在活体中可视化低丰度蛋白质及翻译后修饰 黑腹果蝇 胚胎 通过 荧光抗体注射

摘要

本方案描述了定制的基于抗体的荧光标记及其向早期Drosophila胚胎中的显微注射，以实现对低丰度蛋白或翻译后修饰的活体成像，这些目标分子使用传统的GFP/mCherry标签方法难以检测。

摘要

使用GFP（绿色荧光蛋白）及其他荧光标签对活细胞中的蛋白质进行可视化，显著提升了对蛋白质定位、动态行为和功能的理解。与免疫荧光相比，活体成像能够更准确地反映蛋白质的真实定位，避免了因组织固定而可能产生的假象。尤为重要的是，活体成像可实现对蛋白质水平和定位的定量与时间分辨分析，这对于理解细胞迁移或分裂等动态生物学过程至关重要。然而，荧光标记技术的一个主要局限在于需要足够高的蛋白表达水平才能实现有效可视化。因此，许多内源性标记但表达水平相对较低的荧光蛋白难以被检测到。另一方面，利用病毒启动子进行异位表达有时可能导致蛋白质在生理环境中的错误定位或功能改变。为克服这些局限，本文介绍一种方法，利用高灵敏度的抗体介导蛋白检测技术在活体胚胎中实现蛋白可视化，本质上实现了无需组织固定的免疫荧光检测。作为原理验证，本研究对内源性GFP标记的Notch受体进行了检测，该受体通常难以被检测到 在活体胚胎中注射抗体后，可成功实现可视化。此外，该方法已被改进用于在活体胚胎中可视化翻译后修饰（PTMs），从而能够在早期胚胎发育过程中检测酪氨酸磷酸化模式的时间动态变化，并揭示出位于顶端膜下方的一类新的磷酸酪氨酸（p-Tyr）亚群。该方法可进一步调整，以适用于其他针对特定蛋白质、特定标签或特定翻译后修饰的抗体，且应可兼容其他可注射的模式生物或细胞系。本实验方案为传统荧光标记方法难以检测的低丰度蛋白质或翻译后修饰的活体成像提供了新的可能性。

引言

免疫荧光是现代细胞生物学的一项核心技术，最初由 Albert Coons 开发，可用于在细胞天然区室中检测分子，并对细胞器或分子机器的分子组成进行表征¹。结合基因操作技术，免疫荧光有助于确立目前广为接受的观点：蛋白质的定位对其功能至关重要²。除了特异性的一抗和高亮度的荧光染料外，该技术的成功还依赖于一个称为固定和通透的预处理步骤，该步骤可保持细胞形态、固定抗原，并提高抗体进入细胞内区室的可及性。不可避免的是，固定和通透过程会杀死细胞并终止所有生物学过程³。因此，免疫荧光仅能提供蛋白质生命历程的静态快照。然而，许多生物学过程（如细胞迁移和分裂）本质上是动态的，需要以时空分辨的方式研究蛋白质的行为^4,5。

为了研究活体生物中的蛋白质动态，已开发出基于基因编码的荧光蛋白（如绿色荧光蛋白，GFP）⁶ 和高速共聚焦显微镜的活体成像方法。简而言之，可将目标蛋白通过基因操作与 GFP⁷ 融合，并通过病毒或酵母启动子（如巨细胞病毒启动子 CMV⁸ 或上游激活序列 UAS⁹）进行异源表达。由于 GFP 本身具有自发荧光特性，因此无需使用荧光染料标记的抗体即可显示目标蛋白的定位，从而避免了固定或通透等预处理步骤。在过去的二十年中，已开发出覆盖整个波长光谱的多种荧光标签¹⁰，使得同时对多个目标蛋白进行多色活体成像成为可能。然而，与 AlexaFluor 或 ATTO 等化学合成的荧光染料相比，这些基因编码荧光蛋白在内源性启动子驱动下表达时，其自发荧光信号相对较弱且不稳定，尤其是在长时间活体成像过程中尤为明显¹⁰。尽管通过过表达荧光标记的目标蛋白可在一定程度上缓解这一不足，但许多具有酶活性的蛋白（如激酶和磷酸酶）若不在生理水平表达，会严重干扰正常的生物学过程。

