使用 CRISPR-Cas9 系统生成 RIP1 敲除 U937 细胞系

摘要

随着 CRISPR 相关方案变得越来越有用和可及，在特定的实验条件下仍然会出现并发症和障碍。该方案概述了使用 CRISPR/Cas9 创建受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1 （RIPK1/RIP1） 敲除人细胞系，并强调了在此过程中遇到的潜在挑战。

摘要

该方案概述了在人单核细胞 U937 细胞系中使用 CRISPR/Cas9 敲除 RIP1 基因的程序。该方法利用指定的向导 RNA 质粒和慢病毒包装质粒来实现 RIP1 基因敲除。该方案解决了对传统 CRISPR 方法的挑战和改进，使其能够在未来的细胞死亡研究中复制。所得突变细胞可用于研究细胞死亡的机制变化，否则功能性 RIP1 蛋白将发挥作用。活力测定表明，坏死性凋亡诱导后敲除细胞的细胞死亡显著减少。荧光显微镜显示，在相同条件下，敲除细胞中的线粒体活性氧 （ROS） 显着降低。这些功能测定共同证实了 RIP1 蛋白的丢失。该程序针对 U937 人单核细胞进行了优化，也可用于靶向其他关键细胞死亡调节因子，产生功能性、非致命突变体。自始至终都解决了潜在的陷阱，以提供对突变体生成过程中可能出现的挑战的见解。

引言

自发现以来，CRISPR/Cas9 基因编辑技术的使用一直在迅速发展 ^1,2,3。敲入或敲除细胞系或细菌内基因的能力对于推进研究和理解细胞内机制非常宝贵 1,2,3,4,5,6。CRISPR-Cas9 系统通过简化基因特异性的工程设计，改进了以前的基因编辑方法，例如转录激活因子样效应子核酸酶 （TALEN）。该程序包括两个基本组分：用于定位预期基因靶标的向导 RNA （gRNA） 和 Cas9，Cas9 是一种核酸内切酶，可通过双链 DNA 断裂修饰预期基因组位置 ^3,4。gRNA 将作为 Cas9 核酸内切酶的向导，通过 Watson-Crick 碱基配对定位并启动预期基....

方案

图 1 提供了该过程的示意图。向导 RNA （gRNA） 和靶序列如表 1 所示。材料表中列出了所用试剂和所用设备的详细信息。

1. 从大肠杆菌中收获靶向 RIP1 的 CRISPR gRNA 慢病毒表达载体，其中包含 Cas9 核酸内切酶和嘌呤霉素耐药性

1. 在补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素的LB 琼脂平板上含有慢病毒载体 gRNA 的象限条纹大肠杆菌。
2. 在 37°C 下孵育板 1-2 天，直到在板最稀释的区域可以看到单个菌落。
3. 选择带有无菌定量环的单个菌落，并将每个菌落单独添加到 5 mL 补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 肉汤中，放入 50 mL 锥形管中。确保在添加单个菌落后彻底上下移液以确保均质化。
4. 放空并贴上 50 mL 锥形管的盖子，并在 37°C 和 225 rpm 的定轨振荡器中孵育 8 小时。
5. 在 37°C 下孵育 8 小时期间，将 40 mL 补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 肉汤添加到四个单独的 50 mL 锥形管中。
6. 在 37°C 下孵育 8 小时后，取 40 μL ....

结果

在产生 RIP1 CRISPR 突变体 U937 细胞的汇合群体后，进行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。Western blot 分析用于通过评估 RIP1 蛋白表达水平的损失来确定 RIP1 CRISPR 突变细胞系的成功创建。该确定是基于 WT U937 单核细胞和 NTC 细胞的比较结果做出的。 在图 2 中，未检测到 5 μg/mL 嘌呤霉素 RIP1 CRISPR 突变细胞的 RIP1 表达，但在 WT U937 和 NTC 细胞中均检测到 RIP1 的表达。该结果表明，该方案是选择可行的 RIP1 CRISPR 突变体的可靠且有效的方法。

随着 RIP1 CRISPR 突变细胞中 RIP1 蛋白表达的成功缺失，我们随后确定了这是否也等同于 RIP1 的功能缺失。在先前建立的研究中，肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、放线菌酮和泛半胱天冬酶抑制剂 zVAD-fmk 的组合是坏死性凋亡的直接刺激，缩写为 .......

讨论

该协议旨在提供慢病毒转染和转导效率和可靠性潜在陷阱的详细说明和分析，以创建 RIP1 敲除 U937 细胞系。虽然这种转染和转导方法费力且耗时，但通常认为是将所选 gRNA 和 Cas9 核酸内切酶掺入难转染细胞系的有效方法 ^8,9,20。与 U937 细胞和其他免疫细胞等单核细胞一样，进行转染存在固有的困难，因为它们具有识别并响应外源核酸的先天传感器。这可能导致核酸破坏/超突变、转录抑制和/或响应外源核酸的细胞死亡²¹。

这种递送方法只能使用能够制造慢病毒颗粒（HEK293T细胞）的细胞系，慢病毒颗粒是一种贴壁人胚胎肾细胞系，被广泛认为易于转染 ^9,10

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
调整后的 DMEM 介质	吉布科	11995-040
氨 苄 西林	西格马	A1593
双苯甲酰亚胺 Hoechst 33342 三盐酸盐	西格马	B2261型
完整的 RPMI-1640 培养基	西格马	R6504型
CRISPR NTC gRNA 大肠杆菌菌株	transOMIC	TELA1011
CRISPR RIP1 gRNA 大肠杆菌菌株	transOMIC	TEVH-1162203
端对端旋转器	Thermo Scientific
EVOS FL 荧光显微镜	生命科技
GenElute 质粒 Maxiprep 试剂盒	西格马	PLX15
山羊抗兔 IgG 抗体，（H+L） HRP 偶联物	西格马	AP307P型
HEK293T细胞	ATCC
培养箱摇床	新不伦瑞克科学
LB琼脂	屋宇 署	244520
LB肉汤	屋宇 署	244610
LV-MAX 慢病毒包装混合物	吉布科	A43237
MitoSOX 红色	医疗化学快递	海-D1055
NanoDrop分光光度计	Thermo Scientific
Necrostatin-1	医疗化学快递	HY-14622A
光学-MEM	吉布科	31985-062
嘌呤霉素	西格马	第 7255 页
兔抗人 RIP1 单克隆抗体	细胞信号传导技术	3493
SDS-PAGE 和蛋白质印迹设备	生物辐射
TNF-&α;	医疗化学快递	HY-P7058型
U937 人单核细胞	ATCC
WST-1 细胞增殖检测系统	塔卡拉	MK400型
X-tremeGENE 9 DNA 转染试剂	罗氏诊断	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	A1902