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气孔响应的直接观察与自动测量 Pseudomonas syringae pv. 番茄 DC3000 在 拟南芥

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DOI：

10.3791/66112

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2024年2月9日

 ,  ,  , 
1Graduate School of Agriculture, Kyoto University, 2Institute of Transformative Bio-Molecules (WPI-ITbM), Nagoya University, 3Phytometrics Co., Ltd.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种简单的方法，用于直接观察和自动测量细菌侵染下拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔的响应。该方法利用一种便携式气孔成像设备，并结合专为该设备所拍摄叶片图像设计的图像分析流程。

摘要

气孔是存在于植物叶片表皮中的微小孔隙。气孔开度的调控不仅对平衡光合作用所需的二氧化碳吸收与蒸腾作用导致的水分流失至关重要，同时也可限制细菌侵入。当植物识别到微生物时会关闭气孔，但某些致病性细菌（如丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，简称 Pto））能够重新打开已关闭的气孔，从而进入叶片内部。在传统的评估气孔对细菌侵袭反应的实验中，通常将叶片表皮剥离物、叶圆片或离体叶片漂浮于细菌悬浮液中，随后在显微镜下观察气孔，并手动测量气孔开度。然而，这些方法操作繁琐，且可能无法真实反映植物在自然状态下叶片仍附着于植株时的气孔响应。最近，研究人员开发出一种便携式成像设备，可在不摘除叶片的情况下通过夹持叶片直接观察气孔，同时配套开发了基于深度学习的图像分析流程，可自动从设备拍摄的叶片图像中测量气孔开度。在此基础上，本文介绍了一种评估拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔对细菌侵袭响应的新方法。该方法包括三个简单步骤：模拟自然感染过程的Pto喷雾接种、利用便携式成像设备直接观察接种Pto后植株叶片上的气孔，以及通过图像分析流程自动测量气孔开度。该方法已成功用于展示在接近自然植物-细菌相互作用条件下，Pto侵入过程中气孔的关闭与重新开放现象。

引言

气孔是位于植物叶片及其他地上部分表面、由一对保卫细胞包围的微小孔隙。在不断变化的环境中，气孔开度的调控对植物至关重要，使其能够在通过蒸腾作用损失水分的同时，控制光合作用所需的二氧化碳吸收。因此，气孔开度的量化对于理解植物环境适应机制具有重要意义。然而，气孔开度的量化本质上费时且繁琐，需要人工在显微镜拍摄的叶片图像中识别并测量气孔孔隙。为克服这些局限，已开发出多种方法以促进气孔开度的量化 拟南芥 广泛用于研究气孔生物学的模式植物1,2,3,4,5,6例如，可以使用气孔计测量蒸腾速率，以此作为气孔导度的指标。然而，该方法无法直接提供决定气孔导度的气孔数量和孔径信息。一些研究采用共聚焦显微镜技术，利用荧光肌动蛋白标记物、荧光染料或细胞壁自发荧光来显示气孔孔隙1,2,3,4,5尽管这些方法有助于气孔的检测，但共聚焦显微镜设施的运行成本以及显微样品制备的成本可能成为常规应用的障碍。在Sai等人的一项开创性研究中，开发了一种深度神经网络模型，可从明场显微镜图像中自动测量气孔开度 A. thaliana 表皮剥离6然而，这项创新并未免除研究人员制备表皮撕片以进行显微观察的任务。最近，这一障碍已通过开发一种便携式成像设备得以克服，该设备可通过夹持叶片来观察气孔 A. thaliana，以及一个基于深度学习的图像分析流程，可自动测量设备所捕获叶片图像中的气孔开度7.

气孔在植物抵御细菌病原体的先天免疫中发挥重要作用。这种免疫反应的关键是气孔关闭，可限制细菌通过微小的气孔进入叶片内部，而细菌病原体在叶片内部会大量繁殖并引发病害8。当质膜定位的模式识别受体（PRR）识别微生物相关分子模式（MAMPs）——一类通常在多种微生物中保守存在的免疫原性分子——时，便会诱导气孔关闭9。细菌鞭毛蛋白的一个由22个氨基酸组成的表位flg22是一种典型的MAMP，它通过被PRR FLS2识别而诱导气孔关闭10。作为应对策略，某些细菌病原体，如丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，简称Pto）和野油菜黄单胞菌辣椒致病变种（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria），已进化出毒力机制以重新打开气孔9,11,12。传统上，这些气孔对细菌病原体的响应是通过将叶片表皮条、叶圆片或离体叶片漂浮于细菌悬浮液中进行检测，并在显微镜下观察气孔，随后手动测量气孔开度来分析的。然而，这些检测方法繁琐，且可能无法真实反映植物活体叶片在自然细菌侵染过程中气孔的实际响应情况。

