监测鸡胚神经管闭合过程中组织的力学演变

摘要

本方案旨在对鸡胚神经管形成过程中神经板组织的力学特性进行纵向监测。该方法结合了布里渊显微镜与载物台式培养系统，可实现神经板组织在活体状态下的力学成像 体外孵化 培养的鸡胚

摘要

神经管闭合（NTC）是胚胎发育过程中的关键事件。该过程失败可导致神经管缺陷，引发先天性畸形甚至死亡。NTC涉及遗传、分子和力学层面的一系列机制。尽管近年来力学调控机制日益受到关注，但由于缺乏适用于三维胚胎组织力学检测的合适技术，相关研究仍 largely 未被深入探索。 原位. 作为回应，我们开发了一种非接触、非侵入式定量测定鸡胚组织力学特性的实验方案。该方法通过将共聚焦布里渊显微镜与载物台式培养系统相结合实现。为探测组织力学特性，将预先培养的胚胎取出并转移至载物台培养箱中进行 体外孵化 培养。同时，在发育过程中的不同时间点，利用布里渊显微镜获取神经板组织的力学图像。本方案详细描述了样品制备、布里渊显微成像实验的实施，以及数据的后期处理与分析。通过遵循本方案，研究人员可对胚胎组织在发育过程中的力学演变进行纵向研究。

引言

神经管缺陷（NTDs）是一类由于胚胎发育过程中神经管闭合（NTC）失败所导致的中枢神经系统严重出生缺陷¹。NTDs 的病因复杂。研究表明，NTC 涉及一系列形态发生过程，包括汇聚延伸、神经板弯曲（例如顶端收缩）、神经褶抬升以及最终的神经褶黏附。这些过程受到多种分子和遗传机制的调控^2,3，上述任一过程发生功能障碍均可能导致 NTDs^4,5,6。随着越来越多的证据表明机械信号在 NTC 过程中也发挥着关键作用^{3,7,8,9,10,11}，且已发现基因与机械信号之间存在关联^12,

方案

该实验方案已获得韦恩州立大学机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 实验准备

1. 使用70%乙醇溶液清洁和灭菌剪刀与镊子。同时，准备好一次性移液管和注射器。
2. 通过将3.595 g NaCl加入495 mL去离子水中来配制洗涤培养基。然后向培养基中加入5 mL青霉素-链霉素溶液（5 U/mL）。用该洗涤培养基填充一个100 mm的培养皿，并将其预热至37 °C。
3. 根据图1所示的整体构型准备培养皿。
   1. 取一片滤纸，将其裁剪成约17 mm × 20 mm的矩形，并切除四个角。在滤纸中央制作一个约7 mm × 10 mm的中空区域，用于固定胚胎（图1，左图）。
      NOTE：胚胎的收集方法见步骤2。
   2. 将一个市售环形支撑圈（Φ = 1英寸，参见材料表）与一层柔性薄膜（如石蜡膜）结合，确保该柔性薄膜也具有一个中空中心。此带膜的支撑圈将用于固定带有胚胎的滤纸。
   3. 最后，将准备好的支撑圈放入一个35 mm培养皿中（图1，右图）。
      ​NOTE：滤纸用于通过将其放置在膜上并使胚胎位于中央中空....

结果

图6 展示了布里渊显微镜的示意图。系统采用波长为660 nm的激光器作为光源。在激光器输出端紧接一个光隔离器，用于抑制背向反射光，同时使用中性密度（ND）滤光片调节激光功率。通过一对焦距分别为f1 = 16 mm和f2 = 100 mm的透镜L1和L2，对激光光束进行扩束。在偏振分束器（PBS）之后，利用半波片（HWP）和线性偏振器（偏振器1）调节照射到样品或校准材料（即水和甲醇）上的光束功率。为了将激光聚焦至样品并收集背向散射光，采用一个数值孔径（NA）为0.6、放大倍数为40倍的物镜（OBJ2）。入射光与背向散射光在经过四分之一波片（QWP2）进行偏振调节后，由同一偏振分束器（PBS）实现分离。类似地，OBJ1和QWP1用于将激光引导至校准材料。布里渊信号通过单模光纤传输至布里渊光谱仪。⁴³ 用于分析。在光谱仪内部，一个柱面透镜（C1）将布里渊信号耦合至第一个VIPA（虚像相位阵列）标准具。第一个VIPA标准具的输出经另一个柱面透镜（C2）重新整形后，聚焦到掩膜1上，以滤除非散射的激光光。随后，布里渊信号由一个球面透镜（SL1.......

讨论

胚胎的早期发育容易受到外界干扰的影响，因此在样品提取和转移过程中必须格外谨慎。一个潜在的问题是胚胎从滤纸上脱落，这可能导致卵黄膜收缩，从而在布里渊成像中产生神经板倾斜的人工假象。此外，这种收缩还可能中断胚胎的正常发育。为防止脱落，需特别注意几个关键步骤。首先，在步骤2.4中，必须彻底清除膜表面的蛋白层，残留的蛋白会阻碍膜与滤纸之间的正常粘附^46,47。此外，在洗涤过程中，应将洗涤液沿膜表面平行方向喷洒。若液体流直接冲击膜表面，可能导致膜脱落甚至撕裂。同时，整个洗涤过程应在较短时间内完成（例如，<3 min），因为长时间浸泡也可能导致胚胎从滤纸上脱落。

在进行布里渊测量之前，需要将胚胎转移至含有洗涤介质的培养皿中。这是因为蛋清的布里渊频移与神经板组织非常接近，会导致图像对比度较差。布里渊成像通过点扫描方式获取，可能耗时较长，尤其是在处理大量扫描点时。在本方案中，扫描区域水平方向约为 400 µm，垂直方向小于 100 µm。为避免干扰胚胎的正常发育，总采集时间被.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 培养皿	Fisherbrand	FB0875713
二维电动载物台	Prior Scientific	H117E2
35 mm 培养皿	World Precision Instruments	FD35-100
带载物台培养箱的布里渊显微镜	N/A	N/A	该系统为根据参考文献30定制构建的布里渊显微镜系统
鸡胚蛋	康涅狄格大学	N/A
CMOS 相机	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD 相机	Andor	iXon
乙醇	Decon Laboratories, Inc.	#2701
滤纸	Whatman	1004-070
用于鸡胚培养的孵育箱	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
环形圈	Thorlabs	SM1RR
显微镜主体	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
载物台培养箱	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
封口膜	Bemis	PM-996
青霉素-链霉素	Gibco	15070-063
移液器	Fisherbrand	13-711-6M
剪刀	Artman instruments	N/A	3件套微型剪刀 5
注射器	BD	305482
纸巾	Kimwipes	N/A
离心管	Corning	430052
镊子	DR Instruments	N/A	显微解剖镊套装