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方法文章

使用 CRISPR-Cas9 系统生成 RIP1 敲除 U937 细胞系

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DOI：

10.3791/66077

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2025年4月11日

 ,  , 
1Department of Life Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences, 2Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College

本文内容

摘要

随着CRISPR相关技术方案变得越来越实用且易于获取，在特定实验条件下仍可能出现复杂情况和障碍。本方案概述了利用CRISPR/Cas9技术构建受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1/RIP1）基因敲除人源细胞系的步骤，并重点指出了在此过程中可能遇到的潜在挑战。

摘要

本方案概述了利用CRISPR/Cas9技术在人单核细胞U937细胞系中敲除RIP1基因的操作流程。该方法采用特异性设计的引导RNA质粒和慢病毒包装质粒，实现RIP1基因的敲除。本方案针对传统CRISPR方法中存在的挑战进行了优化与改进，便于在未来的细胞死亡研究中重复使用。所获得的突变细胞可用于研究细胞死亡过程中机制性变化，而这些过程在正常情况下依赖功能性RIP1蛋白的参与。细胞活力检测显示，在诱导坏死性凋亡后，敲除细胞的细胞死亡显著减少。荧光显微镜观察表明，在相同条件下，敲除细胞中线粒体活性氧（ROS）水平明显降低。上述功能实验共同证实了RIP1蛋白的缺失。本方案优化适用于U937人单核细胞，也可调整用于靶向其他关键的细胞死亡调控因子，从而获得具有功能且非致死性的突变细胞。文中全程讨论了可能存在的技术陷阱，以帮助研究人员了解在突变体构建过程中可能出现的挑战。

引言

自发现以来，CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展迅速1,2,3。在细胞系或细菌中敲入或敲除基因的能力，对于推动研究及深入理解细胞内机制具有不可估量的价值1,2,3,4,5,6。相较于转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）等早期基因编辑方法，CRISPR-Cas9系统通过简化基因特异性的工程设计而实现了显著改进。该系统包含两个基本组分：用于定位目标基因的向导RNA（gRNA），以及作为内切核酸酶的Cas9，后者可在目标基因组位点引起双链DNA断裂3,4。gRNA通过Watson-Crick碱基配对，引导Cas9内切核酸酶定位至目标基因序列并启动双链断裂。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑全过程，依赖细胞内的修复机制通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组来修复这些DNA双链断裂3,7。其中更常发生的是NHEJ，这通常会在基因组中产生突变，导致目标基因的表达丧失3,4。

商业来源已能够构建可通过细菌培养和分离进行表达的gRNA靶点文库，这显著提高了其使用的便捷性。然而，CRISPR/Cas9系统的主要局限在于将gRNA与Cas9复合物递送至靶细胞系的困难。这一问题在悬浮细胞系中尤为突出，因为这类细胞通常被称为难以转染的细胞8。常规的转染方法通常难以高效地将CRISPR/Cas9系统导入悬浮细胞，因此，诸如慢病毒转染和转导等病毒递送方法更适合此类细胞系8,9。

这种转染需要使用一种慢病毒载体，该载体编码gRNA和Cas9内切酶，并结合添加的慢病毒包装质粒，共同转染至能够产生慢病毒颗粒的细胞系中。通常选择HEK293T细胞作为该过程的细胞系，因为它们更容易转染，并且在gRNA和Cas9的组装过程中效率很高9,10。这些颗粒随后以慢病毒形式释放到上清液中，可用于将gRNA和Cas9转导至目标悬浮细胞系中，例如U937人单核细胞。因此，与已建立的方法相比，本文所述方案具有以下改进：（1）针对难以转染的细胞系采用替代性转染方法；（2）无需浓缩CRISPR质粒DNA或使用超速离心机；（3）无需进行单细胞克隆。

