一种在显微镜辅助下建立用于分阶段肝切除术的肝脏联合分割和门静脉结扎小鼠模型

摘要

联合肝脏分割和门静脉结扎分阶段肝切除术（ALPPS）已被证实可在第一阶段手术后数周内显著促进肝脏再生。已建立接受ALPPS的动物模型，以探索肝脏再生潜力并获得理想的临床效果。

摘要

肝切除术被广泛认为是治疗肝部恶性肿瘤的主要方法；然而，术后肝功能衰竭仍是围手术期死亡的主要原因，严重影响患者的预后。在肝功能良好的情况下，未来残余肝体积（FLR）必须超过25%；而在肝硬化患者中，这一要求则提高至40%以上。目前，未来残余肝体积不足是肝切除手术进展的主要障碍之一。

传统增强未来肝残余体积（FLR）增生的方法主要集中在门静脉栓塞术（PVE），但其效果受到显著限制。近年来，已有大量关于一种新型两阶段肝切除技术的报道，该技术结合肝脏分割与门静脉结扎，被称为联合肝脏分割和门静脉结扎分期肝切除术（ALPPS）。ALPPS在诱导FLR增生方面比PVE更有效且作用显著。然而，ALPPS促进肝再生的具体机制尚未完全阐明。因此，在动物模型中复制ALPPS手术对于深入研究肝再生的分子机制至关重要，可提供有价值的理论与实践依据。

引言

肝脏具有强大的再生潜力，在因各种肝部疾病进行切除手术后，仅需短短3个月内即可迅速增殖并恢复代谢功能¹。然而，为确保肿瘤切缘的完整性，往往不可避免地需要进行大范围肝切除。因此，保证足够的参与性肝组织体积，即未来肝残余（future liver remnant, FLR），显得至关重要²。在过去几十年中，ALPPS（联合肝脏离断和门静脉结扎的分阶段肝切除术）已成为肝胆外科领域的一项突破性技术，尤其适用于肿瘤切除后残余肝体积不足的患者，被誉为肝胆肿瘤外科领域最具前景的重大进展之一³。

在建立ALPPS动物模型方面已取得显著进展。理想的模型通常要求保留的肝叶具有独立的血液流入（门静脉和肝动脉）和流出（肝静脉），并且保留肝叶与拟切除肝叶之间有清晰的分界，以防止侧支循环的形成⁴。尽管ALPPS能够刺激残留肝组织快速再生，但这一过程的具体机制仍不明确。

目前，ALPPS 模型分为三种类型：大型动物模型（如猪和羊）、中型动物模型（如兔和啮齿类动物）以及小型动物模型（如小鼠）⁵。小鼠繁殖迅速且易于进行基因改造，因此在深入研究肝脏再生机制方面尤为有效⁶。此外，小鼠的肝脏结构，尤其是其肝中静脉，与人类高度相似，使其非常适用于 ALPPS 模型的建立。

需要注意的是，临床实践中大多数肝细胞癌患者均伴有基础肝病，这与研究中通常使用的健康肝模型不同⁷。因此，采用预先建立肝纤维化或病毒感染的小鼠模型，可更准确地模拟各类肝病患者在手术后的应答及术后肝再生过程⁸。该策略有助于发现具有临床意义的新的治疗靶点。

迄今为止，苏黎世大学和东京大学等一些知名研究团队已成功建立了小鼠ALPPS模型^9,10。在受控条件下建立标准化的小鼠模型，有助于加深我们对ALPPS术后观察到的肝脏快速再生现象的理解。

方案

本方案中的所有实验均经江西省人民医院兽医主管部门批准（编号 70/2022）。此外，所有实验步骤均严格遵守机构动物护理与使用委员会的规定。

1. 手术开始

注意：将体重为20–22 g的雄性C57BL/6小鼠饲养于通风良好的笼具中，维持在标准无病原体环境中，光照/黑暗周期为12 h/12 h。动物被提供 随意摄取 在22 ± 1 °C的受控环境温度下自由获取食物和水。手术在专用显微外科室内进行，使用手术显微镜（图1假手术组小鼠仅接受剖腹手术，但未对肝脏进行任何操作。PVL组小鼠部分门静脉分支被结扎，而ALPPS组在门静脉结扎（PVL）的基础上进一步横断中叶肝脏。

