利用靶向切割和标签化（CUT&Tag）技术在小鼠成肌细胞研究中的应用

摘要

对于表观遗传学领域的新手研究人员而言，CUT&Tag 是比 ChIP 检测显著更简便的替代方法。CUT&Tag 极大地推动了对稀有细胞和原代细胞群体的表观遗传学研究，仅需极少量细胞即可生成高质量数据。本方案描述了对从小鼠后肢肌肉中分离的小鼠成肌细胞进行 H3K4me1 CUT&Tag 检测的操作流程。

摘要

本实验方案旨在为新研究人员提供使用靶向切割与标签化（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）技术全面分析染色质结合因子、组蛋白修饰及组蛋白变异体在基因组上定位的详细操作流程。CUT&Tag方案在小鼠成肌细胞及 freshly isolated muscle stem cells（MuSCs）中表现优异。只要细胞能够通过刀豆蛋白A（Concanavalin-A）磁珠固定，该方法便可轻松应用于多种其他细胞类型。与CUT&Tag相比，染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）实验耗时较长。ChIP实验需要在染色质材料用于免疫沉淀前进行预处理。在交联ChIP（X-ChIP）中，染色质预处理包括交联和超声处理以打断染色质；而在天然ChIP（N-ChIP）中，染色质片段通常通过微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease, MNase）消化获得。超声处理和MNase消化均可能为ChIP实验引入一定偏差。CUT&Tag实验步骤更少，所需细胞数量远少于ChIP，但能提供关于转录因子或组蛋白修饰在不同基因组位点更为无偏倚的信息。CUT&Tag可在低至5,000个细胞的样本中完成。由于其比ChIP具有更高的灵敏度和更低的背景信号，研究人员在测序后仅需数百万条读长即可获得可靠的峰信号数据。

引言

CUT&Tag 实验技术的发明旨在弥补染色质免疫沉淀（ChIP）实验中存在的一些明显缺陷¹。ChIP 实验的两大主要缺点是：1）染色质片段化过程中引入的偏差；2）无法有效应用于细胞数量较少的样本。X-ChIP 实验通常依赖超声处理或 MNase 消化来获得染色质片段，而 N-ChIP 主要使用 MNase 消化来获取核小体。超声处理倾向于作用于染色质结构较为松弛的区域（如启动子区域）²，而 MNase 消化在松弛的染色质纤维上同样效率更高。此外，有研究报道 MNase 消化还存在依赖于 DNA 序列的偏好性³。因此，在 ChIP 实验的输入样本制备步骤中，无法以完全随机的方式从基因组所有类型的位点获得染色质片段。此外，与 CUT&Tag 相比，ChIP 实验通常会产生更高的背景信号，并且需要比 CUT&Tag 多出十倍以上的测序深度才能清晰识别峰所在位置^1,4,5。这解释了为何 ChIP 实验必须起始于远多于 CUT&Tag 的细胞数量。在研究细胞系时，这一问题并不突出，因为细胞系可通过反复传代获得大量细胞。然而，对于稀有或珍贵的原代细胞群体而言，ChIP 实验显然不是一种强有力的表观遗传学研究工具，尽管原代细胞在实际应用和医学研究中具有更重要的意义。

尽管染色质免疫沉淀（ChIP）实验步骤漫长且复杂，使一些研究人员不愿学习或使用该技术，但人们通常更熟悉免疫细胞化学（ICC）或免疫荧光（IF）等较为简便的检测方法。CUT&Tag 实验本质上类似于 ICC 和 IF 实验的操作流程，只是整个过程在试管中进行。CUT&Tag 不需要起始阶段的染色质片段化，相反，基因组必须保持完整，以利于抗体结合¹。在典型的 ChIP 实验第一天，研究人员通常需要花费长达 4 小时，通过超声处理或 MNase 消化从细胞核中制备片段化的染色质，之后才能将这些短片段染色质与抗体-磁珠混合^4,5。相比之下，CUT&Tag 实验第一天的工作仅需将细胞固定于刀豆蛋白 A（Concanavalin-A）磁珠上，随后加入一抗至细胞-磁珠复合物中即可，整个过程仅需约 40 分钟¹。

