本方案描述了一种获取高质量兔眼整体冷冻切片的可靠方法。文中详细介绍了兔眼的解剖、固定、包埋和切片步骤，这些方法可轻松适用于任何利用免疫组织化学技术研究较大眼球的实验。
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本文内容
摘要
摘要
本方案描述了如何在较大动物（如兔子）中获得高质量的视网膜冷冻切片。眼球摘除后，短暂浸入固定液中。随后去除角膜和虹膜，并将眼球在4 °C条件下继续固定过夜。固定完成后，移除晶状体。然后将眼球置于冷冻模具中，并加入包埋介质。通过移除晶状体，包埋介质可更好地渗透至玻璃体，从而提高视网膜的稳定性。重要的是，眼球应在包埋介质中孵育过夜，以确保包埋介质充分浸润整个玻璃体。过夜孵育后，将眼球置于干冰上冷冻并进行切片。可获得完整的视网膜切片，用于免疫组织化学分析。可采用标准染色方案研究抗原在视网膜组织中的定位。遵循本方案可获得高质量的视网膜冷冻切片，适用于任何基于免疫组织化学的实验。
引言
视网膜由眼内多层特化细胞构成，这些细胞共同作用将光信号转化为神经信号。由于视网膜在视觉过程中发挥关键作用，了解其结构与功能可为研究视力丧失的最常见病因（如黄斑变性和糖尿病性视网膜病变等）提供重要线索。
兔子作为视网膜研究中的便捷动物模型，相较于其他模型具有多项优势1,2。例如，兔子眼睛的解剖结构与人类眼睛相对相似。兔子具有光感受器密度增高的区域，称为水平视觉条带，其功能类似于人类的黄斑。而其他常用的动物模型（如啮齿类动物）则没有相应的解剖结构。此外，与啮齿类动物相比，兔子视网膜的血管结构也更接近人类。兔子的眼睛相对较大，这一特点使其特别适用于涉及玻璃体或视网膜内药物给药或外科干预的研究，而在较小的眼球中，此类操作可能难以实施甚至无法完成3。
免疫组织化学（IHC）是一种广泛用于研究抗原在组织内定位的技术，在视网膜研究中具有广泛应用4,5,6。由于视网膜结构精细，通过IHC获得可靠结果需要谨慎的组织处理过程。在处理过程中，常出现视网膜脱离及其他组织学伪影，如视网膜裂孔或皱褶，....
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方案
所有操作均遵守并经南加州大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本方案的建立共使用了14只（n = 14）年龄在4至6个月之间的荷兰带状兔。实验动物包括雄性和雌性。所有动物体重均在2.0 至2.5 kg之间。所有动物均单独饲养。推荐使用的材料和设备清单见材料表。
1. 准备
- 固定液的配制。
- 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制4%多聚甲醛（PFA）。每个眼球至少需要50 mL固定液。
- 冷冻保护剂的配制。
- 在PBS中配制30%重量体积比（w/v）的蔗糖溶液。置于摇床上至少15分钟，以确保蔗糖完全溶解。每个眼球至少需要50 mL冷冻保护剂。
- 解剖器械的准备。
- 准备两对镊子、一对弯头剪刀、一片手术刀片以及一个100 mm解剖皿，并将其放置在解剖显微镜附近。示例装置如图1A所示。
2. 初始固定
- 经结膜外路摘除眼球后11，立即将眼球置于至少 50 mL 的含....
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结果
组织处理后，可采用标准的免疫荧光方案来研究视网膜内的多种生物学过程。图3A-C展示了通过共聚焦显微镜获得的视网膜切片代表性荧光图像。视网膜切片的免疫染色按照先前描述的方案12进行。
所示代表性视网膜切片 图 3A-C 靠近视神经乳头，且与视网膜血管轴垂直（即切面包含周边视网膜、视网膜血管、有髓神经纤维以及水平视觉条带）。Sox2+ 神经纤维层和内核层中可见细胞核。RPE65 染色显示视网膜色素上皮（RPE）细胞形成连续的单层，紧邻光感受器层。荧光图像显示色素化的 RPE 层均匀分布，与上方的光感受器层无明显分离。视网膜切片的明场图像进一步证实所有视网膜层结构完整，包括光感受器层和 RPE 层。补充图 S1）。在周边视网膜可见小的.......
