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方法文章

监测鸡胚神经管闭合过程中组织的力学演变

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DOI：

10.3791/66117

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2023年11月10日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Wayne State University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

本文内容

摘要

本方案旨在对鸡胚神经管形成过程中神经板组织的力学特性进行纵向监测。该方法结合了布里渊显微镜与载物台式培养系统，可实现神经板组织在活体状态下的力学成像 体外孵化 培养的鸡胚

摘要

神经管闭合（NTC）是胚胎发育过程中的关键事件。该过程失败可导致神经管缺陷，引发先天性畸形甚至死亡。NTC涉及遗传、分子和力学层面的一系列机制。尽管近年来力学调控机制日益受到关注，但由于缺乏适用于三维胚胎组织力学检测的合适技术，相关研究仍 largely 未被深入探索。 原位. 作为回应，我们开发了一种非接触、非侵入式定量测定鸡胚组织力学特性的实验方案。该方法通过将共聚焦布里渊显微镜与载物台式培养系统相结合实现。为探测组织力学特性，将预先培养的胚胎取出并转移至载物台培养箱中进行 体外孵化 培养。同时，在发育过程中的不同时间点，利用布里渊显微镜获取神经板组织的力学图像。本方案详细描述了样品制备、布里渊显微成像实验的实施，以及数据的后期处理与分析。通过遵循本方案，研究人员可对胚胎组织在发育过程中的力学演变进行纵向研究。

引言

神经管缺陷（NTDs）是一类由胚胎发育过程中神经管闭合（NTC）失败导致的中枢神经系统严重出生缺陷1。NTDs 的病因复杂。研究表明，NTC 涉及一系列形态发生过程，包括汇聚延伸、神经板弯曲（如顶端收缩）、神经褶抬升以及神经褶最终的黏附。这些过程受到多种分子与遗传机制的调控2,3，上述任一过程发生功能障碍均可能导致神经管缺陷4,5,6。随着越来越多的证据表明机械信号在神经管闭合过程中也发挥关键作用3,7,8,9,10,11，且已发现基因与机械信号之间存在关联12,13,14，因此，研究神经胚形成过程中的组织生物力学变得尤为迫切。

已开发出多种用于测量胚胎组织力学特性的技术，包括激光消融（LA）15，组织解剖与松弛（TDR）16,17，微吸管抽吸（MA）18，基于原子力显微镜（AFM）的纳米压痕19微压痕仪（MI）和微孔板（MP）20光学/磁镊微流变学（MR）21,22,23，以及基于液滴的传感器24现有的方法能够测量从亚细胞到组织尺度的空间分辨率下的力学特性。然而，大多数这些方法具有侵入性，因其需要与样本接触（例如，微吸管法 MA、原子力显微镜 AFM、磁力法 MI 和微柱阵列 MP）、注入外部材料（例如，磁共振 MR 和基于液滴的传感器）或进行组织切片（例如，激光消融 LA 和牵引力显微镜 TDR）。因此，现有方法难以对神经板组织的力学演化过程进行连续监测 原位25最近，混响光学相干弹性成像在非接触式力学图谱测量中展现出高空间分辨率的应用前景26.

共聚焦布里渊显微技术是一种新兴的光学成像方法，能够以亚细胞分辨率实现对组织生物力学特性的无接触定量检测27,28,29,30。布里渊显微技术基于自发布里渊光散射原理，即入射激光与材料内部由热涨落引发的声波之间相互作用。因此，散射光会产生频率偏移，称为布里渊频移 ωR，其关系由以下公式给出31：

布拉格频率公式，ωB 方程；对波晶体学研究至关重要。 (1)