值得指出的是，靶点切割与核酸酶释放（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease, CUT&RUN）是CUT&Tag的一种重要替代方法。CUT&RUN的建立基于与CUT&Tag相似的工作机制。在CUT&Tag中，抗体引导pA/G-Tn5转座酶到达染色质上所有目标位点，该酶在每个位点切割出一段染色质片段，同时将文库构建接头标记到这些片段上；而在CUT&RUN中，pA/G-Tn5的作用由pA/G-MNase取代，后者仅执行切割步骤⁶。因此，与CUT&Tag相比，CUT&RUN需要额外一步操作，即将文库构建接头连接到pA/G-MNase切割产生的DNA片段上^7,8。由于CUT&Tag与CUT&RUN具有高度相似性，熟悉CUT&Tag的研究人员可轻松掌握并熟练开展CUT&RUN实验。然而，应注意CUT&Tag与CUT&RUN之间仍存在一些细微差异。CUT&RUN方案通常在洗涤步骤中使用生理盐浓度（约150 mM），而CUT&Tag所用的300-Dig洗涤缓冲液则为高盐条件。因此，在分析组蛋白修饰/变异体或转录因子时，CUT&Tag在背景控制方面表现更优，因为这些蛋白质能够直接且牢固地结合DNA¹。当用于检测不直接结合DNA且与染色质亲和力较弱的染色质相关因子时，CUT&Tag可能会遇到问题。CUT&Tag中的高盐洗涤步骤可能将这些染色质相关因子洗脱，导致最终结果中无信号检出。尽管已有成功案例表明CUT&Tag可用于部分非组蛋白/非转录因子蛋白的分析⁹，我们仍推荐使用CUT&RUN而非CUT&Tag来分析与染色质结合较弱的蛋白。

哺乳动物达到成年阶段后，其骨骼肌组织中仍含有肌肉干细胞。在肌肉损伤过程中，这些干细胞可被激活，并通过细胞数量扩增和分化来再生受损的肌纤维¹⁰。这些干细胞被称为肌肉干细胞/卫星细胞（MuSCs）。当MuSCs从动物体内分离出来或因肌肉损伤被激活后，便会开始增殖并转化为成肌细胞。

为了从鼠骨骼肌消化物中获取肌肉干细胞（MuSCs），通常单独或联合使用MuSC表面标志物（如Vcam1（Cd106）、Cd34和α7-整合素（Itga7）），在荧光激活细胞分选（FACS）过程中富集MuSCs¹¹。研究表明，Cd31^-/Cd45^-/Sca1^-/Vcam1⁺可能是获得纯度>95%的MuSCs的最佳标志物组合¹²。FACS可在新鲜肌肉组织消化后立即分离出高纯度的MuSCs。然而，如果实验设计不需要在分离时即获得高纯度MuSCs，则预贴壁法比FACS更具成本效益，可用于获得纯度>90%的成肌细胞（MuSC的子代细胞）。

从小鼠中 freshly 分离的 MuSCs 在添加胎牛血清（FBS）的 Ham's F10 培养基中增殖效率较低。为了更有效地扩增 MuSCs 细胞数量并获得足够的成肌细胞，应使用牛生长血清（BGS）替代 FBS。然而，若无法获得 BGS，可将 Ham's F10 完全培养基（含约 20% FBS）与等体积的 T 细胞条件培养基混合，以显著促进成肌细胞的扩增¹³。因此，本方案还将描述用于 MuSCs 的 T 细胞条件培养基的制备方法。

最重要的是，本方案提供了在从小鼠后肢肌肉分离的小鼠成肌细胞上进行 H3K4me1 CUT&Tag 检测的完整示例。请注意，本方案也适用于其他细胞类型、组蛋白修饰及组蛋白变体，读者只需根据自己研究的特定组蛋白修饰或变体的富集情况，优化细胞数量或抗体用量即可。

为了在CUT&Tag或CUT&RUN中使用，Tn5或MNase需要与蛋白A或蛋白G融合，以生成pA-Tn5、pG-Tn5、pA-MNase或pG-MNase。显然，蛋白A和蛋白G也可以同时融合到这些酶上，生成pA/G-Tn5或pA/G-MNase。蛋白A和蛋白G对来自不同物种的IgG具有不同的亲和力。因此，将蛋白A和蛋白G同时融合到酶上可以克服这一问题，使该酶能够兼容多种物种来源的抗体。

