有意识大鼠的锁骨下静脉血液采样

大鼠是最常见的实验动物之一，获取血液样本的方法有很多种。对于在结束阶段涉及单次采血的实验，可以通过心脏穿刺或腹主动脉采血获得足够量的血液¹。然而，一些研究需要从大鼠身上重复采血以进行常规血液或生化分析，特别是在药代动力学和毒理学研究中，需要重复采血以确定药物的吸收、分布和代谢²。

目前，虽然尾静脉采血是大鼠采血最常见的方法，尽管不需要麻醉，但这种方法对于重复采集可能具有挑战性，并且采集的血液量相对较小^3,4。此外，虽然可以从隐静脉和静脉收集血液，但获得的血液量有限，并且需要麻醉^1,5。此外，从下颌下静脉丛以及舌下、颈静脉和锁骨下静脉采集的血液样本可提供更高质量的样本，但通常需要麻醉或多人的协助 1,6,7,8,9。最后，眶后窦/耳道采血不仅需要麻醉，还可能对大鼠造成伤害和压力⁹.

通常从主要静脉获得的血液样本的质量通常达到最高标准¹。目前，一些研究发现，通过颈静脉连续显微取样是一种非常适合大鼠毒理学研究的方法，尽管这种方法通常需要颈静脉导管插入^术10,11,12。因此，如何在不进行手术干预的情况下，按照动物研究的3R原则获得高质量的血液样本，是值得探索的。本研究的目的是提出一种有效从大鼠锁骨下静脉中提取血液的方法。该技术无需麻醉即可通过单人手术快速收集令人满意的样本。

本研究遵循了《实验动物护理和使用指南》第 8 版中概述的指南¹³。该研究获得了兰州大学第二医院伦理委员会的批准，并按照ARRIVE指南2.0¹⁴进行了记录。12-16周龄的12只健康Wistar大鼠（6只雄性体重290-330 g，6只雌性体重250-280 g）在兰州大学GLP动物实验室进行3天实际实验。使用的鼠笼为R5型，尺寸为545 mm x 395 mm x 200 mm，并配备了高压灭菌垫料。所有大鼠都可以不受限制地获得食物和水。实验室保持平均湿度为25%，平均温度为24°C，昼夜交替（上午7:00/晚上7:00）。在研究结束时，所有动物都使用过量的异氟烷被人道地安乐死。有关本研究中使用的材料和仪器的全面信息，请参阅 材料表。

1. 样本量计算和动物选择

1. 选择资源方程方法¹⁵ ，使用方程（1）估计动物样本量。
   E = 动物总数 − 组总数 （1）
   其中 E 是方差分析的自由度 （ANOVA），范围为 10 到 20。
   注意:在这项研究中，将12只动物分为 A 组和 B 组（每组三只雄性和三只雌性）。
2. 将本研究的主要结果定义为单个人重复采血的成功率和时间消耗。
3. 将次要结果指标定义为大鼠体重、食物和水摄入量的变化，以及不良事件的发生率（如锁骨骨折、皮下血肿、气胸和死亡率）。
4. 将成功的采血定义为满足以下标准:i） 单次采血少于三次;ii） 总时间（从大鼠约束到完成采血）不超过 5 分钟;iii）在获得透明血浆的同时达到目标血容量。将任何偏离这些标准的行为视为抽样失败。

2. 动物约束和采血

注意: A 组和 B 组大鼠的血液样本由两名经验丰富的研究人员收集，他们都抽取了至少100份血液样本。在4天内从两组大鼠中收集血液样本共96次。这种采血方法不需要对大鼠进行麻醉或额外的约束装置。然而，它需要熟练的处理技术。

1. 在采血前一天（第1天）上午8:00，将每只大鼠分配到其单独的笼子中，同时称量其食物和水。然后，让另一位研究人员对测量结果视而不见，从第 1 天开始每天上午 8:00 记录大鼠的体重、食物消耗量和饮水量。
2. 要遵循此方案，首先在每天上午 10:00 抽血，然后在晚上 10:00 抽血，从两侧锁骨下静脉交替采集 0.15 mL 血液。
   注意:要收集的血液量由体重最低的大鼠在一周内可以忍受的最大体积决定。
3. 用肝素钠（25 U / mL）冲洗注射器，并用酒精对注射部位进行消毒。
4. 轻轻抚摸大鼠的背部皮肤并反复捏住它的脖子，以帮助大鼠放松（视频1）。
5. 使用非惯用手的拇指和食指，牢牢抓住并抬起大鼠的颈部皮肤（图1A 和 视频1）。
6. 在惯用手的协调下，用剩下的三个手指和非惯用手的手掌固定大鼠的背部皮肤并固定其前肢（图1B，C和视频2）。
   注意:如果老鼠反抗或挣扎，可以重复几次此过程，以帮助老鼠习惯处理。以下步骤是成功采血的关键。
7. 使用非惯用手的食指，轻轻向下推大鼠的头部皮肤，而其他手指和手掌则帮助向外旋转肩关节。在此过程中，用惯用手完全伸展大鼠的肩关节（图1D-F和视频2）。
8. 用非惯用手牢牢抓住大鼠，使大鼠的头部和身体对齐成一条直线（图1G，H）。然后，用惯用手定位锁骨的位置并确认穿刺部位（图1I，视频2和视频3）。
   注意:没有必要给老鼠剃毛。在 图 1 中，剃须只是为了在更大程度上显示锁骨和穿刺位置。当约束大鼠，尤其是大鼠>350克时，让大鼠将脚放在坚实的表面上将有助于支撑它们的体重。此外，约束器在采血时应监测每只大鼠的呼吸频率，以确保约束装置不会太紧，这可能会导致呼吸窘迫。
9. 用惯用手握住与大鼠身体平行的注射器，针尖朝上，注射器秤朝向实验者，与大鼠身体中线保持约15°角。将针插入锁骨切迹下方0.5厘米处（锁骨近端三分之一和胸骨的交界处），确保针头与大鼠的身体保持平行（图1J 和 视频3）。
   注意: 应特别注意针头插入的角度和深度，以免刺穿血管或对相邻血管造成意外损伤。
10. 轻轻抽出注射器以产生负压，通常伴有进入血管时可触及的突破感（在初始采血期间尤为明显）。保持这个姿势，并根据需要以恒定速度收集0.1-1.0mL血液（遵循IACUC指南，每周约4-5.3mL / kg血液¹）（图1K 和 视频3）。
11. 如果穿刺时没有血，请尝试轻轻调整针头的角度和深度或轻轻旋转注射器（视频 3）。如果在同一侧连续三次尝试均不成功，请停止所有出血，然后切换到另一侧进行穿刺。
    注意:建议快速刺穿皮肤，以防止大鼠因不适而挣扎。
12. 用棉签止血，然后将大鼠放回笼子里（视频4）。
13. 根据实验要求处理血液样本。

