早期阶段叶绿素生物合成动力学的无创检测方法 拟南芥 去黄化

摘要

本文介绍了一种先进的工具，用于监测拟南芥（Arabidopsis）幼苗去黄化早期阶段的叶绿素生物合成过程。该新方法可实现高空间和时间分辨率的非侵入式实时叶绿素荧光成像。

摘要

叶绿素生物合成是植物去黄化过程的标志性事件，而去黄化是植物生命周期中最显著的阶段之一。在开花植物从黑暗转入光照条件时，会触发叶绿素生物合成这一严格调控且高度动态的过程。当黄化的幼苗首次接触到阳光的瞬间，原叶绿素酸酯会在独特的光受体蛋白复合物介导下，在数秒内迅速转化为叶绿素酸酯，并通过后续一系列代谢步骤，最终生成具有完整功能的叶绿素。传统的叶绿素含量分析技术通常依赖于从离体植物组织中提取色素，这种方法不适用于研究如此快速的生理过程。为了在光照诱导去黄化后的最初几小时内，以高精度和高时空分辨率在活体（in vivo）条件下研究叶绿素的动态变化，研究人员开发了一种专用仪器和相应实验方案。本文介绍了一种针对拟南芥（Arabidopsis）去黄化早期阶段叶绿素进行统计学上可靠定量的详细实验流程。

引言

去黄化是植物生命周期中最显著的阶段，其特征是发生一系列形态学变化以及植物代谢的彻底重组（从异养转变为自养）¹。叶绿素的生物合成是植物光诱导去黄化的标志性过程，也是一个高度动态的过程。由黑暗条件下积累的前体原叶绿素酯转化为叶绿素必须受到严密协调，以避免因活性副产物造成损伤²。原叶绿素酯还原为叶绿素酯的过程由光依赖型原叶绿素氧化还原酶（PORs）催化，这类酶是可直接被光激活的独特酶类。该反应速度极快，可在毫秒至秒级完成³，在黄化幼苗接受光照后数分钟内即可观察到明显的叶绿素积累^4,5,6。而叶绿体的生物发生则需要更长时间（从数小时到数天），才能建立起功能完整的光合作用系统³。

目前存在多种分析叶绿素含量的方法，包括高效液相色谱法（HPLC）或分光光度法。通常，这些技术需要破坏植物组织^4,5,6，从而限制了对叶绿素水平随时间变化的连续测定。能够实现非侵入性叶绿素动力学检测的方法，可能为植物研究开辟全新的视角，涵盖从基础科学问题（例如，时空维度下叶绿素合成过程的分析）到更实际的应用（例如，评估植物胁迫耐受性或生物刺激剂对叶绿素动力学的影响）等多个方面。基于此，我们开发了一套用于监测叶绿素形成的系统——iReenCAM⁷。该系统包含一个CCD相机、发射滤光片、光源以及自动化荧光分析流程（图1）。该设备的主要特点是具备高空间和时间分辨率，在当前常用方法所采用的参数方面表现更优，并且与标准分析方法相比，具有足够的灵敏度和特异性⁷。

此处描述的非侵入性操作步骤简单，所需试剂极少，可在活体植物中获取叶绿素动力学曲线 拟南芥 幼苗在去黄化过程的极早期阶段。该方案可用于研究受多种内外因素影响的、高度动态的叶绿素合成过程，其中外源因素包括盐胁迫、干旱、生物刺激素、重金属等，内源因素通常与基因活性变化相关，且无需分离任何植物组织，从而避免了额外的胁迫。

方案

1. 培养基制备

1. 在玻璃瓶中将0.75 g凝固剂与50 mL无菌去离子水混合，配制培养基，使终浓度为1.5%（w/v），适用于一个培养皿（120 x 120 x 17 mm）。轻轻摇动混合物，然后在微波炉中加热至沸腾，以溶解凝固剂（溶液变为澄清）。
2. 将培养基冷却至58–60 °C后再进行后续操作。所有后续步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行，以防止污染。
3. 使用具有避光边缘的培养皿，以避免在测量过程中产生过强的激发光反射和高背景自发荧光。为此，可用黑色胶带（或其他可用材料）覆盖空培养皿的所有侧面（图2）。
4. 贴好胶带后，用杀菌紫外灯照射20–30分钟，对培养皿进行灭菌。
5. 若实验涉及化学处理（例如非生物/生物胁迫因子、植物激素和/或生长调节剂等），需将相应化学物质的适量添加至培养基中。注意所选化学物质在加入培养基后的稳定性（例如，若该物质不耐热，则应在培养基冷却至接近倒入培养皿前的温度时加入）。通过振荡充分混匀培养基，确保化学物质均匀分布。
6. 培养基倒入培养皿后应避免暴露于紫外光下（否则会导致氧自由基产生，可能干扰实验结果）。
7. 将配制好的培养基倒入方形培养皿中，并在室温下静置使其凝固。