方案

本手稿中所述方法均经广州实验室机构动物护理和使用委员会批准。用于获得本手稿代表性结果的小鼠均按照广州实验室机构动物护理和使用委员会的指南进行饲养和管理。

1. 从小鼠后肢肌肉中分离成肌细胞（以1只小鼠为例）

1. 用 ddH₂O 将冰醋酸稀释至 0.02 M，并进行高压灭菌。
2. 用 0.02 M 醋酸将胶原蛋白（来自大鼠尾部）稀释至 0.1 mg/mL。
3. 将该胶原蛋白溶液加入培养皿中，在 37 °C 细胞培养箱中孵育过夜，以包被皿底。
4. 使用前，移除胶原蛋白溶液，并用 1× PBS 洗涤培养皿两次。胶原蛋白溶液可重复使用 8–10 次。
5. 处死一只 8–12 周龄的小鼠。（老年小鼠的 MuSCs 和成肌细胞产量较低。）
6. 分离并取出小鼠所有后肢肌肉，置于一个 10 cm 培养皿中。
7. 使用含青霉素/链霉素的 1× PBS 漂洗肌肉 4 次。每次漂洗后，均需将肌肉转移至新的培养皿中。
8. 最后一次漂洗后，移除 PBS，并用剪刀将肌肉剪碎。
9. 加入 6 mL 含 Dispase II（1.1 U/mL）和 Collagenase II（830 U/mL）的 1× PBS 以消化剪碎的肌肉，消化时间约为 1.5 小时。
10. 进行消化时，可将剪碎的肌肉转移至离心管中，置于 37 °C 水浴中；或直接将剪碎的肌肉留在培养皿中，放入 37 °C CO₂ 细胞培养箱中。
11. 若使用细胞培养箱进行消化，应每隔 15–30 分钟轻轻摇动培养皿，以充分混匀消化液。
    注意：Dispase II 应先用 DMEM 培养基（无血清）配制成 11 U/mL 的储存液，Collagenase II 应先用 1× PBS 配制成 10,000 U/mL 的储存液。
12. 消化完成后，使用 10 mL 塑料移液管反复吹打消化组织数次，以充分混匀消化混合物。
13. 加入 10 mL MuSC/成肌细胞生长培养基以减缓消化反应。MuSC/成肌细胞生长培养基的配制方法详见第 2 节。
14. 将混合物通过 70 µm 滤网过滤。用 1× PBS 冲洗消化用培养皿，并将冲洗液也通过滤网，以收集消化皿中所有细胞。
15. 在 350 × g 条件下离心 10 分钟，用真空泵弃去上清液。
16. 用 20 mL 1× PBS 重悬细胞沉淀，并通过 40 µm 滤网过滤。
17. 在 350 × g 条件下离心 5 分钟，用真空泵移除上清液。
18. 用 20 mL MuSC/成肌细胞生长培养基重悬细胞，并将细胞接种至一个 10 cm 普通塑料培养皿中。在此期间，MuSCs 无法贴附于皿底，主要悬浮于培养基中。
    注意：这是第一次在塑料培养皿上的预贴壁步骤。
19. 1.5 小时后，轻轻摇动培养皿，将液体转移至两个胶原蛋白包被的 10 cm 培养皿中，每个培养皿加入 10 mL 培养基。此时 MuSCs 将贴附并在胶原蛋白包被的培养皿上生长。2 天后更换培养基。胶原蛋白包被的培养皿制备方法见本节步骤 1–4。
20. 再过一天后进行传代：移除培养基，用 1× PBS 洗涤细胞一次，然后用胰蛋白酶消化细胞。
21. 用 MuSC/成肌细胞生长培养基将细胞从培养皿上吹打下来，转移至新的塑料培养皿中，在细胞培养箱中孵育 40 分钟。
    注意：这是第二次在塑料培养皿上的预贴壁步骤。
22. 将培养液倒入另一个新的塑料培养皿中，在细胞培养箱中继续孵育 20 分钟。
    注意：这是第三次在塑料培养皿上的预贴壁步骤。
23. 然后将培养皿中的上清液分装至 8 个胶原蛋白包被的 10 cm 培养皿中进行细胞继代培养。此处传代比例为 2:8（即 1:4）。经过上述三次预贴壁后，成肌细胞纯度可超过 90%。因此，此后进一步传代时无需再进行预贴壁处理。

2. MuSC/成肌细胞生长培养基的制备（以5只小鼠为例）

1. 处死5只年轻健康的野生型小鼠，取出脾脏，并用1×PBS（含青霉素/链霉素）冲洗脾脏一次。
2. 使用剪刀去除脾脏上发黑的部分或斑点（如有）。若脾脏大部分已变黑，则丢弃该脾脏。
3. 将全部5个脾脏置于置于50 mL离心管上方的40 µm细胞筛网上。
4. 打开无菌1 mL注射器包装，抽出活塞，丢弃针筒部分。
5. 在40 µm细胞筛网上，握住橡胶塞，用注射器活塞的指托部分研磨并解离脾组织，使其成为单细胞悬液。撕开注射器包装时需小心，避免触碰并污染活塞的指托部分。
6. 研磨脾脏过程中，不时用1×PBS冲洗，将已解离的脾细胞冲入细胞筛网下方的50 mL离心管中。
7. 待所有脾细胞均通过细胞筛网进入50 mL离心管后，以500 × g 离心10分钟。
8. 用1 mL 1×红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，裂解红细胞约1分钟。
   注意：10×红细胞裂解缓冲液含有155 mM NH₄Cl、10 mM NaHCO₃ 和1 mM EDTA二钠盐，溶于ddH₂O中。过滤除菌，切勿高压灭菌。使用前用ddH₂O稀释至1×。
9. 用1×PBS加满50 mL离心管，以终止红细胞裂解过程。
10. 再次用40 µm细胞筛网过滤细胞悬液，然后以500 × g 离心10分钟。
11. 用2 mL RPMI-1640完全培养基（含10% FBS及青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基）轻轻吹打重悬细胞。
12. 向离心管中加入更多RPMI-1640完全培养基并充分混匀。将细胞悬液分装至十个T75培养瓶中，每个T75培养瓶的终体积应为20 mL。
13. 向每个T75培养瓶中加入10 µL刀豆蛋白A（Concanavalin-A）储备液，并充分混匀。刀豆蛋白A可激活T细胞增殖。
    注意：刀豆蛋白A储备液浓度为4 mg/mL，由刀豆蛋白A溶于1×PBS制备。此处使用的是刀豆蛋白A本身，切勿与后续CUT&Tag实验中使用的刀豆蛋白A磁珠混淆。
14. 48小时后，向每个T75培养瓶中补充20 mL RPMI-1640完全培养基，使总体积达到40 mL。
15. 再过24小时后，收集每个T75培养瓶中的全部培养液，以600 × g 离心3分钟。
16. 上清液即为T细胞条件培养基，可在-20 °C至-80 °C保存最多2个月。弃去脾细胞沉淀。使用前将T细胞条件培养基解冻，并用0.22 µm滤膜进一步除菌。
17. 制备Ham's F10完全培养基：向500 mL Ham's F10培养基中加入100 mL FBS、300 µL bFGF储备液和6 mL青霉素/链霉素。
    注意：bFGF储备液浓度为5 µg/mL，由bFGF溶于Ham's F10培养基制备。
18. 将上述过滤后的T细胞条件培养基与Ham's F10完全培养基按1:1比例混合，制得MuSC/成肌细胞生长培养基。

