
单核苷酸变异		.
氨基酸改变
基因及版本		MTHFR:NM_00
1330358.1:exo
n8:c.A1409C:p.
E470A;MTHFR:
NM_005957.4:
exon8:c.A1286
C:p.E429A		MTHFR:NM_00
1330358.1:exo
n5:c.C788T:p.
A263V;MTHFR:N
M_005957.4:e
xon5:c.C665T:
p.A222V		..MTR:NM_0012
91939.1:exon2
5:c.A2603G:p.
D868G;MTR:N
M_001291940.
1:exon25:c.A1
535G:p.D512G;
MTR:NM_0002
54.2:exon26:c.
A2756G:p.D91
9G		GGH:NM_003878
.2:exon5:c.C452T:
p.T151I		jin
染色体区带1p36.221p36.225q14.15q14.11q438q12.321q22.3

表12：SNP的相关信息。 使用ANNOVAR对样本进行注释。

MTHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
rs1801131rs1801133rs1650697rs442767rs1805087rs11545078rs1051298
1000g2015aug_all0.2494010.2454070.768570.2901360.2182510.0854630.524361
1000g2015aug_afr0.15130.090.93490.03180.28440.0560.5772
1000g2015aug_amr0.15130.47410.7550.39910.17720.04030.4323
1000g2015aug_eas0.21920.29560.66070.58530.10520.08730.5635
1000g2015aug_eur0.31310.36480.75550.31910.1730.09240.4493
1000g2015aug_sas0.41720.11860.67790.2280.32110.14830.5552

表13：基于滤镜的1000基因组计划中单核苷酸多态性（SNP）注释。

MTHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
rs1801131rs1801133rs1650697rs442767rs1805087rs11545078rs1051298
ExAC_ALL0.2950.3037..0.20910.0936.
ExAC_AFR0.15880.1124..0.26660.0545.
ExAC_AMR0.15550.5141..0.18640.0361.
ExAC_EAS0.21480.3052..0.11320.0824.
ExAC_FIN0.31280.2227..0.18920.0581.
ExAC_NFE0.31910.345..0.19190.0969.
ExAC_OTH0.3040.3062..0.21080.0973.
ExAC_SAS0.41530.1409..0.3160.165.

表14：基于过滤器的Exome Aggregation Consortium中SNP注释。

补充表1：DNA扩增试剂添加顺序。请按照此处提供的顺序将试剂加入离心管中。请点击此处下载该文件。

补充表2：cDNA扩增试剂添加顺序。请按照此处提供的顺序将试剂加入试管中。请点击此处下载该文件。

补充表3：临床样本测序结果示例。 仅记录样本中存在的突变。 请点击此处下载该文件。

讨论

临床专家一致认为，即使患有相同类型和分期的胃癌，患者对相同治疗方案的反应也可能存在显著差异。多年的研究表明，这种个体差异主要归因于胃癌本身是一种具有异质性、多态性以及分化程度多样的细胞群体，从而导致治疗反应上的显著个体差异28。因此，通过上消化道内镜或手术获取胃癌组织样本以及血液样本，并结合高通量测序进行基因分析，可实现胃癌的个体化治疗。该策略旨在提高临床治疗效果，并降低严重毒性副作用的风险。离子半导体测序技术的进步已使个体化治疗成为现实29。

该检测方法存在一些局限性。此处使用的试剂盒主要用于 体外 诊断，因此仅限于检测 rs1801131 和 rs1801133 的突变 MTHFR 基因，rs1650697 和 rs442767 DHFR 基因，rs1805087 MTR 基因，rs11545078 GGH 基因和rs1051298 SLC19A1其他区域的突变无法被检测。由于肿瘤组织存在显著异质性，不同取样位置可能影响检测结果。对于长期保存的石蜡包埋组织样本，DNA和RNA可能在一定程度上发生降解，从而影响检测结果。不合理的样本采集、运输与处理，以及实验操作不当或实验环境不适宜，均可能导致假阴性或假阳性结果。当核酸浓度低于2 ng/µL时，无法保证检测结果的准确性。试剂盒的检测结果仅作为临床参考，患者个体化治疗方案的选择应结合其临床症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应综合判断。阴性结果不能完全排除目标基因突变的存在；样本中肿瘤细胞数量过少、核酸过度降解或扩增反应体系中目标基因浓度低于检测限，也可能导致阴性结果。

