我们介绍一种基于玻璃器皿的半水培实验系统，该系统可支持多种系统发育上不同的植物在有或无微生物条件下的生长。该系统适用于不同的生长培养基，并允许对根系分泌物进行非破坏性取样，用于后续分析。
本文内容
摘要
摘要
根系分泌物塑造了植物-土壤界面，在养分循环中发挥重要作用 ，并调节植物与土壤生物之间的相互作用。根系分泌物具有动态性，受生物、环境和实验条件的影响。由于其种类繁多且浓度较低，准确测定分泌物谱型具有挑战性，尤其在自然环境中，其他生物的存在会转化植物来源的化合物并自身产生新的化合物，使分析更加困难。本文介绍的半水培玻璃罐实验系统可有效控制生物、环境和实验因素，支持多种系统发育上不同的植物物种生长数月之久，可选择性地在有或无微生物的条件下进行，并适用于多种不同的培养基。基于玻璃的设计具有较低的代谢物背景干扰，检测灵敏度高，且对环境影响小，可重复使用。该系统可非破坏性地采集分泌物样品，并可根据需要在实验过程中调整实验条件。该装置适用于质谱分析及其他下游分析方法。总之，我们提出了一种多功能的植物培养系统，适用于多种条件下高灵敏度的根系分泌物分析。
引言
在密集的土壤环境中，根际构成了一个富含碳的生态位。植物根系通过释放高达20%的同化碳塑造了这一区域，并孕育了与周围土壤微生物组明显不同的微生物群落1,2,3,4,5,6。随着研究人员日益关注根际相关微生物的有益功能及其在可持续农业中的应用潜力7，这一现象（常被称为根际效应）已成为科学界日益关注的焦点。然而，迄今为止，植物与微生物之间被认为驱动根际效应的化学对话仍知之甚少，因此，农业中可靠微生物解决方案的机制性理解仍然有限8,9,10。
在土壤环境中，根系分泌物中的代谢物极易被土壤颗粒吸附，并迅速被微生物群落周转，因此解析这些分泌物并非易事，尤其对于具有细根系统的植物种类（如模式植物 Arabidopsis thaliana）更是如此11。 正因如此，在大多数研究中，根系分泌物通常从水培系统中采集。在这些微宇宙系统中，植物的地上部分通过定制的植株固定装置，或更简单的材料（如尼龙网、琼脂和玻璃珠）加以固定。所使用的容器种类多样，包括培养皿、多孔板，以及各种带或不带通气滤膜的定制或商用培养盒12,13,14,15,16,17,18,19。根据具体系统不同，植物生长条件差异显著，在不同程度上反映自然环境状况。
本文介绍一种基于玻璃器皿的半水培系统，该系统易于开展实验操作，且实验结果具有高度可重复性。该系统组装和使用简便，所用材料均为常规易得物品。该系统采用装有玻璃珠的玻璃瓶作为基础，充分利用了玻璃器皿可重复使用且非特异性结合特性低的优点（图1）。玻璃珠为植物生长提供物理支撑，并模拟机械阻抗，与传统水培系统相比，有助于形成更接近土壤环境的根系结构19,20,21。若接种微生物，玻璃珠表面还可为细菌附着提供位点。
玻璃罐可封闭以保持无菌状态，系统设计允许有足够的顶空和空气流通，避免形成高湿度饱和环境。这些玻璃罐适用于多种植物物种的长期生长，并可通过使用不同尺寸的玻璃罐进行放大或缩小。本文展示了六种植物物种的应用，涵盖C3和C4禾本科植物、双子叶植物以及豆科植物。其中包括模式物种A. thaliana （双子叶植物）、Brachypodium distachyon （C3单子叶植物）、Medicago truncatula （豆科植物）， 以及作物物种如Solanum lycopersicum（番茄，双子叶植物）、Triticum aestivum（小麦，C3单子叶植物）和Sorghum bicolor（高粱，C4单子叶植物）。所介绍的实验方案包括系统的实验设置、六种植物种子的灭菌与萌发、幼苗移栽至玻璃罐、不同生长培养基的使用、微生物接种、根系分泌物的采集，以及用于分析的分泌物处理过程。
方案
1. 幼苗准备：种子表面灭菌
注意：除非另有说明，种子的表面灭菌及后续所有步骤均须在无菌条件下进行。步骤 1.1 至 1.4 专用于拟南芥（A. thaliana）种子的表面灭菌。其他植物物种在试管规格（取决于种子数量和种子大小）、溶液处理时间以及灭菌溶液方面存在不同方案（表 1）。
- 将种子加入微量离心管中（种子最大量为 20 mg），并用 70% 乙醇浸没种子。
注意：乙醇易燃。请勿在明火附近使用。 - 将封闭的微量离心管置于摇床中，振荡 15 分钟，调节转速使种子轻微振荡。
- 用移液器小心吸去 70% 乙醇，替换为 100% 乙醇。重复步骤 1.2。
- 吸去 100% 乙醇，将微量离心管管盖打开，置于无菌气流中干燥种子。
