肺部感染性疾病的微生物学快速现场评估

摘要

本方案展示了一种快速且标准化的微生物学现场快速评估（M-ROSE）工作流程，包括制片、染色和判读三个步骤。该方案将有助于临床医生快速做出诊疗决策。

摘要

对于病因未明的肺部感染患者，及时启动经验性抗感染治疗至关重要。尽管在临床实践中影像学检查相对简便，但其特异性不足，常需进一步进行耗时的检查，如痰培养、支气管肺泡灌洗液培养或基因测序，以准确确定疾病的潜在病因。此外，经验性抗感染治疗疗效有限，可能导致抗生素滥用。近年来，在快速现场评估（ROSE）涂片上解读微生物背景方面的进展，使临床医生能够通过支气管镜检查（如肺泡灌洗、黏膜刷检、组织钳取）迅速获取样本，并在床旁完成染色与判读，从而提供关键的微生物背景信息。这为制定靶向抗感染治疗和个体化用药方案奠定了基础。通过实时明确致病病原体，医生可避免不必要的广谱抗生素使用，减少抗生素耐药性的发生。在呼吸内科或重症监护病房建立快速、标准化的M-ROSE工作流程，将极大帮助医生为患者制定精准的治疗策略，具有重要的临床意义。

引言

快速现场评估（ROSE）技术是肺部疾病诊疗领域中一种高效的方法。该技术可实现样本的实时采集与诊断性干预，便于即时进行细胞学分析¹。这一创新方法包括将部分组织标本印迹至载玻片上，同时保持其完整性。ROSE 的主要优势之一在于能够通过专门的显微镜技术对临床信息进行快速解读。这包括细胞形态分析、分类、定量、成分比例确定、排列方式评估、相关性分析、背景评估以及异物识别。通过将上述所有数据与患者的临床信息相结合，ROSE 在评估取样充分性以及指导实时介入操作与技术方面发挥着关键作用²。

作为ROSE技术的分支，M-ROSE技术主要关注获取目标病灶的微生物学背景，而非区分良恶性细胞^3,4。一方面，M-ROSE能够实现对曲霉（Aspergillus）、隐球菌（Cryptococcus）、肺孢子菌（Pneumocystis）和念珠菌（Candida）等病原体的显微镜下识别⁵；另一方面，其在评估呼吸道标本质量、鉴别感染性与非感染性疾病、区分感染与污染，以及评价感染严重程度和预后方面具有重要的指导意义^6,7。例如，在呼吸道标本中，形态一致的细菌与浸润性炎性细胞共存提示存在感染；相反，多种形态各异的细菌伴随上皮细胞出现则提示污染。M-ROSE能够全面分析临床信息并预测疾病转归，使其成为肺部疾病诊疗过程中不可或缺的工具。

综上所述，ROSE 作为一种关键的细胞学辅助手段，可显著提高肺部疾病诊断的效率与准确性。其多方面的功能通过实时取样和诊断性干预技术，确保及时干预，促进准确诊断，从而改善患者的临床结局。然而，需要强调的是，这些进展依赖于获取合格的样本。本文提出了一套标准化的 M-ROSE 操作流程，涵盖涂片制备、染色技术及判读指南。该流程为临床医生建立准确的评估与治疗方案提供了宝贵的参考，并有助于决策后续对靶标样本的处理方式。

方案

该临床试验已获得重庆市中医院伦理委员会的批准（批准号：2022-ky-31）。典型病例为一名确诊为肺孢子菌肺炎的患者，且已获得该患者的知情同意。

1. ROSE 所需的设备和材料

1. 仪器设备：请参阅本实验方案所用仪器的材料表文件。
   注意：必须使用专用的细胞学显微镜及图像采集系统（图1A）。
2. 材料准备（见材料表）。
   1. 准备无菌细胞培养载玻片（具有强细胞黏附性）、吸水纸、无粉乳胶手套、一次性2.5–5 mL注射器针头，并将全套Diff Quik（DQ）染色液置于带密封盖的玻璃染色缸中，以便操作（图1）。

