本方案描述了一种获取高质量兔眼整体冷冻切片的可靠方法。文中详细介绍了兔眼的解剖、固定、包埋和切片步骤，这些方法可轻松适用于任何利用免疫组织化学技术研究较大眼球的实验。
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摘要
摘要
本方案描述了如何在较大动物（如兔子）中获得高质量的视网膜冷冻切片。眼球摘除后，短暂浸入固定液中。随后去除角膜和虹膜，并将眼球在4 °C条件下继续固定过夜。固定完成后，移除晶状体。然后将眼球置于冷冻模具中，并加入包埋介质。通过移除晶状体，包埋介质可更好地渗透至玻璃体，从而提高视网膜的稳定性。重要的是，眼球应在包埋介质中孵育过夜，以确保包埋介质充分浸润整个玻璃体。过夜孵育后，将眼球置于干冰上冷冻并进行切片。可获得完整的视网膜切片，用于免疫组织化学分析。可采用标准染色方案研究抗原在视网膜组织中的定位。遵循本方案可获得高质量的视网膜冷冻切片，适用于任何基于免疫组织化学的实验。
引言
视网膜由眼内多层特化细胞构成，这些细胞共同作用将光信号转化为神经信号。由于视网膜在视觉过程中发挥关键作用，了解其结构与功能可为研究视力丧失的最常见病因（如黄斑变性和糖尿病性视网膜病变等）提供重要线索。
兔子作为视网膜研究中的便捷动物模型，相较于其他模型具有多项优势1,2。例如，兔子眼睛的解剖结构与人类眼睛相对相似。兔子具有光感受器密度增高的区域，称为水平视觉条带，其功能类似于人类的黄斑。而其他常用的动物模型（如啮齿类动物）则没有相应的解剖结构。此外，与啮齿类动物相比，兔子视网膜的血管结构也更接近人类。兔子的眼睛相对较大，这一特点使其特别适用于涉及玻璃体或视网膜内药物给药或外科干预的研究，而在较小的眼球中，此类操作可能难以实施甚至无法完成3。
免疫组织化学（IHC）是一种广泛用于研究抗原在组织内定位的技术，在视网膜研究中具有广泛应用4,5,6。由于视网膜结构精细，通过IHC获得可靠结果需要谨慎的组织处理过程。在处理过程中，常出现视网膜脱离及其他组织学伪影，如视网膜裂孔或皱褶，这些可能干扰结果的判读。成功的组织处理取决于多种因素，包括组织操作方式、固定剂类型及固定时间、包埋介质类型以及切片技术7,8,9,10。尽管兔子作为视网膜研究的动物模型具有诸多优势，但目前描述兔视网膜成功组织处理的实验方案却极为有限。本文介绍一种可靠的方法，用于从完整兔眼获取高质量的视网膜切片，以适用于免疫组织化学分析。
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方案
所有操作均遵守并经南加州大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本方案的建立共使用了14只（n = 14）年龄在4至6个月之间的荷兰带状兔。实验动物包括雄性和雌性。所有动物体重均在2.0 至2.5 kg之间。所有动物均单独饲养。推荐使用的材料和设备清单见材料表。
1. 准备
- 固定液的配制。
- 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制4%多聚甲醛（PFA）。每个眼球至少需要50 mL固定液。
- 冷冻保护剂的配制。
- 在PBS中配制30%重量体积比（w/v）的蔗糖溶液。置于摇床上至少15分钟，以确保蔗糖完全溶解。每个眼球至少需要50 mL冷冻保护剂。
- 解剖器械的准备。
- 准备两对镊子、一对弯头剪刀、一片手术刀片以及一个100 mm解剖皿，并将其放置在解剖显微镜附近。示例装置如图1A所示。
2. 初始固定
- 经结膜外路摘除眼球后11，立即将眼球置于至少 50 mL 的含 4% 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在冰上保存。确保眼球完全浸没。若眼球外表面附着气泡，可轻轻振荡以去除。
3. 角膜和虹膜的去除