- 种子干燥后，通过轻弹管壁或使用无菌镊子将其均匀分散于含 0.7% 植物琼脂的 0.5×Murashige 和 Skoog（MS）培养基上。盖上培养皿，并用 1.25 cm 微孔胶带密封。
- 将培养皿水平放置于培养室的架子上（16 小时光照 / 8 小时黑暗，白天 22 °C / 夜间 18 °C，光强 150–160 μmol m-2 s-1）。
2. 幼苗制备：将已萌发的种子转移至新鲜培养板
注意：以下步骤仅适用于 A. thaliana，其他物种无需执行。
- 萌发后，将5至6株幼苗线性转移至新的含0.5x MS培养基的0.7%植物琼脂平板上，幼苗位置距离平板顶部约3 cm（见图2D中莲座叶的位置）。
- 用1.25 cm微孔胶带密封琼脂平板，并在培养室中垂直培养（图2D），直至幼苗在萌发后15–18天准备转移至广口瓶中（表2）。
3. 水培系统的准备：培养瓶的搭建
- 向每个洁净的广口瓶中加入 150 mL 干净的 5 mm 玻璃珠，并用瓶盖盖紧（图 1A）。
注意：本方案中，5 mm 玻璃珠适用于大多数物种22，但可根据需要调整珠子尺寸。 - 用足量铝箔覆盖已盖好的广口瓶，包裹瓶盖与瓶身接合处，然后进行高压灭菌（121 °C，20 分钟）（图 1B）。
- 将准备好的广口瓶保持覆盖状态，直至植物准备转移（表 2）。
4. 水培系统的准备：幼苗的添加
- 当幼苗准备转移至培养瓶时（表2），在无菌操作台中移除培养瓶上的铝箔和瓶盖。
- 若培养瓶需接种细菌，则在进入步骤4.3前执行以下操作；否则跳过步骤4.2。
- 使用无菌接种环从琼脂平板上的纯细菌培养物中挑取单菌落，并将其悬浮于750 µL无菌的10 mM MgCl2溶液中。重复操作直至溶液呈浑浊状。
- 可选：将上述菌液在750 µL无菌10 mM MgCl2中洗涤3次，每次以1,000 × g离心5分钟（室温），弃上清，将菌体沉淀重悬于750 µL 10 mM MgCl2中。
- 可选：若需接种多种不同细菌，可在进行下一步前将步骤4.2.1–4.2.2制备的各菌株悬浮液等比例混合。
- 用0.5x MS培养基（pH 5.7–5.9，用KOH调节）或其他选定的生长培养基将菌液在600 nm波长下的光密度（OD600）调整至0.2–0.4（参见步骤4.3）。再次测定OD600以确认稀释是否正确。
警告：KOH具有腐蚀性，操作时需佩戴手套和实验服。 - 将菌液进一步用相同培养基稀释至OD600为0.002–0.004（1:100稀释）。
注：最终细胞浓度取决于所用细菌菌株，根据我们的经验，此接种量相当于约3–6 × 105 个细胞 mL-1。 - 每瓶加入35 mL最终稀释菌液。对照瓶中加入35 mL无菌生长培养基。在转移植物前，轻轻搅拌玻璃珠，使其均匀覆盖0.5x MS培养基，防止根部干燥。随后进入步骤4.4。
- 向每个培养瓶中加入35 mL 0.5x MS培养基（pH 5.7–5.9，用KOH调节）。在转移植物前，轻轻搅拌玻璃珠，使其均匀覆盖0.5x MS培养基，防止根部干燥。
注：可根据实验需要对生长培养基进行修改，例如去除特定营养成分、添加渗透调节剂以诱导盐胁迫，或使用不同pH值或不同类型的培养基。警告：KOH具有腐蚀性，操作时需佩戴手套和实验服。 - 将3–5株 A. thaliana 植物移入培养瓶中，使根系置于玻璃珠之间。
注：不同物种每瓶所植株数可能不同（表2）。 - 使用无菌镊子或勺子调整玻璃珠位置，覆盖根部并将叶片轻轻抬出培养基表面（图1C）。
注：操作时应轻柔移动植物和玻璃珠，避免损伤根系或对植物造成机械胁迫。 - 在培养瓶口上方交叉粘贴两条1.25 cm宽的微孔透气胶带，然后轻轻盖上瓶盖（图1D–F）。
注：盖瓶盖时不要用力按压，以免阻碍气体交换。 - 用2.5 cm宽的微孔透气胶带密封瓶盖与瓶口之间的缝隙，以维持无菌环境同时允许气体交换，随后将培养瓶放入生长培养箱中（图1G，H）。
- 根据具体生物学问题及预期变异程度，每种实验条件设置4–8个培养瓶。
- 务必设置生物学阴性对照（例如不含植物的培养瓶），以排除实验系统中代谢物本底的干扰。阴性对照的重复数应与实验组相同（例如四重复）。
- 对于长期培养，每周更换一次培养基：用25 mL移液管吸除残留培养基，并加入35 mL新鲜培养基。
5. 根系分泌物的收集
- 当植株达到所需年龄时，在无菌操作台中移除2.5 cm的微孔胶带和盖子。
注意：对于 拟南芥 在我们的生长条件下，萌发后21天代表开花开始前的成熟营养生长阶段。营养生长阶段的具体时期因植物种类而异，生长期的时间也随植物种类不同而变化；该时间可根据具体研究问题进行调整。 - 进行无菌检测时，取20 µL培养基样品，用移液器接种至LB琼脂平板上。
