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超高效液相色谱-质谱联用及自建数据库分析中药成分

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DOI：

10.3791/66091

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2023年11月3日

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1Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Chongqing Key Laboratory of Integrative Dermatology Research, Key Laboratory of External Therapies of Traditional Chinese Medicine in Eczema, Department of Dermatology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, 2General Surgery, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍了一种通用的实验方案和系统化设计方法，可用于分离和鉴定中草药高山蓍草Achillea millefolium L.中的复杂成分。

摘要

中药成分复杂，含有大量未知化合物，因此定性研究至关重要。超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS）是目前化合物定性分析中最广泛使用的方法。该方法包括样品前处理、质谱调谐、质谱采集和数据处理等标准化和程序化操作步骤。样品前处理步骤包括采集、粉碎、溶剂提取、超声处理、离心和过滤。数据后处理部分进行了详细描述，包括数据导入、自建数据库构建、方法建立、数据处理及其他人工操作。高山艾草（Achillea millefolium L.）的地上部分可用于治疗炎症、胃肠道功能紊乱和疼痛，其含有的3-氧杂-愈创内酯类化合物可能为抗炎药物研发提供重要先导化合物。本研究结合飞行时间质谱（TOF-MS）与自建数据库，鉴定了AML中的三种代表性化合物。此外，还讨论了与现有文献的差异、液相参数优化、扫描模式选择、离子源适用性、碰撞能量调整、异构体筛选、方法局限性及可能的解决方案。该标准化分析方法具有普适性，可广泛应用于中药中复杂化合物的鉴定。

引言

中药积累了世界上最丰富的经验性知识1。对中药中化学成分的定性分析已成为研究中的关键课题2。由于中药类别复杂且来源多样，区分其中的化学差异十分困难3。中药中的主要化合物类型包括生物碱、皂苷、黄酮类、蒽醌类、萜类、香豆素、木脂素、多糖、多肽和蛋白质1。然而，化合物的分离以及异构体的鉴定阻碍了中药定性研究的发展。

超高效液相色谱（UPLC）与合适的色谱柱相结合，为中药中复杂化合物的分离提供了有力支持4。近年来，高分辨质谱技术在中药定性分析中日益普及。常用的高分辨质谱方法包括四极杆飞行时间质谱（Q-TOF-MS）5、轨道阱质谱（Orbitrap-MS）6和傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR-MS）7。FT-ICR-MS 具有最高的分辨率，但运行和维护成本较高8。Orbitrap-MS 在检测小分子化合物方面具有优势，尤其适用于分子量低于 500 Da 的化合物9。Q-TOF-MS 是血清药物化学定性分析中最广泛使用的方法10,11。与传统的网络数据库或商业数据库相比，结合自建数据库进行数据处理的联合分析方法正变得越来越流行。

高山蓍草（Achillea millefolium L.，AML）是一种主要生长于中国新疆、内蒙古及东北地区的中草药12。AML的地上部分广泛用于治疗炎症、胃肠道功能紊乱以及疼痛，包括风湿痛、牙痛和胃痛13。AML中的3-氧杂-愈创木内酯类成分在抗炎药物研发中具有良好的先导化合物潜力14。目前对AML化学成分的研究主要集中在倍半萜、单萜、黄酮类及酚类化合物15。然而，针对AML中化合物的鉴定，尚无适用于其他中草药的系统性定性归纳方法。本研究旨在结合Q-TOF-MS与自建数据库分析，为中草药化学成分的标准化鉴定提供方法支持。

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方案

1. 样品预处理

  1. 中药材高山艾叶（AML）的采集
    1. 于2月将高山艾草（Achillea millefolium L.，AML）种子播种入土，同年7月采集AML的地上部分（图1A）。
      注：本文所用AML采自中国四川省绵阳市海拔400米的山区。
  2. 干燥处理
    1. 用纯水清洗所有采集的AML，以去除泥沙和杂质。将AML置于50 °C烘箱中干燥24小时（图1B）。
  3. 粉末制备
    1. 干燥后，使用高速多功能粉碎机将AML粉碎成粗粉，并过50目筛（图1C）。
  4. 溶剂提取
    1. 准确称取1 g AML样品，置于锥形瓶中，加入30 mL 75%乙醇水溶液（图2A）。
    2. 在25 °C条件下，将混合物置于超声波清洗仪中提取30分钟（图2B）。
    3. 以14,000 × g 离心5分钟（图2C）。
    4. 将注射器安装微孔滤膜（0.22 μm，仅适用于有机相），过滤上清液至2 mL样品瓶中（图2D）。

2. 质谱调谐

  1. 启动液相色谱-质谱（LC-MS）控制软件（图3A）。打开质谱调谐模块，对1 ng/µL的亮氨酸脑啡肽（LE）溶液进行两次冲洗。
  2. 在 LockSpray 流速控制 面板中，设置 50 μL/min 的流速，然后点击 Flow 按钮，使LE溶液进入质谱仪（图3B）。
  3. 点击 LockSpray Source Setup 按钮，完成正离子模式下的质谱调谐（图3C）。点击 negative icon 切换至负离子模式，再次点击 LockSpray Source Setup 按钮，完成负离子模式下的质谱调谐。

