本文介绍了一种有效的大鼠约束与锁骨下静脉穿刺方法的组合，可在无需麻醉的情况下实现大鼠快速、安全且可重复的采血。
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摘要
摘要
目前已有多种成熟的方法用于从大鼠中获取重复血样，其中最常用的方法包括无需麻醉的侧尾静脉采血和需要麻醉的颈静脉采血。然而，大多数这些方法都需要助手协助和麻醉设备，有时在血液采集过程中存在困难，或所获得血样的质量不佳。此外，当需要对大量大鼠进行重复采血时，这些采血方法会耗费大量时间和人力资源。本研究介绍了一种由单名熟练操作者对未麻醉大鼠进行重复采血的技术。通过穿刺锁骨下静脉可获得高质量的血样。该方法总体成功率高达95%，从固定大鼠到完成采血的中位时间仅为2分钟。此外，在规定范围内进行连续采血不会对大鼠造成任何伤害。该方法值得推广用于血液采集，尤其适用于大规模药代动力学研究。
引言
大鼠是最常用的实验动物之一，获取血样的方法有多种。对于在实验结束阶段仅需进行一次采血的情况，可通过心脏穿刺或腹主动脉采血获得足够量的血液1。然而，某些研究需要对大鼠进行多次重复采血，以进行常规血液学或生化分析，尤其是在药代动力学和毒理学研究中，需通过多次采血来确定药物的吸收、分布和代谢情况2。
目前，尽管尾静脉采血是大鼠采血最常用的方法，且无需麻醉，但该方法在重复采血时具有挑战性，且采集的血量相对较少3,4。此外，虽然可以从隐静脉和阴茎静脉采血，但获得的血量有限，且需要麻醉1,5。进一步地，从下颌下静脉丛以及舌下静脉、颈静脉和锁骨下静脉采集的血样质量较高，但通常需要麻醉或多人协助1,6,7,8,9。最后，眶后窦/管采血不仅需要麻醉，还可能对大鼠造成损伤和应激反应9。
通常从大静脉获取的血液样本质量一般是最高的标准1。目前，一些研究发现，通过颈静脉进行连续微采样是大鼠毒理学研究中一种非常合适的方法，尽管该方法通常需要进行颈静脉插管10,11,12。因此，值得探索如何在不进行手术干预的情况下，遵循动物研究的3R原则获取高质量的血液样本。本研究的目的是介绍一种高效从大鼠锁骨下静脉采血的方法。该技术可通过单人操作快速采集到满意的血样，且无需麻醉。
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方案
本研究遵循《实验动物护理和使用指南》第8版中规定的指导原则13。研究已获得兰州大学第二医院伦理委员会的批准，并按照《ARRIVE 指南 2.0》14的要求进行记录。12只健康的Wistar大鼠（6只雄性，体重290–330 g；6只雌性，体重250–280 g），年龄为12–16周，在正式实验前于兰州大学GLP动物实验室饲养适应3天。所使用的大鼠笼具为R5型，尺寸为545 mm × 395 mm × 200 mm，并配有经高压灭菌的垫料。所有大鼠均可自由摄取食物和饮水。实验室环境保持平均湿度25%，平均温度24 °C，光照周期为昼夜交替（上午7:00/晚上7:00）。研究结束时，所有动物均通过过量异氟烷实施人道安乐死。有关本研究中所用材料和仪器的详细信息，请参见材料表。
1. 样本量计算与动物选择
- 采用资源方程法15，利用公式（1）估算动物样本量。
E = 动物总数 − 组总数（1）
其中，E 为方差分析（ANOVA）的自由度，取值范围为 10 至 20。
注：本研究中，将 12 只动物分为两组 A 和 B（每组三只雄性和三只雌性）。 - 将本研究的主要结局指标定义为单个操作者重复采血的成功率和耗时。
- 将次要结局指标定义为大鼠体重、食物和水摄入量的变化，以及不良事件的发生情况（如锁骨骨折、皮下血肿、气胸和死亡）。
- 将成功的血液采样定义为同时满足以下标准：i）单次采血穿刺次数少于三次；ii）总时间（从固定大鼠至完成采血）不超过 5 分钟；iii）达到目标采血量并获得清晰的血浆。任何不符合上述标准的情况均视为采血失败。
2. 动物固定与采血
注意：来自组别的血样 A 和 B 由两名经验丰富的研究人员采集大鼠样本，两人均至少采集过100次血液样本。在4天内，对两组大鼠共进行了96次血液样本采集。该采血方法无需对大鼠进行麻醉或使用额外的固定装置，但需要熟练的操作技术。
- 在采血前一天（第1天）上午8:00，将每只大鼠分配至单独的笼子，并称量其食物和饮水的重量。随后，由另一位研究人员在不知晓测量信息的情况下，从第1天起每天上午8:00记录大鼠的体重、食物消耗量和饮水摄入量。
- 按照本方案，每天上午10:00和晚上10:00各采血一次，交替从两侧锁骨下静脉采集0.15 mL血液。
注意：采血量根据体重最轻的大鼠在一周内可耐受的最大血液体积确定。 - 用肝素钠（25 U/mL）冲洗注射器，并用酒精对注射部位进行消毒。
- 轻轻抚摸大鼠背部皮肤，并反复捏住其颈部，以帮助大鼠放松（视频1）。
- 用非优势手的拇指和食指牢固地抓握并提起大鼠颈部皮肤（图1A 和 视频1）。
- 在优势手的配合下，用非优势手的其余三指和手掌固定大鼠背部皮肤，使其前肢保持固定（图1B、C 和 视频2）。
注意：若大鼠出现抵抗或挣扎，可重复此操作数次，以帮助其适应操作。以下步骤是成功采血的关键。 - 用非优势手的食指轻轻下压大鼠头部皮肤，同时其余手指和手掌协助将肩关节向外旋转。在此过程中，用优势手充分伸展大鼠的肩关节（图1D–F 和 视频2）。
- 用非优势手牢固固定大鼠，使其头部与身体保持在一条直线上（图1G、H）。然后用优势手定位锁骨位置，并确认穿刺点（图1I、视频2 和 视频3）。
注意：无需剃除大鼠体毛。在 图1 中，剃毛仅为了更清晰地展示锁骨及穿刺位置。在固定大鼠时，尤其是体重 >350 g 的大鼠，应让其足部接触稳固的表面，以帮助支撑其体重。此外，操作者在采血过程中应监测每只大鼠的呼吸频率，确保固定力度不过紧，以免引起呼吸困难。 - 用优势手持注射器，使其与大鼠身体平行，针尖朝上，注射器刻度面向实验者，与大鼠身体中线保持约15°角。将针头插入锁骨切迹下方0.5 cm处（即锁骨近端三分之一与胸骨交界处），确保针头始终保持与大鼠身体平行（图1J 和 视频3）。