- 对于接种后的培养瓶，取100 µL生长培养基用于菌落形成单位（CFU）计数（例如，进行梯度稀释）23).
注意：根据我们的经验，细菌密度范围在 105-108 活细胞 mL-1 生长培养基
- 对于接种后的培养瓶，取100 µL生长培养基用于菌落形成单位（CFU）计数（例如，进行梯度稀释）23).
- 用25 mL刻度移液管尽可能吸除培养基，注意避免损伤根部。
- 沿罐壁用移液器加入50 mL收集培养基（例如20 mM醋酸铵；用HCl调节pH至5.7–5.9），避免润湿叶片。用盖子密封罐子，并在无菌条件下孵育至所需渗出物收集时间。对于时间敏感的实验，2 h是适宜的收集窗口。
警告：盐酸具有腐蚀性；需佩戴手套和实验服。若需延长根系分泌物收集时间，应再次用胶带封紧瓶盖，并将瓶子转移至生长培养箱中。 - 2小时后，将所需量的收集液转移至离心管中（例如，若后续实验或分析需使用浓缩渗出物，则取50 mL；若直接使用，则取2 mL）。收集的根系渗出物应于-80 °C保存，直至进一步处理或分析。
- 处理接种后的瓶子时，将收集的渗出液在5,000 × g下离心10分钟 g 4 °C 下保存，并仅使用上清液进行分析。或者，使用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤器对渗出液进行过滤除菌。
- 如果实验属于时间序列实验，需将罐子中剩余的所有培养基移除，并加入35 mL的0.5x MS培养基。盖上盖子并重新贴上2.5 cm封口膜，然后将罐子放回生长室。
- 测量一个罐中所有植物的根和茎的鲜重，以便后续根据植物重量对根系分泌物进行归一化处理。
注意：如有需要，可额外采集植物组织样本。
6. 质谱分析用根系分泌物的处理
- 根据分析方法的不同，将根系分泌物进行冷冻干燥以浓缩并去除收集介质（在 -80 °C、0.37 mbar 条件下冻干至无液体残留）。分析前于 -80 °C 保存。
注意：本文所示数据采用飞行时间质谱（TOF-MS）流动注射分析，仪器为高精度四极杆飞行时间质谱仪。 - 在将样品注入分析仪器之前，根据根鲜重，用收集介质重新溶解冻干的分泌物，或稀释未经处理的根系分泌物。
注意：所选收集介质需与质谱仪兼容。然而，根据具体分析方法的不同，进样前可能需要进行脱盐处理。
结果
本文介绍的实验系统可控制影响根系分泌物谱的实验和环境因素。我们在两个不同的实验室中比较了A. thaliana在不同光照条件、植株年龄和种植密度下的生长情况（图3）。在不同实验室中，植株均生长健康（图3A、B）。短日照条件（10小时光照 vs. 16小时光照，图3）下植株的根系质量高于长日照条件（图3C、D）。同样，在长日照条件下所有植株的总根系质量也小于短日照条件（图3C）。总体而言，不同实验室中瓶内及瓶间的生长变异性均较低。
玻璃罐系统适用于多种植物物种和发育阶段。在我们的实验条件下，根系分泌物分析的终点通常为21天，此时许多植物物种尚未进入生殖阶段，而正处于成熟的营养生长阶段（图4A-E）。植物可轻松从实验系统中取出，且根系无可见损伤。因此，测定组织重量或将组织用于后续分析均十分简便。小麦的地上部分重量最高，其次为高粱和番茄；高粱的根系重量最高，其次为小麦和 M. truncatula。不同物种间的根冠比存在差异。总体而言，组织重量介于100 mg至800 mg之间。
允许收集根系分泌物的实验系统的一个核心方面是，在明确定义的环境中通过可控接种微生物来研究植物-微生物相互作用。所介绍的实验系统即使经过多次操作仍可保持无菌状态（参见图5中的“对照”条件），并且可添加细菌并长期维持。当33天大的A. thaliana植株接种OD600为0.004的共生细菌混合物后，细菌在12天内持续存在，这与实验的整个持续时间一致（图5）。培养基中的菌落形成单位甚至增加了100倍，且细菌成功定殖于根部（图5C）。接种植株的表型与无菌植株无法区分（图5A、B）。