3. 使用成肌细胞进行CUT&Tag（3个CUT&Tag反应示例）

1. 关键试剂的制备
   1. 使用已发表的方法¹⁴从细菌培养物中自行纯化 pA/G-Tn5 转座酶。该酶只有在装载建库用 DNA 接头后才能达到其功能形式。最重要的是，pA/G-Tn5 可从多个商业来源购得。
   2. 用于制备接头的寡核苷酸序列见表1。具体而言，分别将 Oligo-Rev 与 Oligo-A 和 Oligo-B 退火，以相应地形成双链的 Adaptor-A 和 Adaptor-B。有关接头退火的详细步骤可参见其他文献¹⁴。
   3. 在室温（RT）下将 Adaptor-A 和 Adaptor-B 与 pA/G-Tn5 转座酶孵育 2 小时。此后，该转座酶将进入其功能状态。在本文后续部分中，pA/G-Tn5 的功能形式将被称为 pA/G-Tn5a。
      注：如果 pA/G-Tn5 是购买获得而非自行制备，请务必确认所购产品是否为已装载接头的 pA/G-Tn5（即即用型），还是仅为 pA/G-Tn5 酶本身。若仅为酶，则需先制备上述两种接头，并在用于 CUT&Tag 实验前将其装载到 pA/G-Tn5 上。
   4. 关于结合缓冲液（Binding buffer）、洗涤缓冲液（Wash buffer）、Digitonin-洗涤缓冲液（Dig-wash buffer）、300-Dig 缓冲液和片段化缓冲液（Tagmentation buffer）的配方，读者可参考 Kaya-Okur 等人的研究¹。
   5. 配制结合缓冲液，其成分为 20 mM HEPES（pH 7.5）、10 mM KCl、1 mM CaCl₂、 和 1 mM MnCl₂。
   6. 配制洗涤缓冲液，其成分为 20 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.5 mM 亚精胺（Spermidine）和 1×蛋白酶抑制剂混合物（Protease inhibitor cocktail）。
   7. 将皂苷（digitonin）溶于 DMSO 中配制成高浓度母液，然后将其加入洗涤缓冲液中，使终浓度为 0.5 mg/mL，从而制备 Dig-wash 缓冲液。
   8. 在 Dig-wash 缓冲液中加入 EDTA 至终浓度 2 mM 和 BSA 至终浓度 0.1%，以配制抗体缓冲液（Antibody buffer）。
   9. 配制 300-Dig 缓冲液，其成分为 20 mM HEPES（pH 7.5）、300 mM NaCl、0.5 mM 亚精胺、1×蛋白酶抑制剂混合物以及 0.1–0.5 mg/mL 皂苷。
   10. 在 300-Dig 缓冲液中添加 10 mM MgCl₂ 以配制片段化缓冲液。MgCl₂ 可激活 pA/G-Tn5a 的酶活性。
       注：其他材料的相关信息见材料表文件。
2. 刀豆蛋白 A（Concanavalin-A）磁珠活化
   1. 在 1.5 mL 离心管中，将 30 µL 刀豆蛋白 A 磁珠（每反应 10 µL）与 300 µL 结合缓冲液混合，反复倒置数次以充分混匀。将离心管置于磁力架上，待液体澄清后，吸除上清液。
   2. 将离心管从磁力架上取下，加入 300 µL 结合缓冲液，充分混匀后均分至 8 孔 PCR 条板的 3 个孔中。将每个孔标记为一个独立的 CUT&Tag 反应。
   3. 将 8 孔 PCR 条板置于磁力架上，静置至液体澄清。
   4. 吸除上清液，将离心管从磁力架上取下，向每管中加入 10 µL 结合缓冲液并充分混匀。将活化后的磁珠置于冰上或 4 °C 保存，直至细胞准备就绪。
3. 将细胞结合至刀豆蛋白 A 磁珠
   1. 用胰蛋白酶消化贴壁培养的小鼠成肌细胞，使其脱离培养板，用室温的 1×PBS 洗涤细胞一次，最终在洗涤缓冲液中于室温下重悬细胞。避免过度消化，因为这会降低细胞膜与刀豆蛋白 A 磁珠的结合能力。
   2. 将细胞密度调整至约 7 × 10⁵ 个细胞/mL（在洗涤缓冲液中），使 100 µL 细胞悬液含有约 70,000 个细胞，足以满足一个 CUT&Tag 反应的需求。
   3. 用移液器将 100 µL 细胞悬液加入已含有 10 µL 活化刀豆蛋白 A 磁珠的 8 孔 PCR 条板各孔中，充分混匀，并在"往复摇动"振荡器上于室温孵育 10 分钟。
   4. 将 8 孔 PCR 条板置于磁力架上，待液体澄清后，吸除上清液。
   5. 为评估刀豆蛋白 A 磁珠是否高效捕获了细胞，可在显微镜下检查上清液中残留的细胞数量。在完成刀豆蛋白 A 磁珠结合步骤后，上清液中应几乎无或完全没有细胞。
4. 用一抗孵育细胞
   1. 对于每个样本，将 1 µL H3K4me1 抗体稀释于 50 µL 抗体缓冲液中，并将稀释后的抗体加入各样本管中。通过反复倒置混匀磁珠与稀释抗体。将样本置于"往复摇动"振荡器上，在 4 °C 下过夜孵育。
      注：正如 Steven Henikoff 博士所述¹，并非所有 CUT&Tag 实验都必须使用 IgG 阴性对照。与染色质免疫沉淀（ChIP）相比，CUT&Tag 实验的背景信号极低甚至无背景信号。因此，使用 IgG 进行"阴性对照" CUT&Tag 实验并不能提供有用信息。相反，使用经过 CUT&Tag 验证的抗体进行阳性对照实验，对于评估 CUT&Tag 实验是否成功至关重要。