本方案介绍了一种可在活体成像条件下实现光稳定的基于抗体的靶标标记方法，基本实现了无需固定或通透处理的免疫荧光成像（图1）。通过简单的NHS基伯胺反应¹¹，可将AlexaFluor 488或594等荧光染料与几乎所有一抗或GFP/HA/Myc纳米抗体进行偶联¹²。利用所有Drosophila胚胎细胞在合胞体阶段共享同一细胞质的发育特征¹³，在注射染料偶联抗体后，即可在整个胚胎中实现抗原结合与荧光标记。随着Drosophila及其他模式系统中内源标记蛋白文库的不断扩展¹⁴，该方法有望拓展这些文库的应用范围，揭示活体组织中低丰度荧光标记蛋白以及其他非荧光标记（如HA/Myc标记）蛋白的动态行为。

方案

实验按照南方科技大学生命科学学院的指南和批准进行。所使用的生物体是 黑腹果蝇，基因型分别为Notch-Knockin-GFP（X染色体）和Sqh-sqh-GFP（第二染色体），分别由弗朗索瓦·施韦斯古特博士（巴斯德研究所）和詹妮弗·扎伦博士（斯隆-凯特琳研究所）的实验室慷慨提供。尽管本实验方案主要关注抗体标记和活体成像的相关步骤，有关更详细的描述请参考已发表的文献 黑腹果蝇 胚胎收集与显微注射^15,16.

1. 抗体的荧光标记

1. 建议使用针对目标蛋白的单克隆抗体或纳米抗体。将抗体储备液的浓度配制为1 mg/mL或更高。
   ​注意：在本研究中，GFP纳米抗体（参见 材料表) 以商品化的GFP纳米抗体为例，其包装浓度为1.0 mg/mL，体积为250 µL。此外，可使用商品化的抗体标记试剂盒（参见 材料表) 利用 Alexa Fluor 594 通过琥珀酰亚胺酯反应与蛋白质的伯胺基团偶联¹¹重要的是，该标记过程不会显著改变抗体浓度。
2. 通过将抗体标记试剂盒中提供的组分B溶于1 mL去离子水中，配制1 M碳酸氢钠溶液。
3. 将抗体浓度调整至1.0 mg/mL，然后加入1/10^th 体积（100 µL GFP 纳米抗体对应 10 µL 的 1 M 碳酸氢钠溶液）。
4. 将110 µL抗体混合液（来自步骤1.3）直接加入含有Alexa Fluor 594染料的离心管中。轻轻颠倒混匀（勿涡旋），于室温下在旋转仪上孵育1小时。
5. 组装偶联试剂盒中的纯化柱（参见 材料表）。准备1.5 mL树脂床（抗体标记试剂盒中提供），将层析柱在1100 x g 室温（RT）下离心3分钟，以去除树脂中的过量液体。
6. 将反应混合物（来自步骤 1.4）逐滴加入树脂柱顶部，并在 1100 x g 在4 °C下离心5分钟以收集标记的抗体。收集到的抗体应呈粉红色，体积略小于100 µL。用铝箔包裹或置于避光管中，于4 °C保存。