此处，静力平衡示意图，ΣFx=0，展示受力平衡，物理学教育概念。 是材料的折射率，λ 是入射光的波长，M' 是纵向模量，ρ 是质量密度，θ 是入射光与散射光之间的夹角。对于同类型的生物材料，折射率与密度的比值 静力平衡方程中的数学符号 n/√ρ。 近似为常数28,32,33,34,35,36。因此，布里渊频移可直接用于评估生理过程中相对的力学变化。布里渊显微技术的可行性已在多种生物样品中得到验证29,37,38。最近，通过将布里渊显微镜与载台式培养系统结合，已实现了对活体鸡胚的延时力学成像39。本方案详细描述了样品制备、实验实施以及数据后处理与分析的步骤。我们希望这一工作能够推动非接触式布里渊技术在胚胎发育与出生缺陷中生物力学调控研究中的广泛应用。

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方案

该实验方案已获得韦恩州立大学机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 实验准备

  1. 使用70%乙醇溶液清洁和灭菌剪刀与镊子。同时，准备好一次性移液管和注射器。
  2. 通过将3.595 g NaCl加入495 mL去离子水中来配制洗涤培养基。然后向培养基中加入5 mL青霉素-链霉素溶液（5 U/mL）。用该洗涤培养基填充一个100 mm的培养皿，并将其预热至37 °C。
  3. 根据图1所示的整体构型准备培养皿。
    1. 取一片滤纸，将其裁剪成约17 mm × 20 mm的矩形，并切除四个角。在滤纸中央制作一个约7 mm × 10 mm的中空区域，用于固定胚胎（图1，左图）。
      NOTE：胚胎的收集方法见步骤2。
    2. 将一个市售环形支撑圈（Φ = 1英寸，参见材料表）与一层柔性薄膜（如石蜡膜）结合，确保该柔性薄膜也具有一个中空中心。此带膜的支撑圈将用于固定带有胚胎的滤纸。
    3. 最后，将准备好的支撑圈放入一个35 mm培养皿中（图1，右图）。
      ​NOTE：滤纸用于通过将其放置在膜上并使胚胎位于中央中空区域来固定和支撑已提取的胚胎（将在步骤2中详细说明）。切除四个角是为了使滤纸适配外圈的尺寸（如果尺寸已匹配则无需切除）。使用35 mm玻璃底培养皿以利于激光束的传播。该培养皿具有一个内井（Φ = 23 mm），可用于盛装蛋清进行体外（ex ovo）培养。支撑圈的直径必须大于内井的直径，以便柔性薄膜能够覆盖内井（图1，插图）。滤纸的尺寸不受限制，可根据所选支撑圈和培养皿的尺寸进行调整。或者，可在培养皿底部预先涂覆一层琼脂糖（厚度：约1 mm）。使用刀片去除琼脂糖层中心部分，可形成一个与柔性薄膜中空区域形状相似的井，用于加载蛋清。一个关键点是，中空滤纸的四边需具有足够的宽度（> 5 mm），以确保胚胎能够牢固附着。

2. 提取与 体外 鸡胚培养

注意：此步骤根据先前发表的报告进行了修改40,41。

  1. 预培养后，从培养箱中取出鸡蛋，将其长轴朝下放置在蛋托盘上。用70%乙醇清洁蛋壳，确保覆盖整个表面，然后静置15分钟。
  2. 将鸡蛋短轴朝上握持，在底部敲裂蛋壳。将蛋内容物倒入洁净的100 mm培养皿中，如图2所示。握持和敲裂鸡蛋时，确保不要旋转鸡蛋。
  3. 使用移液器转移并收集约10 mL稀薄蛋清（即液态蛋清42）至15 mL离心管中，用于体外（ex ovo）培养。将收集的稀薄蛋清约0.9 mL注入培养皿的中央小室，如图3所示。填充过程应缓慢进行，避免小室内产生气泡。确保含蛋清的培养皿已预热至37 °C。
    注意：该培养皿将用于胚胎的体外（ex ovo）培养。在布里渊成像过程中将使用新制备的、含清洗液的培养皿（见步骤3）。
  4. 使用滤纸轻轻去除附着在胚胎上的浓稠蛋清（即黏稠蛋清），小心地将蛋清与卵黄膜分离，如图4所示。避免直接接触卵黄膜。
  5. 在完全去除浓稠蛋清后，小心地将滤纸贴附于卵黄膜上。确保胚胎的体轴与滤纸上中央矩形的长轴对齐。使用剪刀剪开滤纸周围的部分膜结构。
  6. 使用镊子，以倾斜方向轻轻将分离的滤纸从蛋黄上提起。将滤纸翻转，使胚胎背侧朝下（适用于倒置显微镜配置）。以倾斜方式，从长轴一侧开始，小心地将整个滤纸浸入盛有清洗液的100 mm培养皿中。
  7. 使用洁净的移液器沿滤纸表面平行喷射清洗液，以洗去残留的蛋黄。避免将清洗液直接喷射到膜上。
  8. 在彻底清除蛋黄后，小心地将滤纸从清洗液中取出，并用滤纸吸去边缘多余的液体。然后将带有胚胎的滤纸放置于培养皿中，确保胚胎背侧朝下，如图5所示。为保持湿度，可在培养皿内放置一张湿润的滤纸。
  9. 将培养皿转移至载物台培养箱中进行体外（ex ovo）培养。