本研究所展示的实验系统可在多种实验条件下实现渗出物的收集。此处展示了从同一植株连续收集的A. thaliana Col-0 根系渗出物谱，分别使用醋酸铵或水作为收集介质（图6A）。渗出物在分析前于 -80 °C 保存，并根据根重进行归一化处理，随后通过质谱分析。含有植株的培养瓶样品均以不含植株的对照组为基准进行过滤排除背景干扰。在检测到的 2,163 种代谢物中，436 种代谢物信号高于背景水平（占 20.16%），被保留用于后续分析。其中，416 种化合物（占 95%）在不同实验条件下表现出显著差异的丰度。然而，有 26 种代谢物无法归类至任何已知化合物类别，因此未予定义。大多数代谢物（406 种，占 98%）在以水收集的渗出物中丰度更高。尽管连续依次使用醋酸铵和水进行渗出物收集可能因代谢信号随时间稀释而影响渗出谱，但几乎全部在第二时间点用水收集时出现更高信号的结果并不支持该假设：使用纯水收集渗出物很可能对植物造成渗透冲击，从而导致代谢物丰度升高，相比之下，收集溶剂若与生长溶液等摩尔浓度（20 mM 醋酸铵相当于 0.5× MS 培养基）则不会引起此类效应。对两种生长条件下鉴定出的化合物化学类别分析显示，大多数化合物为有机酸及其衍生物（28.6%），其次为有机含氧化合物（18%）、杂环有机化合物（14.2%）和脂类（13.2%）。仅少数代谢物属于苯丙素类和聚酮类（8.7%）以及苯系物（6%）。含氮有机化合物、核苷、有机硫化合物、生物碱、木脂素及相关化合物分别占已分类代谢物的 2% 至 0.5%（图6B）。此处所示代谢物分布情况与先前使用其他类型根系渗出物收集系统所发表的数据一致24。
图1：广口瓶实验装置。（A）装有玻璃珠的广口瓶。（B）准备进行高压灭菌的装有玻璃珠的广口瓶。（C）广口瓶中的幼苗（俯视图）。（D）广口瓶中的幼苗（俯视图），使用1.25 cm 微孔胶带封口。（E）广口瓶中的幼苗（侧视图），使用1.25 cm 微孔胶带封口。（F）广口瓶中的幼苗（侧视图），使用1.25 cm 微孔胶带及瓶盖封口。（G）完整的广口瓶装置（侧视图），幼苗置于瓶中，使用1.25 cm 微孔胶带、瓶盖以及2.5 cm 微孔胶带密封。（H）完整的广口瓶装置（俯视图）。（I）植株生长21天后准备收获（俯视图）。广口瓶尺寸：高度147 mm，直径100 mm。请点击此处查看该图的高清版本。
图 2：在生长室中，0.5x Murashige 和 Skoog 培养基琼脂平板上表面灭菌的幼苗。 （A）Arabidopsis thaliana（6 天龄），（B）Brachypodium distachyon（6 天龄），（C）Medicago truncatula（6 天龄），（D）A. thaliana（18 天龄）。琼脂平板尺寸为 120 mm × 120 mm。请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：在短日照和长日照光照条件下培养的 Arabidopsis thaliana Col-0 植物。（A）在短日照条件下（10 小时光照/14 小时黑暗，光照强度为 220 µmol m-2 s-1，日间温度 21 °C/夜间温度 18 °C）培养的 33 天龄植物样本，共三株；（B）在长日照条件下（16 小时光照/8 小时黑暗，光照强度为 150–160 µmol m-2 s-1，日间温度 22 °C/夜间温度 18 °C）培养的 21 天龄植物样本，共五株。图（C）显示一个培养罐中所有植物的根重，图（D）显示单株植物的根重。** 表示 t 检验的显著性差异（p < 0.05）。请点击此处查看本图的高清版本。
图4：无菌玻璃罐系统装置中第21天的五个系统发育上不同的物种。（A）模式单子叶植物 Brachypodium distachyon，（B）模式豆科植物 Medicago truncatula，（C）双子叶植物 Solanum lycopersicum（番茄），（D）双子叶植物 Sorghum bicolor，（E）单子叶植物 Triticum aestivum（小麦）。（F）在玻璃罐中培养的各物种根和地上部分的鲜重。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：Arabidopsis thaliana Col-0（33天龄）在短日照条件下的生长情况。 （A）无菌条件下培养，或（B）接种共生细菌群落培养12天。（C）生长基质（左）和根部（右）的无菌（对照）与接种样本中的菌落形成单位。无菌对照组 n = 4 个培养瓶，接种组 n = 8 个培养瓶。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：21日龄植株不同的根系分泌物谱型 A. thaliana Col-0 渗出物先在无菌的20 mM醋酸铵（pH 5.7）中收集2小时，随后在无菌过滤的去离子水中收集2小时。采用直接进样法通过质谱检测代谢物。A) 基于背景水平以上检测到的436种代谢物进行主成分分析（含植物的罐子与不含植物的罐子之间的比较）。PC：主成分，括号内数值为解释的方差比例。蓝色：水收集的渗出物，黄色：乙酸铵收集的渗出物。B实验条件下显著差异的416种代谢物的饼状图（Tukey检验），按超级类别着色（https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 物种 | 种子预处理 | 70% 乙醇处理时间（分钟） | 次氯酸钠（NaClO）浓度（v/v % 漂白剂） | 漂白剂处理时间（分钟） | ||