本文介绍了一种简单的方法，用于研究在模拟植物与细菌自然互作条件下丁香假单胞菌番茄致病变种（Pto）侵染过程中气孔的关闭与重新开放。该方法利用便携式成像设备，直接观察接种了Pto的拟南芥（A. thaliana）植株叶片上的气孔，并结合图像分析流程，实现对气孔开度的自动化测量。

方案

1. 植物培养

  1. 为打破休眠，将 A. thaliana (Col-0) 种子重悬于去离子水中，并在黑暗条件下于 4 °C 下孵育 4 天。
  2. 将种子播种于土壤中，并在配备白色荧光灯的培养室中生长。维持以下生长条件：温度 22 °C，光照强度 6,000 lux（约 100 µmol/m2/s），光照时间 10 小时，相对湿度 60%。
  3. 必要时，用液体肥料浇灌植株。在接种前 1 周至前 2 天期间避免浇水，并在接种前 1 天充分浇水。

2. 准备细菌接种物

  1. 从甘油菌种中挑取Pto，在含50 µg/mL利福平的固体King's B（KB）培养基（每升含20 g胰蛋白胨、1.5 g K2HPO4、15 g甘油，1.5%琼脂）上划线，于28 °C培养2天。
  2. 挑取单菌落接种至5 mL含50 µg/mL利福平的KB液体培养基中，于28 °C、200 rpm振荡培养至对数生长后期。
  3. 将菌液在6,000 x g离心2分钟，弃上清，菌体沉淀用1 mL无菌水重悬。重复此步骤一次。
  4. 弃去上清，将菌体沉淀用1 mL气孔开放缓冲液（25 mM MES-KOH pH 6.15，10 mM KCl）重悬，并测定OD600。
  5. 用含有0.04%硅基表面活性剂的气孔开放缓冲液将菌悬液稀释至OD600为0.2。

3. 喷雾 细菌接种

  1. 从接种前1天开始直至实验结束，将植物暴露于约10,000 lux（约170 µmol/m2/s）的光照强度下。
  2. 为确保大部分气孔处于开放状态，在喷雾接种前至少3小时，将植物置于带有透明盖的托盘中并在光照下培养。
  3. 移去盖子，使用喷雾器对单个花盆中三株植物的叶片背面喷洒2.5 mL细菌悬浮液。
  4. 将接种后的植物放置在带有透明盖的托盘中培养，以维持约85%的相对湿度。
  5. 采用第4节所述方法，在喷雾接种后1小时和3小时获取气孔图像。

4. 使用便携式成像设备直接观察气孔

注意：便携式气孔成像设备配备有LED光源和相机模块，可获取2,592 × 1,944（高度 × 宽度；像素）的图像，分辨率为约0.5 µm/像素。

  1. 将便携式气孔成像装置连接至配备图像采集软件的个人计算机（PC）。
  2. 用一张纸轻轻但彻底地擦去接种叶片上的水滴。
  3. 打开设备的顶盖，将叶片放置在载物台上，然后关闭顶盖（图1）。
  4. 通过调节调焦螺丝调整图像焦距，然后点击PC屏幕上“保存图像”按钮，图像将立即被采集。通常，一张清晰的图像包含约10个可分析的气孔。为获得可靠的结果，应从三株不同植株的六片叶片上（每株两片）采集气孔图像。

5. 气孔开度的手动测量

注意：ImageJ 软件可在 https://imagej.nih.gov/ij/download.html下载

  1. 在 ImageJ 中打开图像文件。
  2. 通过选择 分析 > 工具 > ROI 管理器 打开 ROI 管理器。
  3. 使用 直线 选择工具绘制一条对应气孔宽度的线段（图 2），然后在 ROI 管理器 中点击 添加 以注册该 ROI。
  4. 绘制一条对应同一气孔长度的线段（图 2A），并按照步骤 5.3 所述方法注册该 ROI。
  5. 在 ROI 管理器 中点击 测量，以测量气孔的宽度和长度。
  6. 将宽度除以长度，得到气孔开度（比值）。为获得可靠的定量结果，每种处理和时间点应分析 60 个或更多气孔。分析时不应选择未成熟或难以辨认的气孔（图 2B、C）。