3. 胚胎的布里渊测量

  1. 准备另一组培养皿，并加入预热至 37 °C 的洗涤液。
  2. 当胚胎发育至目标阶段时，将带有胚胎的滤纸转移至盛有洗涤液的培养皿中，并将培养皿放入布里渊显微镜的载台培养箱内（参见材料表）。
    1. 在进行布里渊测量之前，保存一张整个胚胎的明场图像作为参考。布里渊显微镜的详细配置此前已有描述30，并在结果部分进行了总结（图6）。
  3. 测量水和甲醇的布里渊信号，这些信号将在第4步的校准过程中使用。
  4. 调节入射激光功率和电子倍增电荷耦合器件（EMCCD，参见材料表）相机的曝光时间，以获得至少 10,000 计数的布里渊信号。以明场图像为参考，设定扫描范围和步长。通过二维平移台扫描胚胎，获取目标区域的布里渊图像。
    注意：水平扫描范围可根据明场图像确定，垂直（即深度）扫描范围可根据快速粗略扫描获得的信号强度确定。为避免对胚胎造成光损伤，入射激光功率应限制在 25 mW 以内，EMCCD 相机曝光时间设为 50 ms。为兼顾成像质量和采集时间，水平方向步长设为 2 µm，垂直方向步长设为 1 µm。
  5. 完成扫描后，小心取出带有胚胎的滤纸，用纸巾吸去多余的洗涤液，然后将滤纸重新放回盛有稀释蛋清的培养皿中，继续在载台培养箱内培养。
  6. 以固定时间间隔（例如 1.5 小时）重复步骤 3.2–3.5，以获取胚胎发育过程中的延时布里渊图像。
  7. 按照第4步后处理方法重建二维布里渊图像。

4. 布里渊图像重建

  1. 使用水和甲醇的布里渊信号校准布里渊光谱仪，以计算光谱仪的自由光谱范围（FSR）和像素-频率转换比（PR）30。校准得到的FSR和PR值将用于计算胚胎在每个像素处的布里渊频移。
    注意：图7A展示了由EMCCD相机捕获的原始布里渊光谱。通过对光谱进行垂直求和，然后进行洛伦兹拟合，可以获得两个峰之间的距离Δd（图7B）。通过获取水的峰间距Δdwater和甲醇的峰间距Δdmethanol，可根据以下公式计算FSR和PR30： PR = 2·(ωmethanol-ωwater)/(Δdwater- Δdmethanol)，以及FSR = 2·ωwater + PR·Δdwater，其中在660 nm波长下，水的已知布里渊频移ωwater = 6.01 GHz，甲醇的ωmethanol = 4.49 GHz。
  2. 获取样品在每个像素处的布里渊信号的峰间距。基于校准后的FSR和PR计算布里渊频移：ωsample = 0.5 (FSR - PR x Δdsample)30，其中ωsample为样品的布里渊频移，Δdsample为布里渊信号的峰间距。
  3. 基于所有像素的布里渊频移重建二维布里渊图像。
    注意：为进行局部分析，可从获取的布里渊图像中选择感兴趣区域（例如神经板），并量化其力学性质。常用方法是计算所选区域的平均布里渊频移。