所用试剂盒的部分性能指标如下所述。分析灵敏度：对于DNA样本，该试剂盒可检测的总核酸最低量为10 ng，可检测出5%的突变率；对于RNA样本，该试剂盒可检测的总核酸最低量为10 ng。阴阳性符合率：阴阳性符合率达到100%。检测下限（LOD）：共有14个编号为L1-L14的LOD参考品可供使用。L1-L11为MTHFR、DHFR、MTR、GGH和SLC19A1基因的LOD参考品，其检测结果应为相应基因位点的突变类型呈阳性，且符合率均为100%。重复性：共有5个编号为R1-R5的重复性参考品可供使用。R1为强阳性重复性参考品（DPYD基因rs67376798突变）；R2含有较少该突变，为弱阳性重复性参考品（DPYD基因rs67376798突变）；R3为阴性重复性参考品（DPYD、MTHFR和ABCB1基因的6个位点均检测为野生型）。每个参考样本需检测10次，确保重复检测结果与其预设分类一致。数据量：DNA和RNA样本的有效数据量应控制在0.05 M以上；DNA样本的测序深度应控制在500以上，RNA样本的比对 reads 数（Mapped Reads）应控制在20000以上。干扰试验：该试剂盒不受内源性干扰物质（甘油三酯和白蛋白）及外源性干扰物质（甲醛和脱水酒精）的影响。

实验过程中必须注意一些事项。此处使用的试剂盒仅可用于 体外 检测。实验前请仔细阅读本说明书，并在有效期内使用。不同批次试剂盒中的组分不可互换使用。建议使用一次性耗材，以防止污染。使用本试剂盒时，建议使用带滤芯的吸头。为避免样本中可能存在的生物危害，应将待测样本视为感染性物质，避免与皮肤和黏膜接触。建议在可防止气溶胶外溢的生物安全柜中处理样本。操作中使用的试管和吸管在丢弃前应进行灭菌处理。样本的操作与处置应符合相关法律法规要求：《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》及卫生部《医疗废物管理条例》。30,31实验人员必须接受专业培训，严格按照说明书操作，并根据实验流程严格区分各区域。实验操作的每个阶段应使用专用仪器和设备，各区域每个阶段的物品不得交叉混用。实验人员须根据实验流程严格分离区域，各阶段实验操作应使用专用仪器和设备。按要求采取防护措施，如佩戴手套、穿工作服等。废弃物处理应符合国家相关法规规定。

尽管本文的重点是与胃癌相关的五个基因内的七个单核苷酸多态性（SNP），但在实际应用中的测序并不局限于这五个基因。本文明确建立了这七个SNP与胃癌对5-FU化疗敏感性之间的显著相关性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家自然科学基金资助的“ERK2/Snai1/AGPS/PUFA-PL通路在胃癌细胞对阿帕替尼诱导的铁死亡抵抗中的机制与作用研究”（项目编号：82172814）；广东省基础与应用基础研究基金委员会资助的“锌指转录因子1通过多不饱和醚磷脂通路调控胃癌细胞对阿帕替尼诱导的铁死亡抵抗的作用与机制研究”（项目编号：2022A1515010267）；以及广州市科技计划项目“胃癌5-氟尿嘧啶化疗敏感性诊断试剂的研发与应用”（项目编号：201903010072）共同支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL DNA LoBind 管Eppendorf30108051
50 mL 管Greiner Bio-One227261
胃癌扩增引物Thermo Fisher引物由 Thermo Fisher 根据 表 1 中的序列合成。
脱蜡试剂Qiagen19093
DNA 纯化磁珠BeckmanA63881
乙醇广州化学试剂
厂 Thermo Fisher Scientific		http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq 文库构建试剂盒 2.0Thermo Fisher4480441
无核酸酶水Life TechnologiesAM9932
PCR 管AxygenPCR-02D-C
PCR 管AxygenPCR-02D-C
移液器吸头 Quality Scientific Productshttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
PureLink RNA Mini 柱Thermo FisherA29839
RecoverAll 总核酸提取试剂盒Thermo FisherAM1975
台式微型离心机SCILOGEXS1010E
PCR 仪Life Technologies4375786
超微量核酸分析仪BEIJING ORIENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT LTD.BD-1000

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勘误


Formal Correction: Erratum: Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform
Posted by JoVE Editors on 6/05/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66058

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