对于表观遗传学领域的新手研究人员而言，CUT&Tag 是比 ChIP 检测显著更简便的替代方法。CUT&Tag 极大地推动了对稀有细胞和原代细胞群体的表观遗传学研究，仅需极少量细胞即可生成高质量数据。本方案描述了对从小鼠后肢肌肉中分离的小鼠成肌细胞进行 H3K4me1 CUT&Tag 检测的操作流程。
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本文内容
摘要
摘要
本实验方案旨在为新研究人员提供使用靶向切割与标签化（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）技术全面分析染色质结合因子、组蛋白修饰及组蛋白变异体在基因组中定位的详细操作流程。CUT&Tag方案在小鼠成肌细胞和 freshly isolated muscle stem cells（MuSCs）中表现良好，只要细胞能够通过刀豆蛋白A（Concanavalin-A）磁珠固定，该方法便可轻松应用于多种其他细胞类型。与CUT&Tag相比，染色质免疫沉淀（ChIP）实验耗时较长，且需要在染色质材料用于免疫沉淀前进行预处理。在交联ChIP（X-ChIP）中，染色质预处理包括交联和超声破碎以将染色质片段化；而在天然ChIP（N-ChIP）中，染色质片段化通常通过微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease, MNase）消化实现。超声破碎和MNase消化均可能为ChIP实验引入一定偏差。相比之下，CUT&Tag实验步骤更少，所需细胞数量远少于ChIP，但能提供关于转录因子或组蛋白修饰在不同基因组位点分布的更无偏倚的信息。CUT&Tag可在低至5,000个细胞的样本上成功运行。由于其比ChIP具有更高的灵敏度和更低的背景信号，研究人员在测序后仅需数百万条读长即可获得可靠的峰信号数据。
引言
CUT&Tag 实验技术的发明旨在弥补染色质免疫沉淀（ChIP）实验中存在的一些明显缺陷1。ChIP 实验的两大主要缺点是：1）染色质片段化过程中引入的偏差；2）无法有效应用于细胞数量较少的样本。X-ChIP 实验通常依赖超声处理或 MNase 消化来获得染色质片段，而 N-ChIP 主要通过 MNase 消化获取核小体。超声处理倾向于作用于染色质结构较为松弛的区域（如启动子区域）2，而 MNase 消化在松弛的染色质纤维上同样具有更高的效率。此外，有研究报道 MNase 消化还存在依赖于 DNA 序列的偏好性3。因此，在 ChIP 实验的输入样本制备步骤中，无法以完全随机的方式从基因组所有类型的位点获得染色质片段。此外，与 CUT&Tag 相比，ChIP 实验通常会产生更高的背景信号，并且需要比 CUT&Tag 多出十倍以上的测序读长才能清晰地识别出峰所在位置1,4,5。这解释了为何 ChIP 实验必须起始于远多于 CUT&Tag 的细胞数量。对于可反复传代以获得大量细胞的细胞系而言，这并非问题。然而，对于稀有或珍贵的原代细胞群体，ChIP 实验显然不是一个强有力的表观遗....
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方案
本手稿中所述方法均经广州实验室机构动物护理和使用委员会批准。用于获得本手稿代表性结果的小鼠均按照广州实验室机构动物护理和使用委员会的指南进行饲养和管理。
1. 从小鼠后肢肌肉中分离成肌细胞（以1只小鼠为例）
- 用 ddH2O 将冰醋酸稀释至 0.02 M，并进行高压灭菌。
- 用 0.02 M 醋酸将胶原蛋白（来自大鼠尾部）稀释至 0.1 mg/mL。
- 将该胶原蛋白溶液加入培养皿中，在 37 °C 细胞培养箱中孵育过夜，以包被皿底。
- 使用前，移除胶原蛋白溶液，并用 1× PBS 洗涤培养皿两次。胶原蛋白溶液可重复使用 8–10 次。
- 处死一只 8–12 周龄的小鼠。（老年小鼠的 MuSCs 和成肌细胞产量较低。）
- 分离并取出小鼠全部后肢肌肉，置于一个 10 cm 培养皿中。
- 使用含青霉素/链霉素的 1× PBS 漂洗肌肉 4 次。每次漂洗后，均需将肌肉转移至新的培养皿中。
- 最后一次漂洗后，移除 PBS，并用剪刀将肌肉剪碎。
- 加入 6 mL 含 Dispase II（1.1 U/mL）和 Collagenase II（830 U/mL）的 1× PBS 以消化剪碎的肌肉，消化时间约为 1.5 小时。
- 进行消化时，可将剪碎的肌肉转....