3. 血样处理

1. 将注射器针头倒入锐器容器中。将收集的血液转移到先前用肝素冲洗的 1.5 mL 微量离心管中。将管放入离心机中，将其设置为4°C和1,200× g，并离心10分钟以分离血浆。使用1.0mL巴斯德移液管将血清转移到干净的微量离心管中，并将其储存在-80°C。
   注意: 为防止因压力而溶血，必要时请取下针尖。在血浆抽吸过程中，避免从试管底部抽取血细胞。有时，注射器的表面可能会收集老鼠的皮毛;注意不要让任何毛皮进入管子，因为它会导致凝血。

4. 统计分析

1. 将所有数据呈现为均值±标准差，并检验它们的方差均匀性。
2. 使用 Fisher 精确检验来比较组间的成功率。
3. 使用双样本独立 t 检验来比较两组之间的总体均值。
4. 使用方差分析 （ANOVA） 进行连续测量，例如血液采样时间、体重、食物摄入量和饮水量。考虑 P < 0.05 具有统计学意义。

如图2A所示，高质量的等离子体标本呈现淡黄色调、清晰度和透明度，没有任何红色调或凝血。图2B分别显示了由于程序不当导致的溶血（左侧）或凝血（右侧）。在4天内的96次采血过程中，A组和B组的平均单次采血时间分别为119.87±33.62 s和123.28±30.96 s。两组每日采血时间无显著差异（t = 0.66，P = 0.54，表1）。 最短的个体采血时间分别为78 s和89 s。

A组和B组成功单次采血所需的平均尝试次数分别为1.21次和1.17次。两组之间的尝试次数没有显著差异（t = 0.58，P = 0.60 ，表2）。A组和B组的总体成功率分别为93.8%（45/48）和95.8%（46/48），两组之间的总体成功率无显著差异（P > 0.05，表1）。B组各时间点采血时间无显著差异。A组第2天采血时间小于第4天（105.75 ± 14.22s vs 144.5 ± 25.45 s，t = 12.39，P < 0.01; 表1）。 此外，更多的尝试和更长的穿刺时间通常表明更高的失败率（图3A-C）。第三天，B组遭遇了一次因溶血而失败的失败。第四天，A组遭遇了三次失败:一次是溶血，两次是无法获取血样。B组还因无法获得血液样本而经历了一次失败。

在连续4天的观察过程中，两组大鼠都表现出稳定的体重增加。同性大鼠的水和食物摄入量保持相对稳定。在整个采血过程中，没有发现大鼠死亡的情况，也没有观察到任何明显的并发症，如锁骨骨折、气胸或穿刺伤部位血肿（图3D-F和表3）。

图1:大鼠锁骨下静脉的固定和采血方法。 （A-H） 固定的操作;（一）锁骨和采血部位的位置;（J-L）采血和止血的过程。请点击这里查看此图的较大版本.

图2:成功和不成功采集的血液样本。 （A） 典型血样和分离血浆;（B）溶血（左）和凝血（右）血样 请点击这里查看此图的较大版本.

图3:采血有效性和安全性的评估。 （A） 每天平均采血时间;（二）日均穿刺次数;（三）两组采血成功率和失败率;（D-F） 两组大鼠采血过程中体重、食物摄入量和水摄入量的变化。请点击这里查看此图的较大版本.

图4:大鼠颈部血管的解剖结构。 （A） 浅表解剖结构;（二）深层解剖结构。 请点击这里查看此图的较大版本.

表1:两组大鼠的采血次数和成功率。 * A 组第2天采血时间小于第4天（t = 12.39 P < 0.01）。

表2:大鼠采血的平均穿刺次数。

表3:大鼠日体重、食物摄入量和水分摄入量的变化。

视频1:大鼠的镇静和处理。请按此下载此影片。

视频2:大鼠的约束程序。请按此下载此影片。

视频3:大鼠的采血程序。请按此下载此影片。

视频 4:穿刺部位的止血压迫。请按此下载此影片。

作者没有相关的财务或非财务利益需要披露。