2. 准备 果蝇 胚胎

1. 将200只新孵化的成年Drosophila放入一个圆柱形塑料笼中（直径 = 5 cm，高度 = 8 cm），雌雄比例为1:10。一侧用多孔金属网密封以通风，另一侧用含果汁/酵母糊的琼脂平板密封。
2. 在收集胚胎前连续三天每12小时更换一次琼脂平板。此操作可同步Drosophila的产卵过程，并提高收集效率。
3. 注射当天，将笼中的琼脂平板更换为酵母糊含量极少的果汁平板，在25 °C条件下收集1小时的胚胎。若第一轮收集获得的胚胎数量不足（<50个胚胎），则弃去第一块平板，重复此步骤进行第二轮收集，直至1小时内获得超过100个胚胎。
4. 将琼脂平板从笼中移除以终止产卵，并将胚胎在25 °C下继续孵育2小时，以获得发育2–3小时的胚胎。胚胎的正确发育阶段对抗体注射的成功至关重要。
5. 为去除胚胎的卵壳，向果汁平板中加入2 mL 50%次氯酸钠溶液（漂白剂），并用画笔轻轻刮下附着在平板上的胚胎（图2A-4）。通常胚胎会直接产在酵母糊表面，此时可将酵母糊一并刷入漂白剂溶液中，以确保收集全部胚胎。
6. 将漂浮的胚胎在50%漂白剂溶液中孵育2分钟，每隔30秒轻轻旋转果汁平板，以提高去壳效率。
7. 将胚胎与漂白剂的混合液倒入70 µm尼龙细胞筛中（图2A-7），使用洗瓶彻底冲洗胚胎，以去除残留的漂白剂和酵母糊。用纸巾将细胞筛完全擦干，确保胚胎周围无多余水分残留。

3. 胚胎排列与干燥处理

1. 制备一块 5 cm × 5 cm × 0.5 cm（宽、长、高）的 4% 琼脂糖凝胶（图 2A-9），并让其冷却至室温。使用洁净的剃刀切下一小块 1 cm × 3 cm × 0.5 cm（宽、长、高）的琼脂糖块，并将其放置在载玻片上（图 2A-2）。在解剖显微镜下检查凝胶块，确保边缘切割整齐，表面平整且干燥。
2. 使用画笔将胚胎从滤网上转移至凝胶块上。轻轻刷动，使胚胎均匀分布在凝胶块的中线上。理想情况下，胚胎聚集体应被分散为单个或成对的胚胎，且彼此不接触。
3. 准备一把镊子，将其两个臂用胶带紧密缠绕在一起，形成单一细尖端（图 2A-5）。在解剖显微镜下，用该镊子逐个拾取胚胎，并将其沿凝胶块的长边排列。排列 20–30 个胚胎，确保其前后轴与边缘平行（图 2C）。
4. 用移液器吸取 10 µL 正庚烷胶（见材料表），滴加至 24 mm × 50 mm 盖玻片中央（图 2A-1），并用移液器吸头将胶液涂抹成 0.5 cm × 3 cm 的矩形区域。使用前需等待胶液完全干燥。
5. 将带有凝胶块的载玻片置于实验台边缘，使胚胎朝外。用平头镊子夹起涂有胶的盖玻片（图 2A-6），保持其位于胚胎上方，胶面朝向胚胎，并呈约 45 度倾斜。
   注意：轻轻将盖玻片压向凝胶块，使胚胎接触胶面，然后迅速释放压力并提起盖玻片。施加的张力必须适中，以确保胚胎能稳定粘附于胶上，而不会因压力过大导致破裂。
6. 在新的载玻片中央滴加 10 µL 水，将带有胚胎的盖玻片放置其上，胚胎面朝上（图 2B）。必须使用水而非指甲油或其他粘合胶将盖玻片固定于载玻片，因为该侧盖玻片将直接接触共聚焦显微镜物镜，用于活体成像。
7. 将胚胎置于干燥室（图 2A-3）（见材料表）中干燥 10–15 分钟，直至卵黄膜出现皱缩（图 2E）。所需时间可能因实验室环境湿度而异，应根据各实验室条件进行优化测试。
8. 在胚胎条带的一端滴加 40 µL 卤代烃油（体积比为 1:1 的 27 型与 700 型混合液，见材料表）。倾斜载玻片，直至卤代烃油覆盖胚胎的整个表面。