6. 气孔开度的自动测量

注意：图像分析流程在 Google Colaboratory 中运行，这是一个基于云的 Python 编程语言可执行环境。用户必须具备有效的 Google 账户、可用的 Google 云端硬盘、Google Chrome 浏览器以及稳定的互联网连接，方可使用。

  1. 从 Zenodo 下载 Google Colaboratory 笔记本（https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528），并打开笔记本。
  2. 通过选择将笔记本的本地副本保存到 Google Drive 文件 > 在云端硬盘中保存副本新标签页出现后，安全关闭原始笔记本的标签页。
  3. 按压 执行 按钮一次，位于下方 环境设置 在笔记本中执行该部分时，无需展开细胞块即可导入所需的库。
  4. 执行 目录设置 用于分析的三个文件夹（例如， 示例结果，推断结果，以及 模型) 在 Google Drive 中。
    注意：在此情况下，名为 示例结果，推断结果，以及 模型 分别用作父目录，用于存储推理结果和训练好的模型。该笔记本展示了目录构建的一个示例，作为代表性流程。如需更改名称，请重写 pardir, infdir，或 modeldir 路径
  5. 根据 图像的制备 切片，将获取的图像移至 示例结果，按处理方式或样本分组命名图像文件（例如 mock_1h_XXXXXX.jpg），用于最终图表的生成。样本图像可从 Zenodo 获取（https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528）。
  6. 执行 下载训练好的模型 部分用于从 Zenodo 下载训练模型的 ONNX 文件https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528）并将它们置于下方 模型 目录
  7. 运行 气孔开度的推断与测量 用于从单张图像中量化气孔开度。结果图像将显示叠加的推断轮廓，并生成名为 example_result.csv 将被导出到 inference_results 目录。
  8. 执行 图的生成 创建关于气孔开度比的图表并导出 推断结果 目录

结果

在对Pto进行喷雾接种后，使用便携式气孔成像装置直接观察接种植株叶片上的气孔。通过手动和自动测量方法，利用相同的叶片图像，计算约60个气孔的宽度与长度比值，以确定气孔开度。手动和自动测量结果均一致显示，在接种后1小时（hpi），Pto接种植株的气孔开度较对照接种植株显著降低（图3A、B），表明A. thaliana植株在Pto侵染后会关闭气孔。在接种后3小时，Pto接种植株与对照接种植株的气孔开度基本相同（图3C、D），提示气孔重新开放，类似于Pto诱导的气孔再开放现象。值得注意的是，自动测量气孔开度处理单张图像仅需约5秒（Table 1），与手动测量相比，测量时间减少了95%以上。因此，本方案提供了一种操作简便且节省人力的方法，用于追踪A. thaliana对细菌病原体的动态气孔响应。

使用叶夹传感器进行光合作用分析的植物胁迫测量装置。
图1：便携式成像设备。 图中显示了带有叶片置于载物台上的便携式成像设备（左图）以及关闭上盖后的设备（右图）。请点击此处查看该图的放大版本。

植物细胞显微镜观察，长度-宽度测量；细胞结构分析示意图。
图 2：气孔开度测量示意图。（A）气孔开度通过计算气孔的宽度与长度之比确定，如白色箭头所示。（B）未成熟气孔和（C）模糊气孔应排除在测量之外。请点击此处查看此图的放大版本。

模拟处理与Pto处理的箱线图比较，显示p值，统计数据分析。
图3：完整植株中气孔对 Pto 的响应。 将 A. thaliana 植株用模拟溶液或 Pto 喷雾接种，并使用便携式气孔成像装置直接观察接种植株叶片上的气孔，分别在（A、B）1 hpi 和（C、D）3 hpi 时进行。气孔开度（比值）通过（A、C）人工测量和（B、D）自动测量计算得出。p 值采用双尾 t 检验计算。请点击此处查看该图的放大版本。

处理时间（秒）
方法平均值标准差
手动130.148.8
自动4.70.8

表1：每张图像气孔开度的手动与自动测量处理时间。 处理时间的平均值和标准差（SD）由九张代表性图像的测量结果计算得出。

讨论

既往研究采用表皮条、叶盘或离体叶片来探究气孔对细菌侵染的响应9,11,12。相比之下，本研究提出的方法利用便携式气孔成像装置，在喷雾接种Pto后直接观察仍附着于植株上的叶片气孔，从而模拟细菌侵染的自然条件。此外，由于该方法无需进行叶片摘除、叶盘切割或表皮剥离等具有破坏性的样品制备步骤，因此可避免由此类操作引起的机械损伤和水分流失。这些影响不容忽视，因为机械损伤和水分流失不可避免地会引发植物源性信号分子（如植物激素茉莉酸和脱落酸）的产生，进而影响气孔运动13,14。