5. 用二抗孵育细胞
   1. 次日早晨，将样本置于磁力架上，待液体澄清。
   2. 吸除上清液（即一抗溶液）。无需洗涤磁珠；直接向每个样本管中加入 50 µL 稀释（1:100）的二抗。
      注：二抗使用 Dig-wash 缓冲液按 1:100 比例稀释。为使 pA/G-Tn5a 更高效识别，二抗不应偶联任何分子或基团，如 HRP、生物素或荧光基团。
   3. 充分混匀后，在"往复摇动"振荡器上于室温孵育 1 小时。
   4. 将样本重新置于磁力架上，待液体澄清后，弃去上清液。
   5. 向每管中加入 200 µL Dig-wash 缓冲液，反复倒置数次以洗去未结合的过量抗体。
   6. 再次置于磁力架上，待液体澄清后，吸除上清液。重复此洗涤步骤两次，以彻底去除未结合的过量抗体。
6. 用 pA/G-Tn5a 孵育细胞
   1. 最后一次洗涤后，将样本置于磁力架上，待液体澄清后，吸除管内所有液体。向每个样本管中加入 100 µL 含 0.04 µM pA/G-Tn5a 的 300-Dig 缓冲液。充分混匀后，在往复摇动振荡器上于室温孵育 1 小时。
   2. 置于磁力架上，待样本澄清后，吸除上清液。
   3. 向每个样本中加入 200 µL 300-Dig 缓冲液，充分混匀，并在振荡器上于室温洗涤 3 分钟。
   4. 置于磁力架上，待样本澄清后，吸除上清液。重复此洗涤步骤两次，以去除过量的 pA/G-Tn5a 并降低背景信号。
7. 基因组的切割与片段化（tagmentation）
   1. 最后一次洗涤后，将样本置于磁力架上，彻底吸除管内液体。向每个样本中加入 50 µL 片段化缓冲液。充分混匀后，在 PCR 仪中于 37 °C 孵育 1 小时。请勿启用 PCR 仪的加热盖功能。
      注：可选步骤：由于后续基因组 DNA 纯化过程中可能存在材料损耗，可在片段化缓冲液中加入一些外源 spike-in DNA，使其出现在最终测序结果中，用于数据标准化。spike-in DNA 的制备与使用方法可参见其他文献¹⁴。
8. 总基因组 DNA 纯化
   1. 完成片段化后，向每个样本中再加入 150 µL 片段化缓冲液，总体积现为 200 µL。
   2. 然后，向每个样本中加入 10 µL 0.5 M EDTA、3 µL 10% SDS 和 2.5 µL 20 mg/mL 蛋白酶 K。涡旋混匀后，在 55^°C 下孵育 2 小时。
   3. 将每个样本转移至含 200 µL 酚/氯仿的 1.5 mL 离心管中，涡旋 10 秒。在 18,000 × g 下离心 5 分钟。将上层水相转移至新的 1.5 mL 离心管中。
   4. 向每管中加入 200 µL 氯仿，涡旋 10 秒，在 18,000 × g 下离心 5 分钟。
   5. 将上层水相吸至新的 1.5 mL 离心管中。然后向每个样本中加入 550 µL 100% 乙醇，在 -80 °C 下沉淀 DNA 1 小时。为更清晰地观察 DNA 沉淀，可加入 1 µL 20 mg/mL 甘油原（glycogen）。
   6. 在最大转速（>18,000 × g）下离心 15 分钟以沉淀 DNA。
   7. 小心倾去上清液，用 75% 乙醇洗涤甘油原/DNA 沉淀一次，再次在最大转速下离心 5 分钟。
   8. 去除 75% 乙醇，用 21 µL ddH₂O 重悬甘油原/DNA 沉淀。
9. 文库制备与测序
   1. 设置文库扩增 PCR 反应。为对需同时测序的样本进行索引（indexing），每个样本使用不同的 N7XX Illumina 引物和通用的 N5XX Illumina 引物。若需索引超过 12 个样本，则还需使用不同的 N5XX Illumina 引物。Illumina 提供 12 种 N7XX 引物和 8 种 N5XX 引物，因此 N7XX 与 N5XX 的组合总数为 12 × 8 = 96。PCR 反应体系见表2。
   2. 根据 CUT&Tag 实验所用细胞数量大致确定文库扩增 PCR 的循环数。通常，使用 50,000–100,000 个细胞的 CUT&Tag 实验，9–12 个循环已足够；而 10,000–50,000 个细胞可能需要最多 14 个循环。PCR 程序见表3。
      注：对于大多数 CUT&Tag 实验，若抗体功能正常，则 9–14 个 PCR 循环通常即可生成可用于测序的有效文库。一个良好的文库浓度通常为 10–50 ng/µL（通过 Qubit 检测确定），体积为 20–30 µL。相反，若抗体未能有效且特异性地发挥作用，则单纯增加循环数无法挽救实验。过多的循环数不仅无助于结果，反而会引入更多 PCR 重复序列，从而增加后续数据分析的复杂性。
   3. 使用市售的 DNA 纯化/片段大小选择磁珠纯化文库 DNA，并筛选出合适大小的 DNA 片段。
   4. 取少量纯化后的文库用水稀释，使用位点特异性引物进行 qPCR，以检测富集情况，类似于 ChIP-qPCR 实验。在测序前进行此步骤有助于判断 CUT&Tag 实验是否成功。
   5. 按照制造商说明进行测序与数据分析。
      注：CUT&Tag 试剂盒已由少数公司商业化提供，一个示例见 材料表文件。

