在活体中可视化低丰度蛋白质及翻译后修饰 黑腹果蝇 胚胎 通过 荧光抗体注射

摘要

本方案描述了定制的基于抗体的荧光标记及其向早期Drosophila胚胎中的显微注射，以实现对低丰度蛋白或翻译后修饰的活体成像，这些目标分子使用传统的GFP/mCherry标签方法难以检测。

摘要

使用GFP（绿色荧光蛋白）及其他荧光标签对活细胞中的蛋白质进行可视化，显著提升了对蛋白质定位、动态行为和功能的理解。与免疫荧光相比，活体成像能够更准确地反映蛋白质的真实定位，避免了因组织固定而可能产生的假象。尤为重要的是，活体成像可实现对蛋白质水平和定位的定量与时间分辨分析，这对于理解细胞迁移或分裂等动态生物学过程至关重要。然而，荧光标记技术的一个主要局限在于需要足够高的蛋白表达水平才能实现有效可视化。因此，许多内源性标记但表达水平相对较低的荧光蛋白难以被检测到。另一方面，利用病毒启动子进行异位表达有时可能导致蛋白质在生理环境中的错误定位或功能改变。为克服这些局限，本文介绍一种方法，利用高灵敏度的抗体介导蛋白检测技术在活体胚胎中实现蛋白可视化，本质上实现了无需组织固定的免疫荧光检测。作为原理验证，本研究对内源性GFP标记的Notch受体进行了检测，该受体通常难以被检测到 在活体胚胎中注射抗体后，可成功实现可视化。此外，该方法已被改进用于在活体胚胎中可视化翻译后修饰（PTMs），从而能够在早期胚胎发育过程中检测酪氨酸磷酸化模式的时间动态变化，并揭示出位于顶端膜下方的一类新的磷酸酪氨酸（p-Tyr）亚群。该方法可进一步调整，以适用于其他针对特定蛋白质、特定标签或特定翻译后修饰的抗体，且应可兼容其他可注射的模式生物或细胞系。本实验方案为传统荧光标记方法难以检测的低丰度蛋白质或翻译后修饰的活体成像提供了新的可能性。

引言

免疫荧光是现代细胞生物学的一项核心技术，最初由 Albert Coons 开发，可用于在细胞天然区室中检测分子，并对细胞器或分子机器的分子组成进行表征¹。结合基因操作技术，免疫荧光有助于确立目前广为接受的观点：蛋白质的定位对其功能至关重要²。除了特异性的一抗和高亮度的荧光染料外，该技术的成功还依赖于一个称为固定和通透的预处理步骤，该步骤可保持细胞形态、固定抗原，并提高抗体进入细胞内区室的可及性。不可避免的是，固定和通透过程会杀死细胞并终止所有生物学过程³。因此，免疫荧光仅能提供蛋白质生命历程的静态快照。然而，许多生物学过程（如细胞迁移和分裂）本质上是动态的，需要以时空分辨的方式研究蛋白质的行为^4,5。

为了研究活体生物中的蛋白质动态，已开发出基于基因编码的荧光蛋白（如绿色荧光蛋白，GFP）⁶ 和高速共聚焦显微镜的活体成像方法。简而言之，可将目标蛋白通过基因操作与 GFP⁷ 融合，并通过病毒或酵母启动子（如巨细胞病毒启动子 CMV⁸ 或上游激活序列 UAS

方案

实验按照南方科技大学生命科学学院的指南和批准进行。所使用的生物体是 黑腹果蝇，基因型分别为Notch-Knockin-GFP（X染色体）和Sqh-sqh-GFP（第二染色体），分别由弗朗索瓦·施韦斯古特博士（巴斯德研究所）和詹妮弗·扎伦博士（斯隆-凯特琳研究所）的实验室慷慨提供。尽管本实验方案主要关注抗体标记和活体成像的相关步骤，有关更详细的描述请参考已发表的文献 黑腹果蝇 胚胎收集与显微注射^15,16.