便携式气孔成像设备的最佳使用需遵循若干指导原则。首先，必须彻底清除叶片表面的水滴，以获得清晰度和聚焦效果最佳的图像。其次，建议通过调节调焦螺丝对同一叶片区域拍摄多张图像，以精细调整焦距。该操作有助于增加每单位叶面积内可分析的气孔数量，从而减少潜在的取样偏差。最后，使用设备夹持叶片时需小心操作，避免对叶片造成损伤。这一点至关重要，因为机械损伤是诱导气孔关闭的信号之一14。

与人工测量相比，自动测量的气孔孔径往往表现出更大的变异性（图3）。造成这一现象的原因可能有多种。先前已有报道指出，通过图像分析流程推断出的气孔孔径常包含气孔周围保卫细胞的细胞壁和/或阴影部分7，而人工目测测量则不会包含这些结构。尽管气孔检测模型在训练过程中已设定为排除形态异常的气孔，但此类气孔仍可能影响人工与自动测量结果之间的差异7。此外，自动测量中少数气孔的孔径被赋予零值，而在人工测量中未出现此类情况，其原因尚不明确。未来可能需要对模型进行更新以解决这些问题。尽管如此，由于自动测量的气孔孔径结果与人工测量基本一致，当前版本的图像分析流程已具备实际应用价值。

本研究中描述的对A. thaliana气孔开度进行直接观察和自动测量的方法，在阐明气孔在植物环境适应中所起作用的多种应用方面具有广阔前景。例如，所提出的方法应可广泛应用于在生物胁迫（如MAMPs和微生物病原体）或非生物胁迫（如干旱）处理后，对完整植株系统中的气孔开度进行快速定量分析。支持这一点的是，先前一项研究已成功应用该图像分析流程，准确量化了经真菌毒素fusicoccin（可诱导气孔开放）或胁迫激素脱落酸（abscisic acid，可诱导气孔关闭）处理的"叶片圆片"的气孔开度7。此外，原则上，该便携式成像装置允许对植株上同一片叶片进行长期的气孔开度时间序列分析。这可能揭示植物-微生物互作的新层面，因为大多数研究仅关注互作最初数小时内气孔对细菌病原体的响应9,10,11。进一步应用并改进该方法，以探究在不同环境条件下细菌侵染所引发的气孔响应，也将具有重要意义。这一点对于理解温度、湿度和土壤水分有效性等环境因素对气孔运动及细菌病原体致病过程的影响尤为相关8,15。总之，预计该方法将在迄今难以实现的实验条件下，加速关于气孔功能的研究，拓展至植物-微生物互作之外的更多领域。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢研究项目“通过植物-微生物全生物体组装共同创造植物适应性状”的所有成员进行的富有成果的讨论。本工作得到了变革性研究领域资助（A.M. 获资助号 21H05151 和 21H05149，Y.T. 获资助号 21H05152）以及挑战性探索研究资助（A.M. 获资助号 22K19178）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂Nakarai tesque01028-85
喷枪套件ANEST IWATAMX2900SPRINT JET 配套附件套件
植物培养箱（Biotron）Nippon Medical & Chemical InstrumentsLPH-411S配备白色荧光灯的植物生长培养箱
甘油Wako072-00626
半尺寸育苗盘Sakata72000113包含托盘和盖子的套装
HyponexHyponex无目录编号将 Hyponex 溶液用去离子水按 1:2000 比例稀释后用于浇灌植物
Image JNational Institute of Health下载地址 https://imagej.nih.gov/ij/download.html用于人工测量气孔开度
K2HPO4Wako164-04295
KClWako163-03545
KOHWako168-21815用于配制 MES-KOH 缓冲液
MESWako343-01621用于配制 MES-KOH 缓冲液
便携式气孔成像装置Phytometrics订购网址 https://www.phytometrics.jp/Takagi 等 (2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018
利福平Wako185-01003溶于 DMSO
Silwet-L77Bio medical scienceBMS-SL7755喷雾接种中使用的有机硅表面活性剂
SPRINT JETANEST IWATAIS-800用于喷雾接种的喷枪
SuperMix ASakata seed72000083与 Vermiculite G20 等比例混合以配制培养土
胰蛋白胨Nakarai tesque35640-95
蛭石 G20Nittai无目录编号与 SuperMix A 等比例混合以配制培养土
白色荧光灯NECFHF32EX-N-HX-S用于 Biotron 植物培养箱

参考文献

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