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结果

图6 展示了布里渊显微镜的示意图。系统采用660 nm激光器作为光源。在激光器输出端紧接放置一个光隔离器，以抑制任何背向反射光，同时使用中性密度（ND）滤光片调节激光功率。通过一对焦距分别为f1 = 16 mm和f2 = 100 mm的透镜L1和L2，对激光束进行扩束。半波片（HWP）和线性偏振器（偏振器1）用于调节照射到样品或校准材料（即水和甲醇）上的光束功率，该调节在偏振分束器（PBS）之后进行。为将激光聚焦至样品并收集背向散射光，采用一个数值孔径（NA）为0.6、放大倍数为40的物镜（OBJ2）。入射光与背向散射光通过四分之一波片（QWP2）调节偏振后，由同一偏振分束器（PBS）实现分离。类似地，OBJ1和QWP1用于将激光束引导至校准材料。布里渊信号通过单模光纤传输至布里渊光谱仪。43 用于分析。在光谱仪内部，一个柱面透镜（C1）将布里渊信号耦合至第一个VIPA（虚像相位阵列）标准具。第一个VIPA标准具的输出经另一个柱面透镜（C2）重新整形后，聚焦到掩膜1上，以滤除非散射的激光光。随后，布里渊信号由一个球面透镜（SL1）...

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讨论

胚胎的早期发育容易受到外界干扰的影响，因此在样品提取和转移过程中必须格外谨慎。一个潜在的问题是胚胎从滤纸上脱落，这可能导致卵黄膜收缩，从而在布里渊成像中产生神经板倾斜的人工假象。此外，这种收缩还可能中断胚胎的正常发育。为防止脱落，需特别注意几个关键步骤。首先，在步骤2.4中，必须彻底清除膜表面的蛋白层，残留的蛋白会阻碍膜与滤纸之间的正常粘附46,47。此外，在洗涤过程中，应将洗涤液沿膜表面平行方向喷洒。若液体流直接冲击膜表面，可能导致膜脱落甚至撕裂。同时，整个洗涤过程应在较短时间内完成（例如，<3 min），因为长时间浸泡也可能导致胚胎从滤纸上脱落。

在进行布里渊测量之前，需要将胚胎转移至含有洗涤介质的培养皿中。这是因为蛋清的布里渊频移与神经板组织非常接近，会导致图像对比度较差。布里渊成像通过点扫描方式获取，可能耗时较长，尤其是在处理大量扫描点时。在本方案中，扫描区域水平方向约为 400 µm，垂直方向小于 100 µm。为避免干扰胚胎的正常发育，总采集时间被...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由美国国立儿童健康与人类发展研究所（Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development）、美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助（项目编号：K25HD097288、R21HD112663）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 培养皿 FisherbrandFB0875713
二维电动载物台 Prior ScientificH117E2
35 mm 培养皿World Precision InstrumentsFD35-100
带载物台培养箱的布里渊显微镜N/AN/A该系统为根据参考文献30定制构建的布里渊显微镜系统
鸡胚蛋康涅狄格大学N/A
CMOS 相机ThorlabsCS2100M-USB
EMCCD 相机AndoriXon
乙醇Decon Laboratories, Inc.#2701
滤纸Whatman1004-070
用于鸡胚培养的孵育箱GQF Manufacturing Company Inc. GQF 1502 
环形圈ThorlabsSM1RR
显微镜主体OlympusIX73
NaClSigma-AldrichS9888
载物台培养箱Oko labsOKO-H301-PRIOR-H117
封口膜BemisPM-996
青霉素-链霉素Gibco15070-063
移液器Fisherbrand13-711-6M
剪刀Artman instrumentsN/A3件套微型剪刀 5
注射器BD305482
纸巾KimwipesN/A
离心管Corning430052
镊子DR InstrumentsN/A显微解剖镊套装 

参考文献

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组织力学布里渊显微成像胚胎发育力学成像体外培养组织刚度形态发生无创测量
监测鸡胚神经管闭合过程中组织的力学演变
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