- 15分钟后，将眼球从PBS中的4%多聚甲醛（PFA）中取出，置于解剖显微镜下的100 mm解剖皿中。向皿中加入PBS，防止眼球干燥。
- 去除角膜。
- 首先使用手术刀在距角膜缘1 mm的前方位置做一切口，切口方向平行于虹膜平面，以避免意外刺破下方结构（图1B）。
- 将弯头剪刀插入初始切口，沿距角膜缘1 mm处继续环形剪切。剪切过程中使用镊子固定眼球（图1C）。
- 完成环形切口后，用镊子取下角膜，并用实验室擦拭纸轻轻吸去多余的PBS。将角膜置于室温（RT）的30%蔗糖溶液中进行冷冻保护，或予以丢弃。当角膜完全沉底时，冷冻保护即已完成，通常耗时少于1小时。
- 去除虹膜。
- 首先用弯头剪刀在虹膜上做初始切口，然后以类似去除角膜的方式进行环形剪切，将虹膜与周围组织完全分离（图1D）。
- 完成环形切口后，用镊子取下虹膜，并用实验室擦拭纸轻轻吸去多余的PBS。将虹膜置于室温（RT）的30%蔗糖溶液中进行冷冻保护，或按上述方式丢弃。当虹膜完全沉底时，冷冻保护即已完成，通常耗时少于30分钟。
4. 固定完成
- 去除角膜和虹膜后，将眼球置于至少 50 mL 新鲜配制的 4% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液中，并放入摇床中轻轻振荡。确保眼球在振荡过程中完全浸没。
- 将眼球在 4 °C 条件下于 4% PFA PBS 溶液中固定过夜。
注意：我们发现，在 4 °C 条件下使用 4% PFA 固定 16 至 24 小时可获得优异的免疫组化（IHC）染色效果；固定时间过长会导致非特异性背景染色增强以及表位遮蔽。
5. 晶状体摘除
- 第二天早晨，从 PBS 中的 4% PFA 内取出眼球，并将其置于解剖显微镜下的 100 mm 解剖皿中。向皿中加入 PBS，以防止眼球干燥。
- 移除晶状体。
- 首先用镊子小心夹住晶状体前囊。
注意：使用镊子时务必极其小心，切勿用力推或拉晶状体，以免引起视网膜脱离。 - 将剪刀小心插入玻璃体腔，使剪刀刀刃沿晶状体后方弯曲。使用弯头剪刀初步剪断晶状体悬韧带。
注意：使用剪刀时务必极其小心，切勿用力推或拉悬韧带，以免引起视网膜脱离（图 1E）。 - 以环形方式继续小范围剪断晶状体悬韧带。每“钟点”位置进行 3 至 5 次剪切。
- 为检查晶状体是否已与周围组织分离，可用镊子轻轻夹住晶状体前囊并尝试轻柔提起。若晶状体未立即松动，切勿强行拉扯，以免引起视网膜脱离。此时应继续剪断残留的悬韧带后再尝试。
- 一旦晶状体完全分离，将其放入室温下的 30% 蔗糖溶液中进行冷冻保护，或按前述方法丢弃。当晶状体完全沉底时，表明冷冻保护完成，通常需要数小时。
- 首先用镊子小心夹住晶状体前囊。
- 将眼球置于至少 50 mL 含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，4 °C 下进行冷冻保护。当眼球完全沉底时，表明冷冻保护完成，通常需要 24–48 小时。为加快冷冻保护进程，可在 8–12 小时后更换一次新鲜蔗糖溶液和/或在室温下保存眼球于蔗糖溶液中。
6. 包埋
- 完成冷冻保护后，将眼球从30%蔗糖溶液中取出，并置于解剖显微镜下的100 mm解剖皿中。小心翻转眼球使其朝下，以去除眼内多余的蔗糖溶液。
注意：切勿使用实验室擦拭纸去除眼内多余的溶液，因为擦拭纸可能粘附于玻璃体，导致视网膜脱离。 - 保持眼球朝下，使用擦拭纸轻轻擦去眼球外表面多余的蔗糖溶液。
- 在一次性包埋模具中加入最佳切割温度（OCT）包埋剂，深度为0.5–1.0 cm。
注意：此基底可确保眼球不会接触模具底部，否则会影响后续的冷冻切片。 - 将眼球朝上放入一次性包埋模具中。缓慢向眼内注入OCT，特别注意避免在眼内产生气泡。若出现气泡，应小心将其移除或用镊子推至模具边缘。
- 继续用OCT填满一次性包埋模具。确保眼球完全浸没在OCT中，且不接触模具内壁或暴露于空气中。用封口膜包裹含有眼球的OCT包埋模具，并于4 °C过夜放置。