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结果
在将细胞与伴刀豆球蛋白A磁珠结合前，请在显微镜下检查细胞悬液。相应地，将细胞与伴刀豆球蛋白A磁珠孵育后，将样品管置于磁力架上，并应再次使用显微镜观察上清液。这是为了评估细胞被伴刀豆球蛋白A磁珠捕获的效率。洗涤缓冲液含有7 x 105 细胞/毫升应呈现为 图 1A 在显微镜下。相比之下， 图 1B 上清液经伴刀豆球蛋白A磁珠结合后显示，磁珠已去除所有细胞。继续进行后续CUT步骤已无意义。&若伴刀豆球蛋白A磁珠未能有效捕获细胞，请标记。洗涤缓冲液中不应含有任何血清成分或EDTA/EGTA，因其可能破坏细胞膜与伴刀豆球蛋白A磁珠的结合。然而，牛血清白蛋白不会干扰伴刀豆球蛋白A与细胞的结合。
完成CUT制备后&通过 PCR 标记文库，取少量文库（3-4 µ可在1.2-1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，以检测文库质量是否合格。 图 2 展示了成功的H3K4me1 CUT&.......
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讨论
特定 CUT&Tag 反应所需的细胞数量完全取决于待检测的组蛋白修饰/变异体或染色质结合蛋白的富集程度。通常，对于富集程度较高的组蛋白修饰（如 H3K4me1、H3K4me3 和 H3K27ac 等），每个 CUT&Tag 反应使用 25,000–50,000 个成肌细胞已足够。然而，某些稀有的染色质结合蛋白可能需要多达 250,000 个细胞。CUT&Tag 检测中所用的细胞数量至关重要，若处理不当，通常会导致实验失败。在 CUT&Tag 反应中使用过多的细胞是有害的，尤其是在检测富集程度较高的组蛋白修饰时。起始细胞数量过多会导致每个细胞分配到的抗体不足。CUT&Tag 不仅适用于极低数量的细胞，实际上还可应用于单细胞水平1。
最重要的是，使用一种可靠且经过验证、具有高亲和力和特异性的抗体，始终是成功进行CUT&Tag实验的关键。与ChIP、免疫沉淀（IP）和免疫荧光（IF）实验一样，CUT&Tag也需要能够识别天然折叠抗.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了中国科学院战略性先导科技专项（XDA16020400，项目负责人：PH）和国家自然科学基金（32170804，项目负责人：PH）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| 胶原蛋白 | Corning | 354236 | |
| 胶原酶II | 沃辛顿 | LS004177 | |
| Concanavalin-A | Sigma-Aldrich | C5275 | |
| 刀豆球蛋白A珠 | Bangs Laboratories | BP531 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 300410 | |
| Dispase II | 赛默飞世尔科技 | 17105041 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30396.03 | |
| H3K4me1 抗体 | abcam | ab8895 | |
| Ham's F10培养基 | 赛默飞世尔科技 | 11550043 | |
| 过度活跃的通用CUT&Tag 测序文库构建试剂盒（适用于 Illumina 平台） | Vazyme | TD903 | 该试剂盒经我们测试，功能良好 |
| 1.5 mL EP管用磁力架 | Qualityard | QYM06 | |
| 8孔PCR管条磁力架 | Anosun 磁性 | CLJ16/21-021 | |
| NEBNext 高保真 2x PCR 预混液 | NEB | M0541L | 用于文库构建的PCR反应 |
| pA-Tn5 | Vazyme | S603-01 | 使用前需安装适配器 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| 蛋白酶K | Beyotime | ST535-100mg | |
| RPMI-1640 培养基 | 赛默飞世尔科技 | C11875500BT | |
| 二抗（豚鼠抗兔IgG） | Antibodies-online | ABIN101961 | |
| 亚精胺 | Sigma-Aldrich | S2626 | |
| TruePrep Index Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD202 | 该试剂盒提供 Illumina N7XX 和 N5XX 引物 |
| VAHTS DNA 纯化磁珠 | Vazyme | N411 | 可使用Ampure XP磁珠替代。可纯化CUT&文库构建及按大小筛选DNA片段 |
参考文献
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930(2019).
- Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding. eLi....
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