2. 种子表面灭菌与植物生长条件

1. 从库存中取出所需量的 Arabidopsis thaliana Col-0 种子（10–20 mg），加入一个 2 mL 微量离心管中。
   注意：在使用不同的 Arabidopsis 品系（生态型/突变体品系）时，无需进行特定修改。若用于其他植物物种，应根据种子大小、萌发率和幼苗大小的差异，对播种网格和测量步骤进行调整。
2. 向管中加入 70% 乙醇，对 Arabidopsis 种子进行表面灭菌，持续 2 分钟。灭菌期间轻轻振荡离心管。
3. 小心用移液器吸除乙醇，注意不要丢失任何种子。向管中加入无菌水清洗 5 分钟，以去除残留的乙醇（清洗期间轻轻振荡离心管）。
4. 让种子依靠重力沉降至管底，然后吸除剩余的水。
5. 按照步骤 3 的方法，再次用无菌水冲洗种子 2 次，以确保完全去除乙醇残留。让种子依靠重力沉降至管底，吸除剩余的水。
6. 向含有种子的管中加入等体积的无菌水，制成种子-水悬浮液。
7. 使用播种网格将特定基因型的种子-水悬浮液均匀地分配到培养基平板的指定区域（图 2 和 补充图 1）。使用宽口移液器吸头，在每个区域内沿直线均匀分布种子（约 30–40 粒）。
8. 将平板在超净工作台中敞开放置约 30 分钟，使种子区域的水分自然干燥，以防止污染。用微孔胶带密封平板，并用铝箔包裹。
9. 将种子在 4 °C 黑暗条件下进行 3 天的层积处理，以解除种子休眠（根据所用生态型而定）并促进萌发的一致性。
10. 将经过层积处理的平板转移至白光（150 µmol/m²/s）下照射 1 小时，以诱导萌发（仅在光照处理期间打开铝箔）。
11. 光照处理后，重新用铝箔包裹平板，以避免种子见光，并将平板垂直放置于培养室中，在 21 ˚C 黑暗条件下培养 4 天。

3. 叶绿素荧光测量与分析

1. 启动 iReenCAM 系统，并确保系统已准备就绪，且在自动启动的 PS 服务器软件中正确配置（例如，实验数据是否有足够的存储空间，荧光相机是否已连接至计算机等）。
2. 点击 实验 > 新建实验，启动调度器软件以创建测量实验计划。为实验提供一个描述性名称，并填写详细信息（描述）。
3. 点击 添加操作，设置实验所需的各项操作，从而生成实验操作的时间表。
   注意：此处“操作”一词指执行一次完整的实验（即包含进行一次培养板测量所需的所有步骤）。
4. 设定单次测量循环的条件（即光照/黑暗周期的持续时间）。
5. 点击 生成列表，定义各测量循环之间的时间间隔。选择每次循环的开始和结束时间（总共 4 小时），以及循环之间的间隔时间（在当前设置中，每 2 分钟进行一次循环）。
6. 点击 生成，并通过检查屏幕左侧生成的列表，确认光脉冲之间的时间范围和间隔是否正确。
7. 选择测量方案（补充图 2）。将所有修改保存至数据库，以供将来参考。
8. 在测量开始前，于暗室中使用低强度绿光（见材料表），调节测量室内部搁板的高度，或在移除培养皿上的铝箔之前完成其他准备工作。随后关闭光源，并在完全黑暗的条件下将培养皿转移至测量室中。
9. 小心移除覆盖在含有 4 日龄幼苗的培养皿上的铝箔。将培养皿水平放置于仪器测量室内部。在测量室内施加作用光脉冲，并根据步骤 3.1–3.7 中设定的实验计划（操作）进行成像。
   注意：在将黄化幼苗的培养皿放入测量室之前，必须避免任何光照。对含有黄化幼苗的培养皿的所有操作均必须在暗室/暗箱中进行（可能的实验装置参见补充图 3）。