4. 抗体注射与成像

1. 使用微量移液器拉制仪（参数设置见材料表）制备数根注射玻璃针，并用5 µL AlexaFluor标记的抗体溶液（来自步骤1.6）填充每根针头。
2. 将一块25 mm × 25 mm的盖玻片置于载玻片上。加入40 µL卤代烃油，并沿盖玻片边缘铺开。
3. 在注射显微镜下，将针尖对准油滴中的盖玻片边缘。调节微量注射泵（见材料表）的空气压力，使每次脉冲产生一个充满抗体的气泡。气泡直径应控制在20–50 µm范围内（图2F）。
4. 将空载玻片替换为已放置胚胎并覆盖油滴的载玻片。将注射针尖垂直对准胚胎的前后轴方向（图2D、G）。
5. 检查胚胎发育阶段，确保大多数胚胎已启动细胞化但尚未开始原肠胚形成（第4和第5阶段），仍处于合胞体状态（图2F、G）。
   注：此阶段的典型特征是无任何沟槽或褶皱，且在胚胎中央可见一个椭圆形、深色的卵黄囊。在油滴下对胚胎阶段进行形态学鉴定的依据来自Volker Hartenstein所著章节"Stages of Drosophila Embryogenesis"¹⁷。
6. 使用X-Y轴载物台操纵器将胚胎移向针尖，直至针尖到达卵黄中心。脉冲注射2至3次，将抗体注入卵黄。成功注射的标志是随着抗体溶液进入胚胎体积增加，卵黄膜皱褶迅速消失（图2G）。
7. 注射完成后，使用X-Y轴载物台操纵器将胚胎移离针尖，并向下移动至下一个胚胎。重复步骤6，直至载玻片上所有胚胎均完成注射。
8. 将注射后的胚胎载玻片转移至湿度培养箱（图2A-8），在25 °C条件下孵育，直至达到所需的胚胎发育阶段。
9. 将24 mm × 50 mm的盖玻片从载玻片上取下，直接放入显微镜的玻片架中。无胚胎的一面朝向物镜。先在明场照明下使用低倍物镜定位胚胎，然后切换至40x或63x物镜进行高分辨率荧光活体成像。

结果

为了展示抗体注射方法相较于基于荧光标记的活体成像或免疫荧光技术的优势，本文提供了两个案例研究，用于表征低丰度跨膜受体 Notch 以及一种称为酪氨酸磷酸化的翻译后修饰在活体胚胎中的动态定位。

Notch 信号通路活性在胚胎发育及成体器官稳态过程中对细胞命运决定起着重要作用^18,19。当 Notch 跨膜受体被其配体 Delta/Jagged 激活后²⁰，其胞内结构域被剪切并释放至细胞核中²¹，从而启动下游转录程序以驱动细胞命运的转变²²。目前，通过免疫荧光技术已在多聚甲醛固定的组织中对 Notch 受体的静态定位进行了充分表征。然而，由于缺乏一种能够以高速度对这种相对低丰度蛋白进行活体成像的方法，Notch 在配体结合或胞内剪切过程中的动态定位仍知之甚少²³。在此，我们将 AlexaFluor 标记的 GFP 纳米抗体注射到在内源位点表达 GFP 标签 Notch 的胚胎中²⁰。在未注射的情况下，Notch-GFP 在标准活体成像条件下几乎无法检测，且在延时成像过程中荧光信号迅速漂白。注射后，Notch 受体的信噪比显著提高，成像质量可与免疫荧光相媲美（图 3A）。此外，抗体注射使得可在 45 秒的时间间隔内对 Notch 定位进行时间分辨分析，在 5 分钟的成像窗口内未观察到信号强度的明显衰减（图 3B）。

酪氨酸磷酸化是一种主要的蛋白质翻译后修饰类型，在许多生物通路中介导信号转导²⁴。目前已开发出针对磷酸化酪氨酸（p-Tyr）的高度特异性单克隆抗体（如 PY20 和 4G10），可用于通过免疫荧光和蛋白质印迹技术来表征酪氨酸磷酸化的定位和总体水平²⁵。由于缺乏可实时追踪磷酸化动态变化的荧光标记方法，因此需要在不同时间点对组织或细胞进行固定染色，或裂解后进行印迹分析，以获得随时间变化的磷酸化状态快照，从而研究信号激活后酪氨酸磷酸化的动力学过程²⁶（例如生长因子处理）。该方法的时间间隔至少为数分钟，且由于固定或细胞裂解等操作所需时间存在差异， inherently 不够精确。