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讨论
在实施上述方案之前，我们一直面临兔眼组织在免疫组化处理中的困难。我们曾借鉴小鼠等小型动物眼球的多种方案，但发现这些方法导致固定不充分，并且组织切片困难。有若干重要注意事项可确保获得稳定且高质量的兔视网膜切片。
一个需要考虑的因素是，与其他常用动物模型（如啮齿类动物）相比，兔眼球的体积较大。由于兔眼大小与人眼相近，因此可方便地开展涉及人类常见眼科操作的转化研究。例如，涉及视网膜和/或玻璃体的操作，如玻璃体内注射、激光光凝、玻璃体切除术以及视网膜脱离手术，均可在兔眼中安全且容易地实施13,14,15。然而，兔眼球较大的体积在组织固定和包埋步骤中需要特殊考虑，这使得为小型动物开发的实验方案效果较差。
适当的固定取决于多种因素，这些因素与组织类型及其最终用途相关。在较大的眼球中，确保固定剂充分渗透至视网膜至关重要。早期去除角膜和虹膜可增加对玻璃体的直.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Rosanna Calderon、Dominic Shayler 和 Rosa Sierra 提供的技术建议。本研究部分得到了以下资助：Research to Prevent Blindness 向南加州大学凯克医学院眼科系提供的无限制拨款（AN），NIH K08EY030924（AN），眼科实验治疗学 Las Madrinas 基金会（AN），Research to Prevent Blindness 职业发展奖（AN），骑士圣殿眼科基金会基金（AN），以及 Edward N. 和 Della L. Thome 纪念基金会（AN、KG）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 培养皿 | Corning | 353025 | 用于解剖（步骤 1.3、3 和 5） |
| 50 mL 离心管 | Genesee Scientific | 28-106 | 用于固定和冷冻保护（步骤 1） |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1850 | 用于冷冻切片（步骤 7） |
| 弯头剪刀 | Fine Science Tools | 91500-09 | 用于解剖（步骤 1.3、3 和 5） |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | 用封闭缓冲液按 1:1,000 稀释 |
| 解剖显微镜 | Zeiss | Stemi 2000-C | 用于解剖（步骤 1.3、3 和 5） |
| 驴抗山羊 488 | Fisher Scientific | A-11055 | 用封闭缓冲液按 1:1,000 稀释 |
| 驴抗小鼠 555 | Fisher Scientific | A-31570 | 用封闭缓冲液按 1:1,000 稀释 |
| 镊子 | Fine Science Tools | 91150-20 | 用于解剖（步骤 1.3、3 和 5） |
| 玻璃盖片 | VWR | 48404-453 | 用于冷冻切片（步骤 7） |
| 山羊抗 SOX2 | R&D Systems | AF2018 | 用封闭缓冲液按 1:100 稀释 |
| 高轮廓一次性冷冻切片刀片 | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | 用于冷冻切片（步骤 7） |
| 吸水纸（Kimwipe） | Fisher Scientific | 06-666-A | 用于擦除多余的 PBS 或 OCT（步骤 3 和 6） |
| 小鼠抗 RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | 用封闭缓冲液按 1:100 稀释 |
| OmniPur 蔗糖 | Millipore | 167117 | 用于冷冻保护剂（步骤 1.2） |
| 20% 多聚甲醛溶液 | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 用作组织固定剂（在步骤 1.1 中稀释至 4%） |
| 可剥离一次性包埋模具（22×22×20 mm 深） | Polysciences, Inc. | 18646A | 用作包埋模具（步骤 6） |
| 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） | Corning | 21-030-CV | 用于配制固定剂（步骤 1.1）和冷冻保护剂（步骤 1.2） |
| 15 号手术刀片 | Feather | 08-916-5D | 用于解剖（步骤 1.3、3 和 5） |
| Superfrost Plus 显微载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | 用于冷冻切片（步骤 7） |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura | 4583 | 用作包埋介质（步骤 6） |
参考文献
- Peiffer, R. L. Jr, Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. 409-433 (1994).
- Davis, F. A. T....
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重印与许可