结果

Before binding cells to Concanavalin-A beads, check the cell suspension under the microscope. Accordingly, after incubating the cells with Concanavalin-A beads, put the sample tubes on the magnetic rack, and the supernatant should be again observed using a microscope. This is to assess how efficiently the cells have been captured by Concanavalin-A beads. Wash buffer containing 7 x 10⁵ cells/mL should look like Figure 1A under the microscope. In contrast, Figure 1B shows the supernatant after Concanavalin-A bead binding, where the beads have taken away all the cells. There is no point in proceeding into the following steps of CUT&Tag if the Concanavalin-A beads did not even capture cells efficiently. Wash buffer should not contain any serum content or EDTA/EGTA, as they can abolish the binding of cell membrane to Concanavalin-A beads. Bovine serum albumin, however, does not interfere with Concanavalin-A binding to cells.

After making the CUT&Tag libraries by PCR, a small aliquot of the library (3-4 µL) can be electrophoresed on a 1.2-1.5% agarose gel to test whether the library is good. Figure 2 shows the example of successful H3K4me1 CUT&Tag libraries we made. In a histone mark or histone variant CUT&Tag, the majority of cleaved units are apparently mono-nucleosomes, although two nucleosomes can also be cut out together. Three nucleosomes cut and tagged altogether would be very rare. Therefore, a nucleosome array containing mono-nucleosomes, di-nucleosomes, and very few tri-nucleosomes should be observed in the electrophoresis of histone mark CUT&Tag libraries. Nucleosomes contain 147 bp of DNA, but with the sequencing adaptors added by Tn5 transposase and library PCR, the total size of a CUT&Tagged mono-nucleosome should come by 300 bp, as shown in Figure 2.