4. 数据提取与分析

1. 测量完成后，在分析软件中打开相应的实验。
2. 为分析幼苗的荧光，需生成两种掩膜：一种为覆盖幼苗所在区域的粗略（托盘）掩膜，另一种为仅覆盖目标组织（通常为子叶）的精确（植株）掩膜。
3. 通过点击生成托盘掩膜 创建新托盘类型 选项。将相应的基因型名称分配到平板图像上的对应区域。
4. 为分配基因型，请选择一个图像编号 圆形 然后点击 加载图像 屏幕上方。培养皿的图像将显示在屏幕上。通过点击代表不同形状的绘图工具按钮组中的任意一个补充图4），输入 新形状模式 可在平板图像上绘制目标区域。选择所需的区域（例如，平板上的不同基因型），并为其提供适当的命名。
5. 点击 退出 退出形状模式。单击以保存生成的托盘掩膜（需为其提供名称）。 储存托盘类型.
6. 返回上一步，通过从先前步骤中选择生成的掩膜名称来应用该掩膜 按托盘类型变化 选项
7. 为了高精度生成植物掩膜，使用测量开始后180分钟（第91轮）获取的图像来设定荧光信号强度的最小阈值，以实现背景噪声的扣除。为此，取消勾选 自动阈值 并设置一个 手动阈值 在 0（补充图4).
8. 点击 预览 确保托盘掩膜覆盖平板图像上的所有必要区域（基因型）。为此，请选择第91轮并点击 刷新预览.
9. 点击进入运行菜单 运行仅勾选第91轮，专门针对第91轮运行分析。然后选择输出路径并点击 开始分析.
10. 分析完成后，完成菜单将自动打开。从实验中选择已执行的轮次（将仅显示一个），然后单击 切换分析器至已分析数据 导出此特定时间点（第91轮）的数据。
11. 从导出的压缩包中提取 .xsel 文件，该文件包含关键的植物掩膜信息，方法是单击 开放导出部分 图标。
12. 通过点击重新打开实验 开放局部分析部分 图标。输入 掩膜生成器 再次点击菜单 加载图像，选择第一轮，然后 从文件加载 在屏幕右上角单击并加载先前提取的 .xsel 文件。将显示应用了托盘掩膜的平板图像。
13. 单击以保存掩膜 储存盘类型 并将其名称选中以应用 按托盘类型变更 选项
14. 通过调整荧光信号强度阈值生成植物掩膜。增加该值的数值 手动阈值 直到生成的掩膜在 预览 菜单与每种基因型的 ROI（例如子叶）完美匹配补充图4）。通过滚动查看所有轮次，检查掩膜是否适用于全部测量轮次（检查第1、61和121轮的掩膜位置是否正确即可）。 预览 菜单
15. 对所有测量轮次进行分析并导出数据。
    注意：输出文件包含给定基因型在每个时间点的叶绿素荧光值，可用于绘制所需图表，并便于进一步的统计分析。

结果

使用新开发的程序在4天龄去黄化幼苗中获得的典型结果 拟南芥 野生型（WT）、生态型Columbia-0（Col-0）的幼苗如图所示 图3在对照条件（添加DMSO的MS培养基）下，叶绿素生物合成曲线表现为叶绿素合成的初始爆发阶段，这是因为在暗形态建成生长阶段合成的原叶绿素酯池在光照诱导的PORs作用下迅速转化为叶绿素^7,8,9快速叶绿素积累的初始阶段大约持续10分钟，随后进入一个滞后期，此时暗合成的原叶绿素酸酯达到最低值（约在光照后30分钟；原叶绿素酸酯的HPLC测定曲线见⁷。在滞后期，叶绿素生物合成基因被上调¹⁰，导致原叶绿素酸酯的光诱导生成。新合成的原叶绿素酸酯迅速转化为叶绿素，表现为指数相（在野生型Col-0中，约在光照后120分钟开始），随后在去黄化幼苗光照约4小时后进入另一...

讨论

实验方案的关键步骤与故障排除——避免光照并妥善保护遮光板
如上文实验方案描述中所强调的，在黄化幼苗培养期间或实验开始前，即使极微量的光照也必须严格避免，这一点至关重要¹¹。在我们的实验设置中，使用一个专用的暗室，该暗室位于步入式植物生长室（phytotron）内，并通过密闭旋转门与生长室其他区域完全隔光（补充图3）。该暗室配备有植物培养空间和工作台，可同时容纳实验装置、控制用计算机以及通风橱。这一设置使我们能够在完全黑暗条件下培养植物，并在无需转移培养板的情况下直接开始测量。

植物培养方式及掩膜生成方法对于后续通过本实验方案进行叶绿素荧光信号的定量至关重要。应避免培养基中出现凝胶剂团块或微小的可见杂质/灰尘，因为这些物质可能导致光线反射。由于软件对叶绿素荧光的识别受限于掩膜范围，未被掩膜覆盖的植物区域将不会被软件分析。在4小时的测量过程中，幼苗会略有生长或移动，因此预设的掩膜可能需要调整，否则无法在整个测量过程中保持贴合，从而影响信号强度定量的准确性。根据...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-苄氨基嘌呤	Duchefa Biochemie	B0904.0001
铝箔	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 种子	NASC 菌种库	N1092
培养室	PSI		定制
二甲基亚砜	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf 单通道可调移液器（100–1000 μL）	Merck	EP3123000063
琼脂糖（Gelrite）	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM 装置	PSI		定制/原型
实验室瓶（Duran），带盖，100 mL	Merck	Z305170-10EA
层流洁净工作台	UniGreenScheme	ITEM-31156
无衬橡胶接头胶带，19 mm 宽，黑色，Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
微量离心管，2 mL 带盖，PPT 材质，BRAND	Merck	BR780546-500EA
微孔胶带	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
培养皿 — Greiner 方形培养皿，120 × 120 × 17 mm，带通风孔	Merck	Z617679-240EA
移液器吸头，1000 μL，Axygen	Merck	AXYT1000B
Plant Screen 数据分析软件	PSI		作为 iReenCAM 的一部分提供