| Arabidopsis thaliana | 15 | 无；100% 乙醇 | 15 | |||
| Brachypodium distachyon* | 脱壳 | 0.5 | 6 | 5 | ||
| Medicago truncatula*a | 30 | 6 | 30 | |||
| Solanum lycopersicum* | 0.5 | 6 | 5 | |||
| Sorghum bicolor* | 脱壳 | 0.5 | 6 | 30 | ||
| Triticum aestivum* | 脱壳 | 0.5 | 12 | 20 | ||
表1：多种物种的表面种子灭菌方法。 *在乙醇与次氯酸钠处理之间以及最终步骤中，用滤过的去离子水清洗4-5次；a次氯酸钠处理后孵育3-6小时，每隔30分钟更换滤过的去离子水。
| 物种 | 移栽至培养瓶所需天数 | 植株数量 |
| Brachypodium distachyon | 4 至 5 | 3 |
| Sorghum bicolor | 4 至 5 | 3 |
| Triticum aestivum | 4 至 5 | 2 |
| Medicago truncatula | 5 至 6 | 3 |
| Solanum lycopersicum | 7 至 8 | 3 |
| Arabidopsis thaliana | 17 | 3 至 5 |
表2：不同植物物种幼苗移栽至培养瓶时的苗龄（天）及每瓶种植的植株数量。
讨论
本文介绍的实验系统基于玻璃罐和玻璃珠，因此提供了一种简单、低维护且用途广泛的半水培系统，可用于在多种情境下研究根系分泌物。该系统已应用于不同植物物种分泌特征的研究25、分泌作用对不同生长条件响应的研究25，以及土壤理化性质对分泌作用影响的研究22。该系统适用于本文测试的所有植物物种，支持从数周到数月不等的长期生长。维持无菌条件操作简便，接种细菌也易于实现，且细菌可在为期2周的分析生长期内持续存在。因此，该实验系统不仅可在无菌条件下实现对根系分泌物的可控收集，还可用于研究植物与微生物之间的相互作用。此外，可通过改变植物生长培养基来研究植物对不同养分水平的代谢响应，也可通过调整光照条件或使用不同尺寸的玻璃罐来调节生长周期。
在水培或半水培条件下研究根系分泌物仍是该领域的常规方法 ，主要原因是此类方法能更有效地检测低浓度代谢物11。许多水培方法依赖于培养皿、多孔板或其他小型容器，这些容器可实现无菌环境和高通量操作，但限制了实验对象仅能使用在高湿度环境中生长的小型植物或幼苗17,18,26,27。在本研究所述的玻璃罐装置中，由于使用了相对较大的玻璃罐，提供了充足的顶部空间，从而支持植物长期生长。微孔透气胶带条确保气体交换的同时维持无菌状态。因此，即使如大麦和玉米等高大的单子叶植物，也可在该玻璃罐装置中生长数周。拟南芥（A. thaliana）和三叶草等小型植物在萌发后可连续培养并研究长达4至5周，涵盖营养生长和生殖发育阶段。
对于较大的植物，也可采用其他水培装置，但这些装置通常需要使用网状材料、泡沫板和嫁接篮等定制的盒子和进液口来支撑植物15,28,29,30。此外，这些设备通常无法实现无菌设置，或者需要复杂的安装和维护程序，以防止微生物和/或化学污染。本文所介绍的实验系统在无菌条件的建立与维持方面操作简便。此外，使用玻璃材质的罐子和珠子可减少塑料中污染物的溶出，并且由于可轻松清洗和重复使用，有助于节约资源。
玻璃珠此前已被用于模拟土壤颗粒，在根系分泌物采样装置（如分泌物捕获装置31 ）或其他半水培系统19中诱导自然的根系发育。玻璃罐装置利用了这一进展，并将玻璃珠引入作为微生物定植的表面。在土壤中，植物根际微生物组在半固态环境中演化，其中致密的颗粒之间充满空气或水的空隙。尽管玻璃罐装置未对生长基质进行主动通气，导致下层液相可能缺乏充足的氧气，但较大的玻璃珠体积与较小的培养基体积相结合，形成了一个湿润且通气良好的上层环境，使微生物能够在有氧条件下生长。其他研究者曾提出通过振荡培养容器26,28 或使用连接空气泵的管路19,29 来维持水培系统中的供气。然而，这些系统要么设计上无法保持无菌状态，要么需要特殊材料和持续监控以维持无菌条件。此外，在振荡的情况下，还需格外注意避免植株地上部分浸入培养液以及根系受损。尽管如此，如有需要，本文所介绍的实验装置也可通过添加通气材料进行改进。
