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方法文章

利用光学相干弹性成像技术量化环境生物膜的弹性特性

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DOI：

10.3791/66118

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2024年3月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Theoretical and Applied Mechanics Program, Northwestern University, 2Civil and Environmental Engineering Department, Northwestern University, 3Mechanical Engineering Department, Northwestern University, 4Black & Veatch

本文内容

摘要

本文重点介绍了光学相干弹性成像（OCE）技术在快速、无损表征生物膜弹性特性方面的有效性。我们阐明了实现准确测量的关键OCE实施步骤，并提供了两种颗粒状生物膜的杨氏模量值。

摘要

生物膜是由微生物细胞及其自身产生的胞外聚合物（EPS）构成的复杂生物材料，形成高度有序的网络结构。本文详细介绍了针对生物膜弹性表征而定制的光学相干弹性成像（OCE）测量方法的实施过程。OCE是一种非破坏性光学技术，能够在高空间和时间分辨率下，对部分透明的软材料进行微观结构、形态以及黏弹性特性的局部成像。我们提供了一份全面的操作指南，详细说明了该技术正确实施所需的关键步骤，并介绍了从实验数据中估算颗粒状生物膜整体杨氏模量的方法，内容涵盖系统搭建、数据采集和后期处理。在讨论部分，我们深入探讨了OCE所用传感器的物理原理，并分析了OCE测量在空间和时间尺度上的基本限制。最后，我们展望了OCE技术未来可能的发展方向，以推动其在环境生物膜弹性测量中的应用。

引言

在废水处理和水资源回收中，附着生长反应器中的有益生物膜正被越来越多地用于促使微生物将有机物、氮和磷等不理想的污染物转化为易于从水中去除的稳定形态1。在这些系统中，生物膜表现出的功能（即生化转化）与其内部栖居微生物的多样性以及这些微生物所获得的营养物质密切相关2。因此，持续的生物膜生长可能对维持反应器功能的稳定性构成挑战，因为新生的生物膜可能改变其整体代谢过程、传质特性以及群落组成。尽可能稳定生物膜环境可防止此类变化的发生3。这包括确保营养物质的持续供应，并通过维持稳定的厚度来保持生物膜结构的稳定4。对生物膜的刚度和物理结构进行监测，将使研究人员能够深入了解生物膜的整体健康状况及其功能表现。

生物膜具有黏弹性特性5,6,7。这种黏弹性导致其在受到外部机械力作用时，会产生瞬时变形和缓慢的、与时间相关的变形。生物膜的一个独特之处在于，当其受到较大程度的形变时，其行为类似于黏性液体；相反，在受到微小形变时，其响应则类似于固体5。 此外，在小形变区域内，存在一个形变范围，使得生物膜表现出线性的力-位移关系5,6,7。在此线性范围内的形变最适合用于评估生物膜的力学特性，因为可获得可重复的测量结果。已有多种技术可用于量化该范围内的弹性响应。光学相干弹性成像（OCE）是一种新兴技术，正被应用于分析生物膜在线性范围（应变数量级为10-4-10-5）内的力学行为8,9。

迄今为止，OCE 最成熟的应用是在生物医学领域，该技术已被用于表征仅需浅表光学通路的生物组织。 例如，Li 等人利用 OCE 表征了皮肤组织的弹性特性10。其他研究者则表征了猪和人角膜组织的各向异性弹性特性，并研究了这些特性如何受眼内压的影响11,12,13,14,15,16。OCE 方法在生物膜研究中的一些优势在于其非破坏性，具有介观尺度的空间分辨率，无需任何样品制备，且检测速度快；该方法可提供物理结构 和弹性特性的共定位测量结果（如孔隙率、表面粗糙度和形貌）8,9,17,18。

光学相干弹性成像（OCE）方法利用相敏光学相干断层扫描（OCT）测量弹性波在样品中传播时的局部位移。OCT是一种低相干光干涉仪，可将样品位移的局部变化转化为光谱仪记录的光强变化。OCT技术还已被应用于生物膜研究，用于表征介观结构、三维孔隙分布以及生物膜的形变17,19,20,21。此外，Picioreanu 等人通过OCT截面形变图像的流固耦合逆向建模，估算了生物膜的力学特性22。