1. 将小鼠禁食 4–6 小时 作为术前准备。
   注意：必须进行禁食，因为进食会导致小鼠胃部膨胀，从而影响手术视野，并容易造成胃壁意外损伤。
2. 在侧边操作台上准备无菌外科器械，包括显微镊子、剪刀、腹腔牵开器以及预先制备好的 8-0 门静脉结扎缝线。将术中使用的无菌纱布和棉球浸泡于 37 °C 的生理盐水中。
3. 诱导麻醉时，先让动物暴露于 5% v/v 异氟烷 30 秒，随后以 3 vol% 异氟烷维持麻醉，直至达到深度麻醉状态。通过夹捏足趾反射来判断麻醉深度。在诱导阶段，皮下注射美托咪啶，剂量为 5 mg/kg。
4. 在动物眼睛上涂抹眼膏，并皮下注射 1 mL 乳酸林格氏液与 5% 葡萄糖的混合液，将剂量平均分配至下腹部两侧。
5. 使用小型动物专用电推剪仔细剃除腹部毛发，范围从剑突至生殖区域，两侧各延伸约 2 cm。
6. 用聚维酮碘和酒精交替消毒手术区域，共消毒 3 次 。
7. 使用手术刀在皮肤正中线处做一条 2.5–3.0 cm 长的切口，随后用手术剪小心地打开腹腔。
8. 使用腹腔牵开器扩大切口，借助无菌湿润棉签轻柔牵拉十二指肠及一段小肠。用预先准备好的无菌纱布覆盖这些结构，同时暴露门静脉的肝段。

2. 门静脉结扎术（PVL）

注意：整个操作过程中所有步骤均需轻柔。处理肝组织时应使用湿润的棉球。

1. 剥离腹膜和肠管，确保门静脉完全暴露。
2. 在暴露主门静脉的过程中，通过缓慢、有意识地向前推进并撑开的方式，逐步环绕其分支进行操作。
3. 按以下顺序依次辨认门静脉的各个分支：（1）右后支，（2）左外侧支与左中支的汇合支，（3）尾状叶支（图2A）。

3. 门静脉分支右后支的解剖

1. 经门静脉主干穿过肝门时，可见右后叶的一个显著分支。
2. 使用湿润的棉球作为填充物，分离肝脏中叶与右后叶，以避免可能的损伤。
3. 务必沿格利森囊（覆盖肝脏表面的腹膜）进行解剖，并牵引一根1.5 cm长的丝线，环绕门静脉分支进行结扎。
4. 使用8-0丝线结扎门静脉的右后支。门静脉结扎成功的可靠指标是肝脏出现明显的苍白。

4. 门静脉左外侧支和左内侧支的解剖

1. 左外叶（LLL）和左内叶（LML）的门静脉分支共用一条主门静脉。务必仔细解剖左外叶与尾状叶之间可能存在的间隙。
   注意：在此手术模型中，结扎左外叶和左内叶的门静脉分支最为困难，因为显微镊必须穿过门静脉周围的间隙，同时避免损伤肝脏。
2. 将显微镊从第4.1步创建的入口处插入，并缓慢移动手部操作，因为即使是最轻微的阻力，也可能提示显微镊接近了肝脏或血管。
3. 当感到阻力时，轻微调整显微镊方向，使其向前推进并穿过右内叶（RML）Glisson囊的表面（图3C）。
4. 使用预先准备好的8-0丝线，环绕左外叶和左内叶的门静脉分支进行结扎。结扎后，观察肝脏中叶出现明显的缺血分界线，同时左叶呈现苍白。

5. 门静脉分支的尾状叶支解剖

1. 分离尾状叶，并使用棉签填充主门静脉与尾状叶之间的潜在间隙。
2. 剥离尾状叶的腹膜，以显露该叶的门静脉分支。
3. 结扎门静脉尾状叶分支时应采用缝合贯穿法（Stitch-up suture），而非环绕结扎法（tie-around），确保缝针路径充分包绕门静脉的尾状叶分支。
   注意：门静脉尾状叶分支结扎的难点在于该分支被肝组织包绕，且位置紧邻主门静脉。建议缝针穿透深度为 1 mm。