注意：根据我们的经验，较短的孵育时间不足以使OCT充分渗透至玻璃体。结果，蔗糖层常残留在视网膜与OCT之间。当这种情况发生时，在冷冻切片过程中，由于冻结的蔗糖提供的结构支撑可能弱于冻结的OCT，视网膜常发生脱离或完全撕裂，导致难以甚至无法获得高质量的切片。 - 次日早晨，将含有眼球的OCT包埋模具置于解剖显微镜下的100 mm解剖皿中。确认玻璃体后界膜从内层视网膜向上抬起。
注意：这种向上抬升的现象可能遮挡视网膜的视野，使定位变得困难。 - 为更准确判断眼球的方向，可小心用镊子夹住玻璃体后界膜前部，尝试将其剥离，以暴露下方的视网膜（仍在OCT中）。
注意：有时可见玻璃体管，其附着于视盘，由于视盘位于视网膜的上方区域，因此可用于定位（图2A）。无需完全去除玻璃体后界膜，因为OCT已渗透至玻璃体内部并贴附于内层视网膜，任何残留的膜均不会影响冷冻切片（图2B）。仅在必要时为确定方向才去除玻璃体后界膜。其他确定方向的方法包括在摘除眼球前缝合标记或做其他类型的标记。 - 将眼球转移至新的包埋模具中，加入新OCT至深度0.5–1.0 cm，然后按照步骤6.3–6.5 继续填充新OCT，以确保最终的包埋介质中无夜间可能积聚的碎屑或其他缺陷。如有可能，也可用擦拭纸轻轻去除眼内残留的OCT，但此步骤非必需。
- 为便于定位，对模具进行标记（图2C）。将眼球朝上置于冷冻模具中，可确保OCT贴附于内层视网膜。玻璃体管附着于视盘，是判断眼球上方区域的重要解剖标志（图2A）。
- 将标记好的含眼球OCT包埋模具置于干冰上。确保眼球不接触模具内壁或暴露于空气中。确保模具直接接触干冰，以加快冷冻过程（图2D）。
- 将包埋好的眼球转移至-80 °C超低温冰箱，或直接送至冷冻切片机进行切片（图2E）。
7. 冷冻切片
- 将组织块安装时，使眼球的上方朝上、下方朝下，残留的角膜和虹膜朝向右侧（如图2E所示）或左侧（未显示）。也可根据需要以其他方向安装组织块。如有必要，可通过逐次小心敲掉模具的一侧来松动组织块，并直接在组织块上做标记，以避免丢失眼球的方向。
- 让组织块在恒冷切片机内平衡温度30–60分钟；-20 °C 是一个合适的起始温度。
- 安装完成后，将新刀片置于所需角度，通常与眼球的垂直轴平行。
- 根据需要设定切片厚度：10–20 µm 是一个合适的起始厚度。厚度为14 µm的切片示例见图3A-C。
- 以缓慢且可控的方式开始对组织块进行切片。确保刀片沿眼球垂直轴方向平行切割组织块。若未达到此要求，应相应调整刀片与组织块的接触角度或载物台的方向。
- 切片过程中，使用刷子防止切片起皱或卷曲。迅速将切片翻转，并用长毛刷轻轻向下施加压力，以展平切片并尽量减少皱褶或卷曲。可另备一支尖头刷子，以辅助操作切片。
- 通过将带电荷的玻片朝下缓慢移向切片，使切片附着于玻片上。在贴附过程中，应轻轻滚动玻片覆盖切片，以防止切片自身折叠或发生形变。
注意：切勿将玻片悬停在切片正上方或直接按压切片，以免损伤或扭曲切片。 - 将玻片干燥过夜后，再转移至-80 °C 超低温冰箱，或直接进行标准免疫荧光染色流程。
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结果
组织处理后，可采用标准的免疫荧光方案来研究视网膜内的多种生物学过程。图3A-C展示了通过共聚焦显微镜获得的视网膜切片代表性荧光图像。视网膜切片的免疫染色按照先前描述的方案12进行。
所示代表性视网膜切片 图 3A-C 靠近视神经乳头，且与视网膜血管轴垂直（即切面包含周边视网膜、视网膜血管、有髓神经纤维以及水平视觉条带）。Sox2+ 神经纤维层和内核层中可见细胞核。RPE65 染色显示视网膜色素上皮（RPE）细胞形成连续的单层，紧邻光感受器层。荧光图像显示色素化的 RPE 层均匀分布，与上方的光感受器层无明显分离。视网膜切片的明场图像进一步证实所有视网膜层结构完整，包括光感受器层和 RPE 层。补充图 S1）。在周边视网膜可见小的...