另一方面，光学相干弹性成像（OCE）测量结合逆向弹性动力学波建模，可获得弹性波在样品中的传播速度，从而实现对样品弹性与黏弹性特性的表征。本课题组已将OCE技术改进用于生物膜弹性与黏弹性特性的定量测量8,9,18，并在琼脂糖凝胶平板样品上通过剪切流变测量验证了该技术的准确性18。由于测得的弹性波速度与样品的弹性特性密切相关，OCE方法能够提供对生物膜特性的精确且可靠的估计。此外，弹性波振幅在空间上的衰减可直接关联材料中的黏性效应，从而反映其黏弹性特性。我们已报道了利用弹性动力学波模型对在旋转环形反应器（RAR）中生长于试片上的混合菌群细菌生物膜以及具有复杂几何结构的颗粒状生物膜进行的OCE黏弹性特性测量18。

光学相干弹性成像（OCE）技术也是用于黏弹性表征的传统流变学18的一种强大替代方法。流变学方法最适合具有平面几何形状的样品。因此，对于具有任意形状和表面形貌的颗粒状生物膜，无法在流变仪上进行准确表征8,23。此外，与OCE不同，流变学方法可能难以适用于实时测量，例如在流动池中进行生物膜生长过程中的测量24,25。

本文表明，利用光学相干弹性成像（OCE）测量表面波的频率无关波速，可在无需复杂模型的情况下表征生物膜的弹性特性。这一进展将使OCE方法更易于被更广泛的生物膜研究领域用于研究生物膜的力学性质。

图1展示了本研究中所用光学相干断层扫描（OCT）系统的示意图。该系统包含多种仪器，包括商用谱域相敏OCT系统、延迟发生器、函数发生器和压电换能器。OCT系统基于干涉原理工作，采用中心波长为930 nm的宽带光源。所采集的光强信号与样品中复杂的结构细节相关，经后处理单元分析后转换为样品的横截面图像——通常称为OCT图像。OCT成像深度取决于样品中由局部折射率变化引起的光散射程度，在生物组织和生物膜中的成像深度通常限于1–3 mm。由于样品中的光相位和干涉强度会受到运动调制，OCT可用于检测样品局部的位移。我们在光学相干弹性成像（OCE）方法中利用OCT对位移的高灵敏度，追踪样品中弹性波的稳态位移场。具体而言，函数发生器输出正弦电压以驱动压电换能器。该换能器随之产生周期性的伸缩运动。换能器的振荡位移通过位于其顶端的3D打印楔形探头，在样品表面施加正弦力，从而在样品中激发谐性弹性波。楔形探头与样品表面轻柔接触，确保在执行器从样品表面撤回后样品仍保持完整。为记录样品中的局部位移，系统在样品每个像素位置采集一系列时间间隔固定的相邻深度扫描。每个像素点连续扫描之间的光相位差与该点的局部垂直位移成正比。通过来自函数发生器的触发脉冲并在延迟发生器中进行延时，实现换能器位移与OCT系统扫描光学元件之间的同步。该同步步骤有助于获取样品局部光相位分布的一致横截面图像。这些图像与样品中局部垂直谐性位移成正比，被称为OCE图像。通过在不同换能器激励频率下采集OCE图像，可获得弹性波长和波速随频率的变化关系。所测得的波速数据通过弹性动力学模型进行分析，以确定样品的弹性特性。

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方案

1. 系统设置

  1. 收集系统组件，包括商用OCT系统（主机、支架、成像头和计算机）、波形发生器、换能器、延迟/脉冲发生器、带BNC接口的开关、BNC电缆和适配器、光学支架及夹具。
  2. 将函数发生器的同步信号连接至开关，再将开关的另一端口连接至延迟发生器。
  3. 将函数发生器的输出端连接至换能器引线。
  4. 将延迟发生器的输出端连接至OCT主机背面的触发通道。延迟发生器输出的信号为触发脉冲，用于启动OCT系统中扫描光学元件的运动。
  5. 开启系统各组件（OCT主机、计算机、函数发生器和延迟发生器），并启动OCT软件。
  6. 设置延迟发生器，向OCT主机发送晶体管-晶体管逻辑（TTL）触发信号。触发信号的具体要求请参考OCT系统使用手册。
  7. 将换能器置于OCT镜头下方。换能器一端粘附有3D打印的楔形尖端，作为弹性波的线源。

