本文介绍了一种在大鼠股骨骨干组织中创建箱形腔隙缺损的实验方案。该模型可用于评估生物材料在生物力学应力条件下的性能，并探究与膜内成骨相关的骨再生机制。
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本文内容
摘要
摘要
严重的骨缺损或复杂性骨折可能导致骨不连或骨愈合不良等严重并发症。组织工程通过应用细胞、支架材料和细胞因子，被认为是促进骨再生的有前景的解决方案。因此，用于模拟骨缺损的各种动物模型在探索组织工程治疗骨愈合潜力方面发挥着关键作用。本研究在大鼠股骨中段建立了一种箱形皮质骨缺损模型，该模型可作为评估生物材料促进骨愈合功能的理想模型。该箱形皮质骨缺损使用口腔低速手机配合车针进行钻取成型。术后立即进行显微CT分析，以确认箱形皮质骨缺损的成功建立。随后在术后多个时间点（0天、2周、4周和6周）取材获取大鼠手术侧股骨。通过显微CT、苏木精-伊红（H&E）染色和Masson三色染色对各样本缺损区域的愈合过程进行评估。结果表明，该模型的愈合模式符合膜内成骨特征，且在术后6周基本完成愈合。该动物模型愈合过程的明确分期为研究靶向膜内成骨过程的新型生物材料和药物提供了一种有效的in vivo研究方法。
引言
骨折和骨缺损常由创伤、肿瘤、炎症及先天性畸形引起1,2。尽管年轻健康个体的骨组织通常具有较强的再生能力3，但超过临界尺寸的骨缺损或因系统性疾病（如糖尿病、骨质疏松和感染）导致的愈合障碍仍可能引发骨不连续或愈合不良等并发症4。为应对这一临床挑战，常采用骨移植或生物材料来替代严重受损的骨组织或重建大段骨缺损。然而，这些治疗方法存在局限性。例如，自体骨移植虽被视为金标准，但仍受限于供体来源不足及供区并发症的风险5,6。同种异体移植也存在一定风险，如免疫介导的排斥反应、疾病传播的可能性，以及对移植物生物力学和生物学性能的不利影响7。
近年来，针对骨缺损愈合机制的研究显著增加。替代性生物材料的应用以及组织工程领域的进展已成为骨再生研究中的重要课题8在将这些生物材料应用于人类治疗之前，必须对其进行测试 体外 和 体内 以确保其有效性和安全性。然而，由于复杂性的降低， 体外 环境以及缺乏免疫和炎症反应限制了对多种生物....
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方案
本研究中所有动物实验均经四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-D-2021-597）审查并批准。实验采用雄性Sprague-Dawley大鼠（体重300 g）进行。
1. 术前准备
- 仪器准备
- 参考图1A中本研究所用的手术器械：电动剃毛器、组织剪、眼科剪、眼科镊、一次性手术刀、骨膜剥离器、口腔低速手机、口腔探针、一次性冲洗吸引器、持针器、3.0缝线。
- 准备一根口腔探针，并根据缺损直径用记号笔在探针的大弯曲端做标记（图1B），用于术中确定缺损大小。
- 使用前对所有用于手术的材料和器械进行灭菌。将所需材料用布巾或包装纸包裹后，用高压灭菌胶带封口，进行蒸汽灭菌（125–135°C，20–25分钟）。
- 手术区域准备：用75%酒精喷洒手术台及其周围环境进行消毒。在手术台上用已灭菌的铺巾创建一个约60 cm × 90 cm的无菌区域。
- 麻醉准备
- 采用腹腔注射10%盐酸氯胺酮（50–100 mg/kg）和2%赛拉嗪（2 mg/kg）对大鼠进行麻醉。术前和术中使用卡洛芬皮下注射（5 mg/kg）进行镇痛。通过夹捏足趾试验评估麻醉深度。麻醉后，为双眼涂抹无菌眼膏，以防止角膜干燥和损伤。....