注意：需特别注意针头插入的角度和深度，以避免刺穿血管或意外损伤邻近血管。 - 轻轻回撤注射器以产生负压，当针头进入血管时常可感受到明显的突破感（首次采血时尤为明显）。保持该位置，并根据需要以恒定速度采集0.1–1.0 mL血液（遵循IACUC指南，每周每公斤体重采血约4–5.3 mL1）（图1K 和 视频3）。
- 若穿刺后无血液流出，可尝试轻微调整针头角度和深度，或轻轻旋转注射器（视频3）。若同一侧连续三次尝试均失败，则应停止出血，换至对侧进行穿刺。
注意：应快速穿刺皮肤，以避免大鼠因不适而挣扎。 - 用棉签按压止血，并将大鼠放回笼中（视频4）。
- 根据实验要求处理血液样本。
3. 血液样本处理
- 将注射器针头弃置于锐器容器中。将采集的血液转移至预先用肝素冲洗过的1.5 mL微量离心管中。将该管放入离心机，在4 °C、1,200 × g 条件下离心10分钟，以分离血浆。使用1.0 mL巴斯德吸管将血清转移至干净的微量离心管中，并于-80 °C保存。
注意：为防止因压力导致溶血，必要时应取下针头。吸取血浆时，避免吸入管底的血细胞。有时注射器表面可能沾有大鼠毛发，请注意勿使任何毛发进入管内，以免引起凝血。
4. 统计学分析
- 所有数据均以均值 ± 标准差表示，并进行方差齐性检验。
- 采用费舍尔精确检验比较各组之间的成功率。
- 采用双样本独立 t 检验比较两组之间的总体均值。
- 对连续性测量指标（如采血时间、体重、食物摄入量和饮水量）采用方差分析（ANOVA）。认为 P < 0.05 具有统计学显著性。
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结果
高质量的血浆样本呈淡黄色，清澈透明，无任何红色调或凝块，如图所示。 图 2A. 图 2B 分别显示因操作不当导致的溶血（左侧）或凝血（右侧）。在4天内进行的96次采血过程中，各组单次采血的平均时间 A 和 B 119.87 ± 33.62 秒和 123.28 ± 30.96 秒。两组在每日的采血时间上均无显著差异（t = 0.66, P = 0.54, 表1最短的单次采血时间分别为78秒和89秒。
成功单次采血所需的平均尝试次数在各组中分别为1.21和1.17 A 和 B，两组之间的尝试次数无显著差异（t = 0.58, P = 0.60, 表2）。两组的总体成功率分别为 ...
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讨论
尽管尾静脉采血是大鼠重复采血最常用的方法，但该方法可能受到麻醉药物的影响，且由于尾静脉较细，单次采血量有限，导致采血时间较长4,5。虽然高效液相色谱（HPLC）串联质谱（MS/MS）系统结合大鼠尾静脉毛细管微采样（CMS）可减少大鼠的用血量11，但并非所有机构都配备此类昂贵设备。从大鼠眶后静脉丛/窦采血常引起动物焦虑和疼痛，操作不当甚至可能损害其视力和健康，因此不推荐用于大鼠采血9。
锁骨下静脉位于大鼠胸大肌与三角肌之间，并在内侧锁骨的三分之一处汇入颈静脉（图4）。Yang 等人的研究显示，熟练操作者在麻醉状态下从大鼠锁骨下静脉采血的成功率约为90%，其穿刺操作从开始到结束的最短时间为65秒7。Wang 等人的研究采用垂直进针法从大鼠锁骨下静脉采集血液样本。尽管该方...
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披露
作者没有相关财务或非财务利益需要披露。
致谢
本研究由兰州大学第二医院萃英计划项目（项目编号：PR0121015）和甘肃省泌尿系统疾病研究重点实验室（项目编号：0412D2）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.75%生理盐水 | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | 配制肝素钠溶液 |
| 1 mL 巴氏吸管 | Biosharp | BS-XG-01-NS | 采血 |
| 1 mL 注射器（26 G，0.45 mm × 12 mm） | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | 采血 |
| 1.5 mL Eppendorf 管 | Biosharp | BS-15-M | 血液储存与采集 |
| 75%医用酒精 | 山东利聪医疗科技有限公司 | —— | 大鼠采血部位消毒 |
| 离心管架 | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| 电子天平 | 上海浦春计量仪器有限公司 | JE1002 | 称重 |
| 肝素钠注射液 | 河北常山生化药业股份有限公司 | —— | 冲洗注射器和EP管；用生理盐水稀释至25 U/mL |
| 低温离心机 | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | 血清分离 |
参考文献
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勘误
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 3/21/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66075
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