本文的直接目标是在U937人单核细胞中敲除RIP1基因。由RIP1调控的坏死性凋亡（necroptosis）是一种高度促炎性的细胞死亡通路的经典形式，是细胞死亡研究中的一个关键靶点11,12,13,14。当RIP1通过自磷酸化被激活后，会招募并直接磷酸化受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3/RIP3）以及混合谱系激酶结构域样（MLKL）假激酶，从而形成坏死小体（necrosome）。该复合物形成后，可在细胞内自由移动，并与线粒体等细胞器相互作用12,13。在线粒体上，RIP1与细胞代谢之间建立正反馈环路，直接影响线粒体活性氧（ROS）的产生，进而促进RIP1的进一步自磷酸化、坏死小体的形成以及坏死性凋亡的下游执行过程11,12,13,14。

尽管当前研究团队的重点是RIP1在细胞死亡中的作用，但研究RIP1的其他原因还包括其在炎症和感染中的功能。当死亡受体（如TNF受体）被激活时，RIP1可促进NF-κB信号通路的活化，从而触发促炎性细胞因子、趋化因子及其他对免疫细胞募集和炎症反应放大至关重要的分子的转录15。除了激活NF-κB通路外，RIPK1还可参与MAPK信号通路，进一步增强炎症反应15,16。在应对感染方面，RIP1作为宿主炎症反应的关键介质发挥作用，特别是在模式识别受体（如Toll样受体TLRs）识别病原体相关分子模式（PAMPs）后发挥重要作用17。此外，在脓毒症过程中，RIP1通过死亡受体（如TNF受体）的信号传导被激活，进而启动促炎级联反应。RIPK1介导NF-κB和MAPK通路的活化，促进TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子的产生，这些因子是脓毒症特征性全身炎症反应的关键驱动因素18。

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方案

该实验流程的示意图见图1。向导RNA（gRNA）及靶序列见表1。所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。

1. 从大肠杆菌（Escherichia coli）中提取含有Cas9核酸酶和嘌呤霉素抗性的靶向RIP1基因的CRISPR gRNA慢病毒表达载体

  1. 四区划线法 E. coli 携带慢病毒载体gRNA至添加有抗生素的LB琼脂平板上 100 µg/mL 氨苄青霉素
  2. 将平板在37°C孵育1-2天，直至平板上最稀释区域出现可见的单个菌落。
  3. 用无菌接种环挑取单菌落，将每个单菌落分别加入含有100 µg/mL氨苄青霉素的5 mL LB液体培养基中，置于50 mL锥形管内。加入单菌落后，务必充分上下吹打，确保菌液均匀混匀。
  4. 将50 mL锥形管管口通风并用封口膜封好，置于37°C、225 rpm的摇床中孵育8小时。
  5. 在37°C孵育8小时期间，向四个独立的50 mL锥形管中分别加入40 mL添加了100 µg/mL氨苄青霉素的LB肉汤。
  6. 在37°C孵育8小时后，取40 µL培养物 E. 大肠杆菌培养物并加入全部四个50 mL离心管中。
  7. 将50 mL锥形管的管盖打孔并用胶带固定，于37°C、225 rpm条件下在摇床中孵育12–16小时。
  8. 在37°C孵育后，将所有离心管在3220 x g 在摆桶转子中离心20分钟，以沉淀培养物 E. coli 细菌
  9. 将上清液倒入废液烧杯中，然后将全部四个沉淀重悬于10 mL添加了100 µg/mL氨苄青霉素的LB肉汤培养基中。
  10. 再次使用水平转子以最大速度离心合并后的沉淀物20分钟，以获得单一沉淀。
  11. 尽可能弃去上清液至废液杯中，然后选择以下其中一种方案进行操作：（1）将湿润的沉淀物直接于 -80°C 冻存，可保存长达1个月。（2）继续进行慢病毒载体质粒的纯化。
    注意：如果选择选项1，可在此暂停实验方案。