本文提供的证据表明，抗体注射方法能够直接可视化活体胚胎中的磷酸化状态，并以秒级时间间隔定期追踪酪氨酸磷酸化的定位与强度变化。将AlexaFluor标记的PY20抗体注入表达GFP标记肌球蛋白轻链的胚胎中，并以45秒间隔进行双色活体成像。正如先前研究所示，酪氨酸磷酸化在三细胞连接处高度富集²⁷，该模式亦可通过免疫荧光重现（图4A）。有趣的是，活体成像还揭示了一类新的、位于顶膜中央下方的第二群p-Tyr信号，而此类信号在免疫荧光中无法观察到（图4B）。通过双色成像发现，这群p-Tyr信号与中域肌球蛋白（medial myosin）位置相近（图4B，局部放大图），而中域肌球蛋白是肌球蛋白的一个亚群²⁸，同样仅在活体成像条件下明显，而在免疫荧光中几乎无法检测。此外，p-Tyr的中域亚群表现出与中域肌球蛋白相似的脉冲式聚集与消散模式（图4C），该现象此前已在中域肌球蛋白中报道²⁸。目前，p-Tyr中域亚群的身份与功能仍不明确。综上所述，这些结果表明，抗体注射方法可极大地补充传统手段，用于表征低丰度蛋白的行为，并揭示可能在免疫荧光处理过程中被破坏的新型定位模式。

图1：抗体注射操作流程。 示意图展示了抗体注射方法所涉及的各个步骤。从胚胎收集到完成抗体注射的整个过程通常需要约4–5小时。抗体注射后，可将胚胎置于湿度控制的培养环境中，孵育至所需发育阶段，再进行活体成像。AEL，产卵后；RT，室温；Ab，抗体。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：胚胎排列与注射。（A）注射前所需物品的概览，包括盖玻片、玻璃载玻片、干燥箱、毛笔、镊子、细胞筛、湿度室和琼脂糖凝胶。（B）将排列好的胚胎通过庚烷胶粘附在盖玻片中央，并置于干燥珠上方。（C）胚胎的头尾轴与琼脂糖凝胶边缘平行排列。（D）注射装置的总体布局。（E）干燥处理前后胚胎形态的比较，重点关注干燥后卵黄膜皱褶的变化。（F）皮升泵单次按压后注射气泡的大小。（G）抗体注射前后胚胎形态的比较，突出显示注射后膜皱褶的消失。（E-G）均使用明场显微镜在10倍物镜下拍摄。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：早期胚胎中 Notch 受体的活体成像。（A）通过免疫荧光（左）、基于 GFP 自发荧光的直接活体成像（中）以及注射 AlexaFluor 594 标记的 GFP 纳米抗体（右）对内源性 GFP 标记的 Notch 受体进行定位。（B）抗体注射后每隔 45 秒成像的 Notch-GFP 动态定位。所有图像均以胚胎前端在左、腹侧朝下方向采集。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：胚胎中磷酸化酪氨酸模式的活体成像。（A）通过免疫荧光检测固定胚胎中磷酸化酪氨酸（p-Tyr）的定位。（B）表达GFP标记的肌球蛋白轻链（绿色）的活胚胎中p-Tyr（品红色）的定位。白色虚线框表示顶膜下方磷酸化酪氨酸与肌球蛋白在中间区域的放大视图。比例尺 = 10 µm。（C）在活胚胎中每45秒成像一次p-Tyr和GFP-肌球蛋白。白色箭头指示p-Tyr和肌球蛋白的中间区域。所有图像均以胚胎的前端在左侧、腹侧朝下拍摄。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案介绍了使用定制抗体对早期Drosophila胚胎进行荧光标记并随后显微注射的专门方法。该技术可实现对含量较低、通常难以通过传统的GFP/mCherry标记方法观察的蛋白质或翻译后修饰的实时可视化。