3. 质谱采集

  1. 设置一个序列表格，包括文件名、质谱方法、进样文件、样品瓶和进样体积。点击保存按钮以记录序列表格。
  2. 依次点击运行按钮和开始按钮（图3D）。选择仅采集样品数据选项，然后点击确定按钮以开始数据采集。
  3. 点击色谱图按钮以打开实时总离子流色谱图（TIC）窗口（图3E）。依次点击显示按钮和TIC按钮。选择BPI色谱图选项，然后点击确定按钮以显示基峰离子流色谱图（BPI）窗口（图3F）。

4. 数据处理

  1. 启动数据分析软件。
  2. 依次点击 我的工作 按钮和 导入 MassLynx 数据 按钮，进入子窗口（图 4A）。选择原始数据文件并输入样品集名称，然后点击 创建 UNIFI 样品集 按钮，以导入质谱的原始数据。
    注意：请确保正离子和负离子模式的原始数据分别导入。
  3. 数据库建立
    1. 在初始窗口中点击 管理 按钮（图 4B），然后点击 导入库项目 按钮。选择一个 .xlsx 格式的数据库模板文件，并确保同一文件夹中包含所有以独立 .mol 格式保存的化合物结构文件。
    2. 为数据库输入名称。点击 验证 按钮，确认所有化合物均已正确显示，然后点击 导入 按钮，完成自建数据库的构建。
      ​注意：所有需导入数据库的独立 .mol 格式化合物文件均依据文献资料准备，化合物结构图使用绘图软件自行绘制。
  4. 点击 创建分析方法 按钮，打开子窗口，然后点击 仅生成处理方法 按钮，建立数据处理方法。
  5. 数据分析
    1. 点击 创建分析 按钮，打开子窗口。
    2. 点击 基于已有数据创建分析 按钮，然后选择已导入的数据和已建立的方法。
    3. 点击 处理 按钮，开始长时间的数据计算（图 4D）。
    4. 点击 查看 按钮，切换至总离子流图（TIC）窗口。
    5. 点击 选择色谱峰 按钮，并选择 TOF MSE BPI。点击 全部替换 按钮，以查看基峰离子流图（BPI）。
  6. 右键点击并选择 添加列 选项 | 显示化合物信息，包括 化合物名称、理论质量、实测 m/z、质量误差、实测保留时间（RT）、检测器计数、响应值、加合物、替代性归属 和 发现的碎片总数（图 4E）。
  7. 选择 高能量碎片 选项，以显示所选化合物的二级质谱碎片（图 4F）。
  8. 根据每个二级碎片手动绘制分子断裂路径（图 4G）。
    注意：代表性结果部分对示例进行了详细描述。

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结果

高山艾草被用作展示代表性结果的模型。如图4G所示，m/z = 463.08935的槲皮素-3'-O-葡萄糖苷在水解反应过程中失去一个己糖分子，转化为m/z = 300.02828的中间产物。在另一条途径中，黄酮类结构骨架中的C-C键断裂，导致生成m/z = 223.06232的中间产物，其中己糖单元的羟甲基及相邻羟基消失。此外，己糖骨架的裂解产生了一个m/z = 71.01498的中间产物。对于酚酸类物质，m/z = 515.11923的3,5-二咖啡酰奎宁酸可通过水解反应失去C9H6O3或C18H12O7基团，分别形成m/z = 353.08783或m/z = 173.04579的中间产物（图4H）。对于黄酮类化合物，木犀草素可通过C-O-C和C-C键的断裂转化为m/z = 133.03002的中间产物（图4I）。

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讨论

高分辨质谱结合自建数据库为中药化学成分的系统性定性分析提供了一种有效的技术手段。与包含常见中药成分的商业数据库不同，利用文献报道化合物构建的自建数据库在分析稀有或民族药物时具有更高的准确性16。类似方法已应用于其他研究领域，包括成品药物17、染料18和塑料包装材料19。与常用的商业数据库匹配方法相比，该方法在识别非常规中药成分方面的能力显著提升。所鉴定的三种化合物与已有文献报道一致，但我们将提供更多关于二级碎片离子及其裂解规律的信息。

在飞行时间质谱（TOF-MS）中，负离子模式适用于大多数类型化合物的鉴定，例如黄酮类和蒽醌类化合物。在负离子模式下，质谱检测到的带电离子是失去一个质子或加合甲酸根离子的化合物。生物碱适合在正离子模式下检测，通过失去电子形成正电荷，而多糖则更倾向于在正离子模式下与质子或钠离子结合后出现。在本实验中，采用电喷雾电离质谱源对极性和中等极性化合物进行靶向检测。对于弱极性...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由中国博士后科学基金（2022MD713780）、中医治疗免疫性疾病传承与创新团队、重庆市医学科研项目（重庆市卫生健康委员会与科学技术局联合项目）（2022DBXM007）以及重庆市自然科学基金（cstc2018jcyjAX0370）资助。重庆市科研机构绩效激励引导专项项目（cstc2022jxjl120005，cstc2021jxjl130021）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯仿Sinopharm Chemical Reagent Co., LtdCAS 67-66-3
乙酸乙酯Chuandong ChemicalCAS 141-78-6
液相色谱仪WatersACQUITY Class 1 plus
MassLynxWatersV4.2质谱控制软件
甲醇Chuandong ChemicalCAS 67-56-1
正丁醇Chuandong ChemicalCAS 71-36-3
石油醚Chuandong ChemicalCAS 8032-32-4
四极杆飞行时间质谱WatersSYNAPT XS
UNIFIWaters数据分析软件

参考文献

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