Before spending money on high-throughput sequencing of the CUT&Tag libraries, another quality control method is to perform qPCR with locus-specific primers. This is equivalent to performing ChIP-qPCR. Moreover, the locus-specific primers in CUT&Tag qPCR are designed based on the same principles as ChIP-qPCR primers. Figure 3 shows the qPCR amplification of different locations on the Myod1 gene locus. Myod1 encodes the master transcription factor, MyoD, which determines the skeletal muscle lineage during myogenesis¹⁵. As shown in Figure 3, H3K4me1 is highly enriched at the core enhancer (CER) and distal regulatory region (DRR) of Myod1 locus. CER and DRR are very well-established enhancer regions for Myod1¹⁶. This is consistent with the well-documented phenotype that H3K4me1 specifically marks commissioned enhancers¹⁷. Moreover, Figure 3 shows that the H3K4me1 level is very low at the proximal regulatory region (PRR) because the nucleosomes at the proximal region of active promoters are normally modified with H3K4me3¹⁸ instead of H3K4me1. All the primer pairs for these assessed loci are previously published^19,20, and the sequences can be found in Table 4. Normally, after the quality controls by library DNA electrophoresis and qPCR on specific loci, the researchers will be confident to proceed with sequencing.

Figure 1: Myoblasts resuspended in Wash buffer. Microscopic views taken (A) before and (B) after Concanavalin-A bead binding. Panel B shows there are almost no cells left in the suspension after Concanavalin-A bead incubation, indicating cells have been efficiently captured by the beads. The small particles in panel B are likely to be the excessive Concanavalin-A beads. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2: Electrophoresis of CUT&Tag libraries. Three independent H3K4me1 CUT&Tag assays have been performed, and each was made into a sequencing library using Illumina primers and PCR. Each H3K4me1 CUT&Tag used 70,000 mouse myoblasts. Libraries mostly contain tagged mono-nucleosomes. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 3: qPCR amplification of different locations on Myod1 gene locus. qPCR shows that in mouse myoblasts, the H3K4me1 mark is highly enriched at the enhancer regions of the Myod1 gene, which aligns with published conclusions. CER and DRR are published enhancers of Myod1 which are located upstream of Myod1 promoter. Please note that the PRR does not have H3K4me1 accumulation, and this is also consistent with the fact that active promoters are mainly marked with H3K4me3. The enrichments were calculated by normalizing to the enrichment of H3K4me1 on "gene desert" of sample "Repeat 1". Please click here to view a larger version of this figure.

Name	Sequences (5’-3’):
Oligo-Rev	phos-CTGTCTCTTATACACATCT
Oligo-A	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
Oligo-B	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG

Table 1: Oligo sequences for making Adaptor-A and Adaptor-B to be mounted onto pA/G-Tn5 transposase.

Fraction	Volume
Purified genomic DNA after CUT&Tag reaction	21 µL
N5XX primer (10 µM)	2 µL
N7XX primer(10 µM)	2 µL
NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix	25 µL
	Total 50 µL

Table 2: PCR setup for CUT&Tag library preparation using Illumina indexing primers. If using a commercial CUT&Tag kit that contains library PCR reagents such as DNA polymerase mix, follow the specific manual of that kit to set up the library PCR.

Step	Temperature	Time	Cycle number
1	72 oC	3 min	1
2	95 oC	3 min	1
3	98 oC	10 s	9 to 14
4	60 oC	5 s, then go to step 3
5	72 oC	1 min	1
6	4 oC	hold	N/A

Table 3: PCR program for CUT&Tag library preparation using Illumina indexing primers.

Location	Primer sequences (5’-3’)
CER	For: GGG CAT TTA TGG GTC TTC CT
	Rev: CTC ATG CCT GGT GTT TAG GG
-15,000	For: TGC CCA GAG CCT AGA ATC AT
	Rev: TCA TGC ATC CTT GCT GGA TA
-7,000	For: GGC ATG GGA GGT TTA TAG CA
	Rev: ATG CCA CTA TGC AAT CCA CA
DRR	For: TCA GGA CCA GGA CCA TGT CT
	Rev: CTG GAC CTG TGG CCT CTT AC
PRR	For: GAG TAG ACA CTG GAG AGG CTT GG
	Rev: GAA AGC AGT CGT GTC CTG GG
CDS1	For: CAT CTG ACA CTG GAG TCG CTT TG
	Rev: CAA GCA ACA CTC CTT GTC ATC AC
CDS2	For: GTG AGC CTT GCA CAC CTA AGC C
	Rev: GTT GCA CTA CAC AGC ATG CCT G
IgH enhancer	For: ACC CTG GGA AGA CCA TAC TTA ATC T
	Rev: CCA TCC ACA CTC GTG CCT TA
Gene desert	For: TCC TCC CCA TCT GTG TCA TC
	Rev: GGA TCC ATC ACC ATC AAT AAC C

Table 4: Locus-specific primers for testing H3K4me1 enrichment at different locations on the Myod1 gene.