6. 肝脏离断与胆囊切除术

1. 观察肝中叶的明显分界线，并沿此线进行切开（图2B）。
2. 使用电凝笔沿分界线预先切出一条0.5 mm的切口线。
3. 使用显微镊子和电凝笔切割肝组织，同时用棉签压迫止血。
   注意：切开过程中的难点在于掌握切割深度。目标是尽可能贴近下腔静脉将肝脏分开。术中出血较难避免，需通过反复练习掌握切开深度。可使用热灼、棉签压迫和明胶海绵辅助止血。
4. 最后切除胆囊，因其可在整个手术过程中提供良好的牵拉着力点。
5. 使用棉签施加可控压力以实现止血；若出血持续，提示下腔静脉已受损，缝合修复效果较差，应立即实施安乐死。

7. 手术的最后步骤

1. 关闭腹腔前，确保将小肠准确放置于腹腔内。
2. 使用6-0可吸收缝线牢固缝合腹膜和腹壁，皮肤则用4-0可吸收缝线缝合。
3. 再次对皮肤表面进行消毒，以确保最佳清洁度。
4. 在切口部位皮下注射1 mL生理盐水以及芬太尼0.02 mg/kg和美洛昔康4 mg/kg，以缓解术后疼痛并补充术中可能的液体丢失。
5. 将动物置于加温表面，以促进其自然苏醒，并监测其四肢的血液供应情况。随后将其单独饲养于笼中，继续观察直至完全恢复意识。
6. 动物恢复后，皮下注射美托咪啶，剂量为4 mg/kg，术后持续给药24小时。

8. 肝脏再生与肝功能的术中测量

1. 处死小鼠，并在术后第1、2、3和7天分别采集肝脏及血液样本。
2. 进行苏木精-伊红（HE）染色和肝功能检测，并检测血清炎症标志物，从而为模型构建的影响提供进一步验证。
3. 记录手术后1周内小鼠体重及未来残肝体积/体重（FLR/BW）比值的每日变化情况。

结果

与PVL（方案步骤2、3、4和5）相比，接受ALPPS（步骤2、3、4、5和6）手术干预的小鼠表现出更强的细胞增殖倾向。图2展示了门静脉结扎后肝脏中叶的缺血分界线，以及肝实质离断过程中的视野，这是ALPPS与PVL之间的一个关键区别。值得注意的是，肝组织中炎症介质的水平，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素和肝细胞生长因子（HGF），均高于PVL组。这一点在图4C中可见，ALPPS组的IL-6水平高于PVL组，提示炎症可能参与了肝脏的快速再生过程。为进一步证实这些发现，已对术后两天的肝体比以及肝组织中细胞增殖标志物ki67的表达水平进行了比较分析。图4A、B和图5显示，ALPPS组的肝脏表现出更强的增殖能力。

讨论

本研究介绍了一种在小鼠中实施ALPPS手术初始阶段的方案，包括门静脉部分结扎及肝脏中叶的分离。该方法高度模拟人类ALPPS手术过程，由于小鼠肝脏具有独特的叶段结构，并且中叶接受双重门静脉供血，从而确保术后形成明确的血流分布¹¹。值得注意的是，ALPPS手术包含两个独立的外科阶段。本研究仅展示第一阶段，即门静脉分支结扎与肝实质离断，记为PVL+T。需要特别说明的是，第二阶段（部分肝叶切除术）在本研究中并未实施。为保持描述的一致性，本文将ALPPS等同于PVL+T。尽管既往研究主要集中于大鼠模型，苏黎世大学团队曾首次报道针对小鼠的ALPPS特异性方案¹²，但目前仍缺乏标准化的小鼠操作流程。相较于大鼠，小鼠更易于进行遗传学操作，在肝再生研究方面具有更广泛的应用前景，因此建立小鼠特异性的ALPPS模型对于在临床相关条件下深入理解肝再生机制具有重要价值

本方案的关键步骤包括将ALPPS手术简化为门静脉结扎联合肝实质离断（PVL combined with T），并强调小鼠门静脉的解剖结构，以帮助初...

材料

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