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结果
在本实验方案中，我们通过钻孔成功建立了一种大鼠股骨箱状腔隙缺损模型，其尺寸为 4.5 mm × 1.5 mm。为分析愈合过程，我们在术后 0 天、2 周、4 周和 6 周采集手术侧股骨组织，这些时间点是大鼠股骨创伤愈合过程中软骨内成骨、膜内成骨及骨重建的关键阶段2。术后第 0 天，通过显微 CT 位图数据重建三维模型显示，我们成功在股骨上建立了深达髓腔、尺寸为 4.5 mm × 1.5 mm 的箱状腔隙缺损（图 3A）。显微 CT 结果显示，在造模后 2 周，皮质骨缺损区域的间质空间中已形成矿化的骨小梁组织（图 3B）。术后 4 周，缺损区新生骨组织表面呈现成熟致密的皮质骨结构，而髓腔侧仍可见骨小梁组织（图 3C）。术后 6 周时，缺损区域几乎完全由成熟致密的皮质骨构成，仅在髓腔侧残留少量骨小梁组织，表明缺损区域已基本愈合（
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讨论
临床前动物模型对于研究骨愈合以及生物材料对骨再生的影响至关重要。本方案介绍了一种股骨箱状腔隙缺损模型，可模拟与临床骨再生相关的膜内成骨过程。术中采用预先标记的口腔探针对缺损区域进行标准化操作。显微CT和组织病理学染色结果显示，在6周内骨缺损逐渐愈合，表现为骨膜增厚和新生小梁骨形成，随后出现致密的皮质骨形成。愈合过程中未观察到软骨组织，表明为膜内成骨。该发现为研究生物材料或药物在临床骨再生中的作用提供了新的视角。
本方案需仔细关注以下几个因素：（i）深度麻醉是必要的前提，以防止动物产生痛苦并确保准确的缺损定位。应密切监测麻醉深度和生命体征。（ii）在肌肉分离过程中，应细致操作以避免血管损伤，否则可能影响术后恢复。（iii）制备缺损孔时，应保持右手支点稳定，并始终与骨面垂直，以确保方框形缺损深度一致。钻孔深度应加以控制，仅去除皮质骨组织，避免过深操作。这可防止因过度机械性破坏骨髓而导致间充质干细胞（MSCs）丢失以及炎症反应受阻，从而避免延迟骨愈合16。（iv）在空腔制备过程中，需有助手持续用生理盐水冲洗手术区域，以减轻骨切除过程中产热可.......
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披露
本文包含了所有原始数据和图像。作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金资助，项目编号为 82101000（H. W.）、U21A20368（L. Y.）和 82100982（F. L.），并得到四川省科技计划项目 2023NSFSC1499（H. W.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.2 mm 低速球钻 | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | 用于制备股骨箱状骨缺损 |
| 3.0 缝合线 | 成都世锋科技有限公司 | 无 | 用于伤口缝合 |
| 4% 多聚甲醛 | Biosharp | BL539A | 用于固定股骨样本 |
| 棉球 | 海氏海诺集团有限公司 | 20120047 | 用于皮肤消毒及手术区域清洁 |
| 棉签 | 拉康医疗器械有限公司 | M6500R | 用于皮肤消毒 |
| 牙科技工打磨机 | Marathon | N3-140232 | 用于制备箱状骨缺损 |
| 一次性手术刀 | 杭州华为医疗用品有限公司 | 20100227 | 用于制作皮肤切口以及锐性分离肌肉组织 |
| 电动剃毛器 | JASE | BM320210 | 用于去除手术区域的毛发组织 |
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | Biosharp | C1005 | 用于样本的组织学分析 |
| Masson’s 三色染色试剂盒 | Solarbio | G1340 | 用于样本的组织学分析 |
| 显微CT | Scanco medical ag | µCT 45 | 用于分析股骨样本中缺损的愈合情况 |
| 持针器 | 成都世锋科技有限公司 | 无 | 用于夹持缝合针 |
| Olympus 研究级全片扫描系统 VS200 | 成都知识科技有限公司 | VS200 | 用于分析HE染色和Masson染色结果 |
| 眼科镊 | 成都世锋科技有限公司 | 无 | 用于夹持皮肤和肌肉组织 |
| 眼科剪 | 成都世锋科技有限公司 | 无 | 用于形成皮肤切口通路 |
| 口腔低速手机 | Marathon | Y221101003 | 用于制备箱状骨缺损 |
| 口腔探针 | 上海桑达医用器材有限公司 | 20000143 | 用于测量缺损直径 |
| 骨膜剥离器 | 成都世锋科技有限公司 | 无 | 用于钝性分离肌肉组织 |
| Sprague–Dawley 大鼠 | Byrness Weil Biotech Ltd | 无 | 用于建立股骨箱状骨缺损模型 |
| 组织剪 | 成都世锋科技有限公司 | 无 | 用于形成皮肤切口通路 |
参考文献
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012). <....
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