将该方法用于野生型与突变体胚胎之间的定量比较时应谨慎。尽管在免疫荧光实验中，对照组与实验组的一抗和二抗浓度可以保持一致，但注射到胚胎中的抗体总量以及标记效率可能在不同胚胎之间存在差异。因此，定量分析应仅限于追踪同一胚胎中荧光强度随时间的变化，或在多色活体成像时对同一胚胎内其他通道信号进行相关性分析。例如，可利用磷酸化酪氨酸（p-Tyr）与肌球蛋白的荧光强度进行共定位和相关性分析²⁷，但不能通过抗体注射法直接比较野生型与基因X敲低胚胎之间的p-Tyr信号强度。

与其它基于荧光标记的蛋白动态研究方法类似，抗体结合可能会改变目标蛋白的活性、转运或定位。因此，相较于多克隆抗体，更推荐使用单克隆抗体或纳米抗体进行注射。由于单克隆抗体或纳米抗体的表位定义明确，可通过AlphaFold结构建模来预测利用抗体阻断这些表位是否会影响蛋白活性^12,25。相反，多克隆抗体的表位并不精确，若其结合阻断了目标蛋白的催化位点或信号肽，则可能潜在地改变蛋白的定位或活性。其次，抗体可能识别非目标蛋白的非特异性表位，尤其考虑到本方法中不存在类似免疫荧光中的"洗脱"步骤，无法去除亲和力较低的非特异性结合。因此，设置对照组至关重要，例如将抗体注射至缺乏该表位的细胞中，以验证所观察到的信号是否真实反映目标蛋白，还是来源于其他非特异性表位。

注射抗体在实验设置上与注射siRNA或CRISPR gRNA并无区别。因此，大多数适用于显微注射的细胞系统也应兼容抗体注射方法。在黑腹果蝇（Drosophila）胚胎中，Alexa Fluor标记的抗体在发育过程中保持稳定，荧光信号可在胚胎发育数小时后仍可检测。对于其他系统，如非洲爪蟾（Xenopus）或斑马鱼（Zebrafish）胚胎，应通过系列稀释实验性地测试抗体的浓度和注射体积，以获得理想的标记效率。此外，其他荧光染料（如ATTO¹⁰）可能提供更高的信噪比和水溶性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 抗体标记试剂盒	Invitrogen	该套件包括步骤 1.6 中的	A20185
生物显微镜	SOPTOP	EX20	目镜：PL 10X/20。物镜：10x/0.25
漂白	Clorox®
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	TW100F-4
离心	Eppendorf	5245
细胞过滤器	FALCON	352350
干燥室	锁&LOCK	HSM8200	320ml
解剖显微镜	Mshot	MZ62	目镜：WF10X/22mm。
双面胶带	Scotch	665
精细超级镊子	VETUS	ST-14
Fisherbrand™盖玻片：矩形	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™超级霜™Plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	12-550-15
镊子	VETUS	33A-SA
卤烃油 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
卤烃油 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
庚烷	Sigma-Aldrich	H2198-1L	庚烷胶由浸入庚烷
中的双面胶带制成脱水试剂	TOKAI	1-7315-01	填充至干燥室的 90% 体积
手动显微作器	World Precision Instruments	M3301R
微量移液器拉拔器	World Precision Instruments	PUL-1000	<强>程序：步骤 1，热量：290，力：300，距离：1.00，延迟：50. 步骤 2，热量：290，力：300，距离：2.21，延迟：50
气动 picopump	World Precision Instruments	PV 830	喷射：20 psi; 范围：100 毫秒;持续时间：定时
PY20	圣克鲁斯	SC-508
方形培养皿	Biosharp	BS-100-SD
GFP 纳米抗体	Chromotek	gt