2. 使用靶向RIP1的纯化CRISPR gRNA慢病毒表达载体转染HEK293T细胞

  1. 将 HEK293T 细胞以 3 × 106 至 5 × 106 个细胞的浓度接种于含 DMEM 的 10 cm 培养皿中，培养基中包含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、110 mg/L 丙酮酸钠和 10% 热灭活胎牛血清（FBS），过夜培养。
  2. 次日，确保培养皿中细胞融合度约为 70%–90%，随后进行后续操作。
  3. 使用转染试剂，按照质粒 1:1:1:1 的比例（实验用 CRISPR 质粒 : pLP1 : pLP2 : pLP/VSVG）以及转染试剂与质粒 DNA 3:1 的比例（3 份试剂 : 1 份质粒 DNA），在低血清培养基中进行细胞转染。
    注意：比例中的 pLP1 : pLP2 : pLP/VSVG 部分为慢病毒包装混合物。
    1. 转染前，将转染试剂、低血清培养基、CRISPR 质粒 DNA 和慢病毒包装混合物平衡至室温。
    2. 将 75 µL 转染试剂、2500 µL 低血清培养基和总共 25 µg DNA（根据分光光度计测定的 CRISPR 质粒 DNA 浓度，并按与慢病毒包装混合物 1:1:1:1 的比例计算）混合均匀。
    3. 室温孵育该混合物 15–30 分钟。随后小心地将全部混合液体积直接加入融合的 HEK293T 细胞培养皿的培养基中（无需更换培养基）。
  4. 轻轻摇晃培养皿，以确保转染混合物与培养基充分混匀。将培养皿置于 37 °C 培养箱中孵育 48 小时。

3. U937 细胞或靶细胞的慢病毒转导

  1. 完成37°C下48小时的孵育后，将生产用HEK293T细胞培养板中的培养基转移至15 mL锥形管中。
  2. 在室温下以800 × g离心5分钟，使任何残留的HEK293T细胞形成沉淀。小心移除含有病毒的上清液，避免扰动沉淀的HEK293T细胞，并将其保存在另一个15 mL锥形管中。随后，对含有沉淀的管子进行去污染处理，并将其丢弃至适当的生物危害废物容器中。
    注意：基于HIV的慢病毒上清液可保存在-80°C；然而，经过首次冻融循环后，病毒稳定性可能损失高达55%19。
  3. 取适量体积的U937细胞，在室温下以400 × g离心10分钟，弃去上清液，留下细胞沉淀，获得含有2 × 106个U937细胞的沉淀于15 mL锥形管中。
  4. 用全部含病毒的上清液重悬U937细胞沉淀，然后以290 × g离心60分钟。
  5. 离心结束后，使用移液器将管中已存在的含病毒上清液重新悬浮细胞沉淀。
  6. 将管子置于翻转旋转仪（或类似的旋转装置）上，旋转孵育60分钟。
    1. 孵育结束后，在室温下以400 × g离心10分钟，使细胞沉淀。
    2. 用含病毒上清液与完全RPMI-1640培养基（补充10%热灭活FBS）按1:1比例混合的培养基重悬细胞沉淀。
  7. 将细胞混合物转移至10 cm组织培养皿中，在37°C下孵育48小时。
  8. 孵育结束后，在室温下以400 × g离心U937细胞10分钟，并移除上清液。
    1. 用补充有10%热灭活FBS和5 µg/mL嘌呤霉素的完全RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，并将细胞转移至T25培养瓶中。
    2. 在37°C下静置培养2-3周，每隔1-2天观察细胞生长情况。
      注意：当细胞达到汇合状态，并在初次传代后具有健康的增殖周期时，即可检测本实验方案的完成效果。