讨论

特定 CUT 实验所需的细胞数量&标签反应完全依赖于待检测的组蛋白修饰/变异体或染色质结合蛋白的富集程度。通常情况下，对于富集程度较高的组蛋白修饰（如 H3K4me1、H3K4me3 和 H3K27ac 等），每项 CUT 实验使用 25,000 至 50,000 个成肌细胞已完全足够&标记反应。然而，某些罕见的染色质结合蛋白可能需要多达250,000个细胞。CUT实验中所用的细胞数量&Tag 检测至关重要，若操作不当通常会导致检测失败。在 CUT 中使用过多细胞&标记反应具有负面影响，尤其是在检测富集度极高的组蛋白修饰时。起始细胞数量过多会导致每个细胞分配到的抗体不足。CUT&Tag 不仅适用于极低的细胞数量，实际上还可应用于单细胞水平¹.

最重要的是，使用一种可靠且经过验证、具有高亲和力和特异性的抗体，始终是成功进行 CUT&Tag 实验的关键。与染色质免疫沉淀（ChIP）、免疫沉淀（IP）和免疫荧光（IF）实验一样，CUT&Tag 也需要能够识别天然折叠抗原的抗体¹。相反，仅能识别 Western blot 中变性肽段的抗体，应严格避免用于 CUT&Tag 实验中。

如果优化细胞数量或使用经过免疫荧光验证或文献充分引用的抗体仍无法解决 CUT&Tag 实验中信号差的问题，则需考虑目标蛋白是否为染色质相关蛋白，其可能与 DNA 结合较弱，甚至并不直接与 DNA 结合。在这种情况下，如前所述，建议改用 CUT&RUN 而非 CUT&Tag。另一种可尝试的方法是轻微固定，例如使用 0.5% 多聚甲醛固定 5 分钟（随后用 0.1 M 甘氨酸淬灭 10 分钟）。然而，由于我们从未在任何 CUT&Tag 实验中实施过固定，也未曾遇到在进行 CUT&Tag 前必须固定细胞的情况，因此对于交联处理我们无法提供进一步的建议。

我们了解到，某些版本的CUT&Tag实验方案可能声称，在一抗孵育步骤中，室温（2小时）和4 °C（过夜）均能产生较好的结果²¹。然而，我们强烈建议采用4 °C过夜孵育，而非室温孵育2小时。另一方面，也不建议将孵育时间延长超过一晚。

关于灵敏度、背景控制以及研究人员操作的复杂程度，CUT&Tag 优于 ChIP 检测。尽管 CUT 存在某些缺点&Tag与ChIP相比，唯一的区别是CUT&Tag 实验方案不包含内参标准化方法，例如使用 "输入" 在染色质免疫沉淀实验中¹因此，在使用CUT比较样本间的峰高时&标记，研究人员必须在开始时使各样本间的细胞数量相等。此外，必须设置技术重复。

本方案详细介绍了在小鼠成肌细胞中进行CUT&Tag实验的完整步骤，并以该细胞类型中H3K4me1的CUT&Tag成功案例为例进行说明。此处描述的方法可直接应用于新鲜分离的肌肉干细胞（MuSCs），无需任何修改。此外，其他细胞类型中组蛋白修饰、组蛋白变体或转录因子的CUT&Tag实验也可参照本方案进行。对于肌管或肌纤维，可先分离细胞核，然后在肌核上进行CUT&Tag实验。在此情况下，可将细胞核的处理方式等同于本CUT&Tag方案中对细胞的处理。肌管和肌纤维为多核细胞，我们尚未验证肌管或肌纤维是否可直接结合到刀豆蛋白A（Concanavalin-A）磁珠上，但该方法可能可行。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
胶原蛋白	康宁	354236
胶原酶II	沃辛顿	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
刀豆球蛋白A珠	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	赛默飞世尔科技	17105041
胎牛血清	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 抗体	abcam	ab8895
Ham's F10培养基	赛默飞世尔科技	11550043
过度活跃的通用CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	该试剂盒经我们测试，功能良好
1.5 mL EP管用磁力架	Qualityard	QYM06
用于8联PCR管条的磁力架	Anosun 磁性	CLJ16/21-021
NEBNext 高保真 2x PCR 预混液	NEB	M0541L	用于文库构建的PCR反应
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	使用前需安装适配器
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	5056489001
蛋白酶K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 培养基	赛默飞世尔科技	C11875500BT
二抗（豚鼠抗兔IgG）	Antibodies-online	ABIN101961
亚精胺	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	该试剂盒提供 Illumina N7XX 和 N5XX 引物
VAHTS DNA 纯化磁珠	Vazyme	N411	可使用Ampure XP磁珠替代。可纯化CUT&文库构建及按大小筛选DNA片段