2. M-ROSE 工作流程

1. 细胞学涂片的制备
   注意：制备载玻片的方法有多种，以下是几种常用的制备方法。
   1. 滚动载玻片
      注意：确保在此过程中尽量减少组织样本的损失。
      1. 使用容量为2.5–5 mL的一次性注射器针头提取组织颗粒（图2A).
      2. 从染色端（细胞贴附较强的末端）的内侧三分之一向 外侧三分之一区域，在无菌细胞学载玻片上涂抹成一个直径约1 cm、厚度适中的圆形区域。
   2. 刷片
      注意：本方法适用于采用常规细胞刷、防污染细胞刷或超细细胞刷获取的标本，以及痰液和黏稠体液等半液体标本。
      1. 伸出刷头，将其涂抹于无菌细胞学玻片的远端三分之一处（该玻片具有较强的细胞黏附性），形成一个约2 cm × 1 cm、厚度适中的矩形区域。
   3. 喷雾载玻片
      1. 将穿刺针置于无菌细胞学载玻片染色端的三分之一处，该载玻片应具有较强的细胞黏附性。
      2. 从内侧向外侧对穿刺针尖施加气压，穿刺形成一个直径约1 cm、厚度适中的圆形区域。
2. 细胞学涂片染色
   注意：世界卫生组织（WHO）推荐使用Diff染料对ROSE细胞学涂片进行快速染色⁵染料可重复使用，但不宜多次重复使用。若出现沉淀，使用后应进行过滤。染色过深时，可用甲醇或乙醇适当脱色，最好避免重新染色。若染色过深或过浅，应调整染色时间或工作液浓度；pH值对染色有一定影响，载玻片应保持清洁，无酸碱污染。Diff A液和Diff B液均具有挥发性，使用后应密封保存。
   1. 将载玻片浸入Diff A溶液中10-30秒（图2B），然后将其放入 PBS 染色液中清洗，以去除多余的 Diff A 溶液，并轻轻振去残留的缓冲液（图 2C).
   2. 接下来，将载玻片浸入Diff B溶液中20-40秒（图2E).
   3. 最后，将玻片放入水染色缸中清洗（图2F），用吸水纸印干并擦去载玻片上残留的液体（图 2D），完成染色。
      注意：M-ROSE 可实现对致病性微生物的直接可视化，并有助于评估呼吸道标本质量，能够区分感染与非感染以及感染与污染，在感染严重程度评估和预后判断中具有指导意义。讨论部分将涵盖这一方面，因其不涉及任何实验操作步骤。

结果

典型病例中，一名63岁男性因咳嗽、发热和胸痛入院。该患者既往被诊断为肾病综合征，表现为蛋白尿和水肿，长期接受泼尼松和他克莫司治疗。初始实验室检查显示白细胞计数为10.49 × 10⁹/L，中性粒细胞计数为8.87 × 10⁹/L，全血C反应蛋白和(1-3)-β-D-葡聚糖浓度分别为155.81 mg/L和249.7 pg/mL。胸部计算机断层扫描（CT）显示双肺弥漫性、双侧性且以中央分布为主的磨玻璃样影（图3A）。初始使用头孢哌酮/他唑巴坦进行抗感染治疗无效，患者症状加重，出现心源性乏力、呼吸困难及活动后气促；重复CT影像未见明显改善（图3B）。随后，患者转入重症监护病房（ICU）接受机械通气，并行支气管镜检查。在虚拟导航引导下进行靶向取样，共采集三份钳取活检组织（图4）。现场快速评价（ROSE）可用于立即进行组织的显微镜评估，确诊为Pneumocystis jiroveci感染（图5A）。患者立即开始接受磺胺甲噁唑抗真菌治疗（1.92 g，每6小时一次）；后续染色结果（图5B-E）进一步证实该诊断。然而，重复CT影像仍显示无明显改善（图3C）。患者随后接受卡泊芬净治疗（首日70 mg，之后每日50 mg）、甲泼尼龙（每日80 mg）及免疫球蛋白（每日10 g）治疗真菌感染。症状迅速缓解，患者继续接受后续治疗。

图 1：仪器与材料。（A）细胞学显微镜及图像采集系统。（B）Diff Quik（DQ）染色液 A。（C）Diff Quik（DQ）染色液 B。（D）无粉乳胶手套。（E）无菌细胞培养载玻片。（F）一次性 2.5–5 mL 注射器针头。（G）吸水纸。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：M-ROSE 工作流程。 (A) 打印载玻片。(B) 将载玻片浸入 Diff A 溶液中 10–30 秒。(C) 在 PBS 染色液中冲洗载玻片，以去除多余的 Diff A 溶液。(D) 用吸水纸吸去并擦净载玻片上残留的液体。(E) 将载玻片浸入 Diff B 溶液中 20–40 秒。(F) 在水染色槽中清洗载玻片。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：胸部CT图像。（A）入院时。（B）转入重症监护室（ICU）当天。（C）复方磺胺甲噁唑治疗后请点击此处查看该图的放大版本。

图4：通过虚拟支气管镜导航（VBN）定位右肺下叶后基底段。 （A）右主支气管。（B）右中叶支气管。（C）右肺下叶支气管的后基底段。（D）VBN的三维图谱。（E）胸部CT的冠状位图谱。（F）胸部CT的轴位图谱。（G）胸部CT的矢状位图谱 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：不同染色方法下肺孢子菌形态的图像记录。（A）ROSE 染色，100 × 10；白色箭头：含子囊孢子的包囊。（B）苏木精-伊红（H-E）染色，60 × 10。（C）阿利新蓝染色，60 × 10。（D）吉姆萨染色，40 × 10。（E）六胺银染色，20 × 10。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