在研究植物-微生物互作代谢过程的所有研究中，一个关键的考虑因素是微生物会降解植物来源的化合物，并自身产生代谢物。若无专门的无菌实验装置，则无法区分植物来源与微生物来源的代谢物。为了抑制微生物活性并富集植物来源的化合物，Oburger 等人提出通过化学方法对根系分泌物采集溶液进行灭菌，以抑制细菌降解32。在本实验体系中，可进一步研究化学抑制剂的作用，通过比较经或未经抑制剂处理的无菌植物与非无菌植物的分泌谱，来评估其效果。
本文所述玻璃罐装置的一个主要局限性在于，其生长条件与土壤环境相比仍非常人工化。在土壤中生长的植物所释放的渗出物，通常通过渗滤系统收集13，即在生长容器底部收集溶剂渗出液；或者通过土壤-水培复合系统收集，其中植物先在土壤中生长，随后转移至水培条件下16,33。与玻璃罐装置不同，这些方法通常具有破坏性，无法在变化的生长环境中对同一植株进行多次连续取样。此外，在渗滤系统中，土壤本底物质会与渗出物一同被采集；而在土壤-水培复合系统中，通过将植物转移至水培条件来收集渗出物，可避免高背景土壤代谢物的干扰。尽管已有研究采用恢复期以减少因根部损伤导致的代谢物泄漏11，但植株转移过程本身具有高度干扰性，根部伤口可能持续存在，且植物代谢可能因转入水培环境而发生改变。此外，在许多情况下，将植物直接转移至水中而非适宜的生长溶液，会引发渗透冲击16,33。在本方案中，通过更换为等摩尔浓度的生长溶液以维持渗透平衡，仍可在短时间内、明确的时间窗口内有效捕获渗出物。更换生长溶液是许多已发表研究中的常规操作，在水培系统中可轻松实现且无需造成根部损伤12,16,26,34。由于该实验系统具有高度可调性，可轻易改造以模拟更接近自然的条件，例如使用无菌或非无菌的土壤提取物作为生长溶液，并可选择性地添加固体土壤颗粒。逐步向自然条件靠拢的方式，有助于研究不同理化土壤特性及微生物存在对植物代谢和生理的影响。在科学界尚未充分理解不同环境下植物渗出行为之前，建议并行使用基于土壤和水培的系统，因为这两种装置各有优势与局限性13。
综上所述，本研究所提出的半水培式、基于玻璃的实验装置因其结构简单且应用高度灵活而具有显著优势。该方法提供了一种经济、便捷的途径，可在无菌条件下或结合微生物及植物-微生物相互作用的情况下收集和研究分泌物。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢瑞士苏黎世联邦理工学院的Nicola Zamboni教授和Uwe Sauer教授提供直接进样法测定的根系分泌物谱型，以及巴塞尔大学的Klaus Schläppi教授提供拟南芥（A. thaliana）共栖细菌。此外，我们感谢瑞士国家科学基金会（项目编号PR00P3_185831，授予J.S.，用于支持S.M.、A.S.、E.M.S.）以及PSC-先正达博士后 fellowship 项目（授予Klaus Schläppi教授和J.S.，用于支持C.J.）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌学用琼脂粉 | VWR | 20767.298 | |
| 铝箔 | FORA GmbH | ||
| 乙酸铵 | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | ACS试剂，Eur >- 98% |
| 高压灭菌器 VX-150 | Systec | 1150 | |
| 天平 | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
| 离心机 | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
| 比色皿 | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Difco LB 培养基，Lennox 型 | BD | 240210 | |
| 乙醇 | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
| 过滤去离子水 | Merck Millipore | Milli-Q IQ7000 | |
| 玻璃珠 | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
| 盐酸 | Merk | 1.00317.1000 | |
| 接种环 | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