1. 抗体的荧光标记

1. 建议使用针对目标蛋白的单克隆抗体或纳米抗体。将抗体储备液的浓度配制为1 mg/mL或更高。
   ​注意：在本研究中，GFP纳米抗体（参见 材料表) 以商品化的GFP纳米抗体为例，其包装浓度为1.0 mg/mL，体积为250 µL。此外，可使用商品化的抗体标记试剂盒（参见 材料表) 利用 Alexa Fluor 594 通过琥珀酰亚胺酯反应与蛋白质的伯胺基团偶联¹¹重要的是，该标记过程不会显著改变抗体浓度。
2. 通过将抗体标记试剂盒中提供的组分B溶于1 mL去离子水中，配制1 M碳酸氢钠溶液。<....

结果

为了展示抗体注射方法相较于基于荧光标记的活体成像或免疫荧光技术的优势，本文提供了两个案例研究，用于表征低丰度跨膜受体Notch以及一种称为酪氨酸磷酸化的翻译后修饰在活体胚胎中的动态定位。

Notch 信号通路活性在胚胎发育及成体器官稳态过程中对细胞命运决定起着重要作用^18,19。当 Notch 跨膜受体被其配体 Delta/Jagged²⁰ 激活后，其胞内结构域被切割并释放至细胞核中²¹，从而启动下游转录程序，驱动细胞命运的改变²²。目前，通过免疫荧光技术已在甲醛固定的组织中对 Notch 受体的静态定位进行了充分表征。然而，由于缺乏一种能够以高速对这种丰度相对较低的蛋白进行活体成像的方法，Notch 在配体结合或胞内切割过程中的动态定位仍 largely 未知²³。在此，我们.......

讨论

本方案介绍了使用定制抗体对早期Drosophila胚胎进行荧光标记并随后显微注射的专门方法。该技术可实现对含量较低、通常难以通过传统的GFP/mCherry标记方法观察的蛋白质或翻译后修饰的实时可视化。

将该方法用于野生型与突变体胚胎之间的定量比较时应谨慎。尽管在免疫荧光实验中，对照组与实验组的一抗和二抗浓度可以保持一致，但注射到胚胎中的抗体总量以及标记效率可能在不同胚胎之间存在差异。因此，定量分析应仅限于追踪同一胚胎中荧光强度随时间的变化，或在多色活体成像时对同一胚胎内其他通道信号进行相关性分析。例如，可利用磷酸化酪氨酸（p-Tyr）与肌球蛋白的荧光强度进行共定位和相关性分析²⁷，但不能通过抗体注射法直接比较野生型与基因X敲低胚胎之间的p-Tyr信号强度。

与其它基于荧光标记的蛋白动态研究方法类似，抗体结合可能会改变目标蛋白的活性、转运或定位。因此，相较于多克隆抗体，更推荐使用单克隆抗体或纳米抗体进行注射。由于单克隆抗体或纳米抗体的表位定义明确，可通过Alph.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 抗体标记试剂盒	Invitrogen	A20185	第1.6步中的纯化柱包含在该试剂盒中
生物显微镜	SOPTOP	EX20	目镜：PL 10X/20；物镜：10x/0.25
漂白剂	Clorox®
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	TW100F-4
离心机	Eppendorf	5245
细胞筛	FALCON	352350
干燥室	LOCK&LOCK	HSM8200	320 ml
解剖显微镜	Mshot	MZ62	目镜：WF10X/22 mm
双面胶带	Scotch	665
精细超细镊子	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ 盖玻片：矩形	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	12-550-15
镊子	VETUS	33A-SA
卤代烃油 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
卤代烃油 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
庚烷	Sigma-Aldrich	H2198-1L	庚烷胶由浸入庚烷中的双面胶带制成
脱水试剂	TOKAI	1-7315-01	加至干燥室体积的90%
手动显微操作器	World Precision Instruments	M3301R
微量移液器拉制仪	World Precision Instruments	PUL-1000	程序： 第一步，加热：290，拉力：300，距离：1.00，延迟：50； 第二步，加热：290，拉力：300，距离：2.21，延迟：50
气动皮升泵	World Precision Instruments	PV 830	喷射压力：20 psi；  范围：100 ms；持续时间：定时控制
PY20	Santa Cruz	SC-508
方形培养皿	Biosharp	BS-100-SD
GFP 纳米抗体	Chromotek	gt