介入肺脏病学是现代呼吸系统疾病领域中一个重要的分支，尤其在肺部疾病的诊断中得到了广泛应用^8,9。近年来，由于肺部恶性肿瘤发病率上升、下呼吸道中耐药病原体感染增多，以及对疑难和危重呼吸系统疾病的诊断需求日益增加，诊断性介入肺脏病学迅速发展^10,11,12。介入诊断的效率受到病灶大小和解剖位置、并发症发生率与活检部位数量以及基础疾病等多种因素的影响，这推动了多种先进技术和设备在临床中的应用¹³。快速现场评价（ROSE）受到了广泛关注，并迅速成为介入肺脏病学诊断中的一种"实时伴随技术"。

ROSE 旨在对穿刺、活检和刷检等操作中获取的标本进行快速评估、初步诊断及标本满意度的优先排序，从而提供反馈以指导后续技术改进^14,15,16,17。M-ROSE 是 ROSE 的一个分支，主要关注微生物背景的评估，而非组织细胞恶性的判断⁵。M-ROSE 方法是一种快速评估技术，而非诊断工具，因此不应夸大其诊断效能。其临床应用主要包括以下几个方面：特定病原微生物的形态学识别、感染与污染的区分，以及感染与非感染的鉴别⁷。

快速染色后，组织的细胞核呈紫红色，而细胞质呈蓝紫色。细菌和真菌呈蓝色，从而在组织细胞与病原体之间形成明显对比⁷M-ROSE 在鉴定细菌和真菌方面表现出一定程度的能力。具体而言，其对某些目标具有较高的阳性检出率 曲霉菌，隐球菌, Pneumocystis jirovecii以及其他真菌^3,18然而，该方法在识别体积和直径较小的病原体或胞内病原体时存在局限性。必须强调的是，任何疾病的诊断都应基于对患者基本状况、临床表现、影像学检查及其他因素的综合评估，而不能仅依赖于病原微生物的显微镜检识别。

M-ROSE 在感染和污染的识别方面也具有优势，例如可用于评估肺泡灌洗液样本的质量。在条件允许的科室，可通过离心和染色在床旁对灌洗液进行评估。合格的肺泡灌洗液样本在低倍镜下观察时，鳞状上皮细胞占所有细胞（不包括红细胞）的比例应小于 1%，柱状上皮细胞小于 5%，红细胞小于 10%（排除创伤或出血相关因素）¹⁹。对细胞学背景的显微镜检查将有助于我们及时作出评估。

此外，M-ROSE 有助于区分感染性与非感染性病灶⁵。在感染性病灶中，常可见中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润，偶尔可观察到中性粒细胞的吞噬现象；相反，非感染性病灶通常缺乏炎性细胞浸润。

本文展示的方案演示了M-ROSE的操作流程；通过解读微生物学背景，可进行初步诊断或缩小鉴别诊断范围。根据我们的研究结果，肺孢子菌肺炎（PCP）的诊断必须基于Pneumocystis jiroveci的明确证据，而不能仅依据临床表现和影像学检查，即使是在有症状的高危患者中也是如此。子囊和滋养体形态的显微镜下识别是最直观的诊断依据。诊断效率在很大程度上取决于标本的染色方法。传统上可用于PCP检测的染色方法包括Wright-Giemsa染色、六胺银染色和亚甲蓝染色，但这些方法耗时较长且敏感性较低。本案例中，通过使用ROSE技术，在患者转入重症监护室（ICU）的第一天即迅速确诊了PCP。Diff-quick染色在识别肺孢子菌方面展现出显著优势，其特点是结构清晰、对比度高，易于识别子囊（图5A）。

在民族医药的应用中，ROSE也具有重要价值。例如，在化脓性疾病中，临床医生可在微生物背景下识别出以中性粒细胞为主的多种炎性细胞⁵。因此，可选择具有清热解毒功效的药物作为这些疾病的潜在治疗方案，如金银花、蒲公英、败酱草等。

由于ROSE是一项额外的程序，在介入性肺脏病学中并非必须选择，因此实施ROSE必然增加人力和经济成本。ROSE是否应常规使用仍存在争议。从经济角度考虑，我们关注的是时间与人力成本。主要增加的人力需求在于评估人员。ROSE评估可由细胞学技术员、病理学家或临床医生完成。细胞学技术员是最适合执行ROSE操作的人员。然而在临床实践中，通常由临床医生承担这一角色，但可能需要一定的培训基础¹⁵。既往研究表明，培训项目有助于提高临床医生对样本充足性评估的准确性，并消除混杂因素的影响²⁰。此外，M-ROSE作为一种形态学诊断技术，其结果报告存在主观因素。临床医生应结合其他临床信息进行综合判断。

我们建议具备适当设施和 trained professionals 的医院在呼吸科或重症监护室（ICUs）中考虑实施 ROSE 操作，因为它有助于对疑难呼吸系统危重症进行早期评估，并有效指导临床治疗。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞学显微镜	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) 染色液	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
一次性 2.5-5 mL 注射器针头	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
无粉乳胶手套	河南亚都实业有限公司	20182140728
无菌细胞培养载玻片	济南普瑞特工贸有限公司	7101