| 广口瓶 | Weck | 105741 | 850 mL |
| 冷冻干燥机 | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
| 六水合氯化镁 | Carl Roth | 2189.1 | |
| Matrix Orbital 恒温振荡器 | IKA | 10006248 | |
| 微量离心管 | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | SafeSeal 反应管，2 mL，聚丙烯材质 |
| 微孔胶带 | 3M | 1530-0 | 1.25 cm x 9.1 m |
| 微孔胶带 | 3M | 1530-1 | 2.5 cm x 9.1 m |
| Murashige & Skoog 培养基 (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
| 生长培养箱 | Percival | SE41-TLCU4 | 16小时光照/8小时黑暗，白天22 °C，夜间18 °C |
| 植物琼脂 | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
| 氢氧化钾 | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
| SmartSpec Plus 分光光度计 | Bio-Rad | 170-2525 | |
| 次氯酸钠溶液，12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
| 方形培养皿 | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm，带通气孔 |
| Stericup 快速释放滤器 | Millipore | S2GPU05RE | 0.22 µm PES，500 mL |
| 无菌操作台 | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |
参考文献
- Sasse, J., Martinoia, E., Northen, T. Feed your friends: do plant exudates shape the root microbiome. Trends in Plant Science. 23 (1), 25-41 (2018).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Lopez, J. L., et al. Growth rate is a dominant factor predicting the rhizosphere effect. The ISME Journal. 17 (9), 1396-1405 (2023).
- Hu, L., et al. Root exudate metabolites drive plant-soil feedbacks on growth and defense by shaping the rhizosphere microbiota. Nature Communications. 9 (1), 2738(2018).
- Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (8), 911-920 (2015).
- Bulgarelli, D., et al. Structure and function of the bacterial root microbiota in wild and domesticated barley. Cell Host Microbe. 17 (3), 392-403 (2015).
- Li, J., Wang, J., Liu, H., Macdonald, C. A., Singh, B. K. Application of microbial inoculants significantly enhances crop productivity: A meta-analysis of studies from 2010 to 2020. Journal of Sustainable Agriculture and Environment. 1 (3), 216-225 (2022).