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讨论
在实施上述方案之前，我们一直面临兔眼组织在免疫组化处理中的困难。我们曾借鉴小鼠等小型动物眼球的多种方案，但发现这些方法导致固定不充分，并且组织切片困难。有若干重要注意事项可确保获得稳定且高质量的兔视网膜切片。
一个需要考虑的因素是，与其他常用动物模型（如啮齿类动物）相比，兔眼球的体积较大。由于兔眼大小与人眼相近，因此可方便地开展涉及人类常见眼科操作的转化研究。例如，涉及视网膜和/或玻璃体的操作，如玻璃体内注射、激光光凝、玻璃体切除术以及视网膜脱离手术，均可在兔眼中安全且容易地实施13,14,15。然而，兔眼球较大的体积在组织固定和包埋步骤中需要特殊考虑，这使得为小型动物开发的实验方案效果较差。
适当的固定取决于多种因素，这些因素与组织类型及其最终用途相关。在较大的眼球中，确保固定剂充分渗透至视网膜至关重要。早期去除角膜和虹膜可增加对玻璃体的直...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Rosanna Calderon、Dominic Shayler 和 Rosa Sierra 提供的技术建议。本研究部分得到了以下资助：Research to Prevent Blindness 向南加州大学凯克医学院眼科系提供的无限制拨款（AN），NIH K08EY030924（AN），眼科实验治疗学 Las Madrinas 基金会（AN），Research to Prevent Blindness 职业发展奖（AN），骑士圣殿眼科基金会基金（AN），以及 Edward N. 和 Della L. Thome 纪念基金会（AN、KG）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 培养皿 | Corning | 353025 | 用于解剖（步骤 1.3、3 和 5） |
| 50 mL 离心管 | Genesee Scientific | 28-106 | 用于固定和冷冻保护（步骤 1） |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1850 | 用于冷冻切片（步骤 7） |
| 弯头剪刀 | Fine Science Tools | 91500-09 | 用于解剖（步骤 1.3、3 和 5） |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | 用封闭缓冲液按 1:1,000 稀释 |
| 解剖显微镜 | Zeiss | Stemi 2000-C | 用于解剖（步骤 1.3、3 和 5） |
| 驴抗山羊 488 | Fisher Scientific | A-11055 | 用封闭缓冲液按 1:1,000 稀释 |
| 驴抗小鼠 555 | Fisher Scientific | A-31570 | 用封闭缓冲液按 1:1,000 稀释 |
| 镊子 | Fine Science Tools | 91150-20 | 用于解剖（步骤 1.3、3 和 5） |
| 玻璃盖片 | VWR | 48404-453 | 用于冷冻切片（步骤 7） |
| 山羊抗 SOX2 | R&D Systems | AF2018 | 用封闭缓冲液按 1:100 稀释 |
| 高轮廓一次性冷冻切片刀片 | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | 用于冷冻切片（步骤 7） |
| 吸水纸（Kimwipe） | Fisher Scientific | 06-666-A | 用于擦除多余的 PBS 或 OCT（步骤 3 和 6） |
| 小鼠抗 RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | 用封闭缓冲液按 1:100 稀释 |
| OmniPur 蔗糖 | Millipore | 167117 | 用于冷冻保护剂（步骤 1.2） |
| 20% 多聚甲醛溶液 | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 用作组织固定剂（在步骤 1.1 中稀释至 4%） |
| 可剥离一次性包埋模具（22×22×20 mm 深） | Polysciences, Inc. | 18646A | 用作包埋模具（步骤 6） |
| 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） | Corning | 21-030-CV | 用于配制固定剂（步骤 1.1）和冷冻保护剂（步骤 1.2） |
| 15 号手术刀片 | Feather | 08-916-5D | 用于解剖（步骤 1.3、3 和 5） |
| Superfrost Plus 显微载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | 用于冷冻切片（步骤 7） |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura | 4583 | 用作包埋介质（步骤 6） |
参考文献
- Peiffer, R. L. Jr, Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. 409-433 (1994).
- Davis, F. A. The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit. Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).
- Pang, J., et al. Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing. STAR Protoc. 2 (4), 100879(2021).
- Sorden, S. D., et al. Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies. Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Mitchell, N. Enucleation in companion animals. Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).
- Kastan, N. R., et al. Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119(2022).
- Baiza-Durán, L., et al. Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits. Int J Retina Vitreous. 6, 32(2020).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).
- Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).
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