4. 利用蛋白质印迹分析检测完成的实验方案在构建RIP1 CRISPR突变细胞中的有效性

  1. 制备野生型（WT）U937 单核细胞、非靶向对照（NTC）CRISPR 细胞以及 RIP1 CRISPR 突变细胞的细胞总蛋白裂解液11,12,13。
  2. 将上述裂解液进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，并进行 Western 印迹分析14。
    1. 首先使用内参蛋白对样品进行归一化处理。
    2. 归一化后，检测 RIP1 蛋白的表达水平，以充分评估构建 RIP1 CRISPR 突变细胞系的成功情况14。
  3. 在 Western 印迹分析确认后，细胞可用于后续实验。

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结果

在获得融合生长的RIP1 CRISPR突变型U937细胞后，进行了SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。通过检测RIP1蛋白表达水平的缺失情况，利用蛋白质印迹分析来确认是否成功构建了RIP1 CRISPR突变细胞系。该判断基于野生型U937单核细胞与NTC细胞的比较结果。在图2中，5 µg/mL嘌呤霉素筛选的RIP1 CRISPR突变细胞未检测到RIP1表达，而野生型U937细胞和NTC细胞中均检测到了RIP1表达。该结果表明，本方案是一种可靠且有效的方法，可用于筛选具有活性的RIP1 CRISPR突变体。

在RIP1 CRISPR突变细胞中成功敲除RIP1蛋白表达后，我们进一步确定这是否同样导致RIP1功能的丧失。在既往已建立的研究中，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、放线菌酮（cycloheximide）和广谱caspase抑制剂zVAD-fmk的联合处理是诱导坏死性凋亡的直接刺激方法，简称为TCZ1...

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讨论

本实验方案旨在详细说明慢病毒转染与转导过程中可能影响效率和可靠性的潜在问题，并对其进行分析，以构建RIP1基因敲除的U937细胞系。尽管该转染与转导方法耗时且劳动密集，但通常被认为是一种将选定的gRNA和Cas9核酸酶有效导入难转染细胞系的可靠方法8,9,20。对于U937细胞等单核细胞及其他免疫细胞而言，由于其本身具有识别外源核酸的天然感受器，因此转染操作存在固有困难。这可能导致外源核酸被降解或发生超突变、转录抑制，和/或引发细胞死亡21。

该递送方法仅能使用能够产生慢病毒颗粒的细胞系来实现，即HEK293T细胞，这是一种贴壁生长的人胚肾细胞系，被广泛认为易于转染9,10。基于上述信息，本方案中列出了若干必须谨慎操...

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致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家心肺血液研究所（NHLBI）资助，资助编号为 NIH 2R15-HL135675-02，授予 T.J.L.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
改良 DMEM 培养基Gibco11995-040
氨苄青霉素SigmaA1593
双苯并咪唑 Hoechst 33342 三盐酸盐SigmaB2261
完全 RPMI-1640 培养基SigmaR6504
CRISPR NTC gRNA 大肠杆菌菌株transOMICTELA1011
CRISPR RIP1 gRNA 大肠杆菌菌株transOMICTEVH-1162203
旋转混合仪Thermo Scientific
EVOS FL 荧光显微镜Life Technologies
GenElute 质粒大提试剂盒SigmaPLX15
山羊抗兔 IgG 抗体（H+L）HRP 标记SigmaAP307P
HEK293T 细胞ATCC
摇床培养箱New Brunswick Scientific
LB 琼脂BD244520
LB 肉汤BD244610
LV-MAX 慢病毒包装混合液GibcoA43237
MitoSOX RedMedChemExpressHY-D1055
NanoDrop 分光光度计Thermo Scientific
坏死抑制剂-1MedChemExpressHY-14622A
OPTI-MEMGibco31985-062
嘌呤霉素SigmaP7255
兔抗人 RIP1 单克隆抗体Cell Signaling Technology3493
SDS-PAGE 及 Western 印迹设备BioRad
TNF-αMedChemExpressHY-P7058
U937 人单核细胞ATCC
WST-1 细胞增殖检测试剂盒TaKaRaMK400
X-tremeGENE 9 DNA 转染试剂Roche Diagnostics6365779001
z-VAD-FMKAPExBIOA1902

参考文献

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