- Escudero-Martinez, C., Bulgarelli, D. Engineering the crop microbiota through host genetics. Annual Review of Phytopathology. 61, 257-277 (2023).
- Poppeliers, S. W., Sanchez-Gil, J. J., de Jonge, R. Microbes to support plant health: understanding bioinoculant success in complex conditions. Current Opinion in Microbiology. 73, 102286(2023).
- O'Callaghan, M., Ballard, R. A., Wright, D. Soil microbial inoculants for sustainable agriculture: Limitations and opportunities. Soil Use and Management. 38 (3), 1340-1369 (2022).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates - Mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156(2018).
- Vismans, G., et al. Coumarin biosynthesis genes are required after foliar pathogen infection for the creation of a microbial soil-borne legacy that primes plants for SA-dependent defenses. Scientific Reports. 12 (1), 22473(2022).
- Strehmel, N., Böttcher, C., Schmidt, S., Scheel, D. Profiling of secondary metabolites in root exudates of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 108, 35-46 (2014).
- Song, Y., Pieterse, C. M. J., Bakker, P., Berendsen, R. L. Collection of sterile root exudates from foliar pathogen-inoculated plants. Methods in Molecular Biology. 2232, 305-317 (2021).
- Oburger, E., et al. A quick and simple spectrophotometric method to determine total carbon concentrations in root exudate samples of grass species. Plant Soil. 478 (1-2), 273-281 (2022).
- Koprivova, A., et al. Root-specific camalexin biosynthesis controls the plant growth-promoting effects of multiple bacterial strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (31), 15735-15744 (2019).
- Gao, J., et al. Ecosystem fabrication (EcoFAB) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. (134), e57170(2018).
- Lopez-Guerrero, M. G., et al. A glass bead semi-hydroponic system for intact maize root exudate analysis and phenotyping. Plant Methods. 18 (1), 25(2022).
- Boeuf-Tremblay, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of mechanical impedance on root exudation of maize seedlings at two development stages. Plant and Soil. 172, 279-287 (1995).
- Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of plant morphology on root exudation of maize subjected to mechanical impedance in hydroponic conditions. Plant and Soil. 201, 231-239 (1998).
- Sasse, J., et al. Root morphology and exudate availability are shaped by particle size and chemistry in Brachypodium distachyon. Plant Direct. 4 (7), 00207(2020).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039(2002).
- Monchgesang, S., et al. Natural variation of root exudates in Arabidopsis thaliana-linking metabolomic and genomic data. Scientific Reports. 6, 29033(2016).
- McLaughlin, S., Zhalnina, K., Kosina, S., Northen, T. R., Sasse, J. The core metabolome and root exudation dynamics of three phylogenetically distinct plant species. Nature Communications. 14 (1), 1649(2023).
- Badri, D. V., Chaparro, J. M., Zhang, R., Shen, Q., Vivanco, J. M. Application of natural blends of phytochemicals derived from the root exudates of Arabidopsis to the soil reveal that phenolic-related compounds predominantly modulate the soil microbiome. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4502-4512 (2013).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Nathoo, N., Bernards, M. A., MacDonald, J., Yuan, Z. C. A hydroponic co-cultivation system for simultaneous and systematic analysis of plant/microbe molecular interactions and signaling. Journal of Visualized Experiments. (125), e55955(2017).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cozatl, D. G. Hydroponics: a versatile system to study nutrient allocation and plant responses to nutrient availability and exposure to toxic elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317(2016).
- Yi, Y., Li, Z., Kuipers, O. P. Plant-microbe interaction: transcriptional response of Bacillus Mycoides to potato root exudates. Journal of Visualized Experiments. (137), e57606(2018).
- Phillips, R. P., Erlitz, Y., Bier, R., Bernhardt, E. S. New approach for capturing soluble root exudates in forest soils. Functional Ecology. 22 (6), 990-999 (2008).
- Oburger, E., et al. Root exudation of phytosiderophores from soil-grown wheat. New Phytologist. 203 (4), 1161-1174 (2014).
- Neal, A. L., Ahmad, S., Gordon-Weeks, R., Ton, J. Benzoxazinoids in root exudates of maize attract Pseudomonas putida to the rhizosphere. PLoS One. 7 (4), e35498(2012).
- Miao, Y., et al. Exogenous salicylic acid alleviates salt stress by improving leaf photosynthesis and root system architecture in cucumber seedlings. Scientia Horticulturae. 272, 109577(2020).
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