2. 图像采集

  1. 在OCT软件中，选择多普勒采集模式，并启用外部触发。
  2. 将颗粒状生物膜置于样品台上的透镜下方，并通过平移台将其移至换能器尖端处。确保换能器与样品表面轻柔接触，如图2所示。本研究使用了两种不同标称直径（4.3 mm和3.3 mm）的颗粒状生物膜（也称为颗粒污泥），以探究生物膜尺寸对其力学性能的影响。这些样品为商业获取。
    注意：本研究所用的样品台由带有多个半球形凹槽的3D打印塑料板构成。该样品台无法实现原位条件下的测量，因此在测量过程中需引入自然环境中的水，以防止样品干燥。
  3. 在样品监视窗口中，通过点击感兴趣线的起点与终点（即波传播路径）来设定扫描区域。使该线段与换能器尖端对齐，并确保其与尖端边缘垂直。
  4. 设定扫描区域内的像素数量和样品深度，并增加所记录的B扫描（二维横截面图像）数量，以提高OCE图像的信噪比。本文结果采用沿扫描路径1523个像素、深度方向1024个像素的设置，共采集50帧B扫描图像。
  5. 点击扫描 按钮并打开开关。此时OCT和OCE图像应出现在屏幕上。需在触发超时时间和扫描准备时间内激活开关。
  6. 确保参考光强处于最佳范围内，并将样品置于OCT显微镜物镜的焦区位置。正确聚焦的样品，其顶部边缘应接近图像的上边缘。
  7. 通过增加左侧色标条的上限值并降低右侧色标条的下限值，调节显示工具栏中OCE图像的相位等高线，以增强条纹对比度。
  8. 按下前面板上的正弦 按钮，配置函数发生器输出单一频率的正弦电压，并设定测量的起始激励频率。本研究的测量频率范围从4 kHz开始，至9.6 kHz结束。 按下Output键以启用输出端口。
  9. 设定适用于测量的合适电压值。该值应使条纹可见度最大化，同时避免相位卷绕。对于本研究中的生物膜及测量频率范围，通常5至10 V的电压可获得具有良好对比度的相位图。
  10. 点击记录 按钮，采集OCT和OCE图像。
  11. 在不同频率下重复测量，以获得具有不同波长（或条纹周期）的弹性波场横截面图像。

3. 图像分析

  1. 获取像素的物理尺寸。x 方向的物理像素尺寸通过将 x 方向的视场除以 x 方向的图像尺寸，再乘以因子 2 得到。 z 方向的物理像素尺寸通过将 z 方向的视场除以 z 方向的图像尺寸得到。视场和图像尺寸的数值存储在结构数组中，该数组包含图像信息，可通过 ThorImageOCT 软件包中 MATLAB SDK 提供的 OCTFileOpen 函数访问。
  2. 分别使用 OCTFileGetIntensity 和 OCTFileGetPhase 函数获取 OCT 和 OCE 矩阵，并对记录的帧取平均值。这些函数在 ThorImageOCT 软件包的 MATLAB SDK 中提供。
  3. 通过对图像进行二值化处理，并从上到下检测每一列中的白色像素，获取样品上边缘的像素位置。
  4. 使用 improfile 函数提取 OCE 图像沿该边缘的相位分布，并计算实际尺寸下的累积弧长。通过取连续点在 x 和 z 方向上缩放后差值的模的累积和来计算弧长。
  5. 利用 plomb 函数，对测得的 OCT 相位分布（即来自 OCE 图像）相对于累积弧长进行空间快速傅里叶变换。
  6. 确定频谱中峰值的位置。该位置代表波的空间频率。通过换能器激励频率（单位为 Hz）与空间频率（单位为长度的倒数）的比值计算波速（或相速度）。

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结果

本研究中使用的颗粒状生物膜（也称为颗粒污泥）为商业获取。颗粒是通过自聚集形成的球形生物膜，这意味着它们无需载体或生长表面即可形成26。 图3A展示了由于颗粒状生物膜内部局部折射率空间变化而产生的代表性横截面OCT图像。该生物膜的标称直径为3 mm。图像中可见一些靠近样品表面的内部结构，包括孔隙和空腔。随着样品深度增加，光学散射增强，导致OCT光源无法到达样品中心区域，因此中心区域无任何可辨识的信息。图3B展示了在换能器激励频率为5.1 kHz时样品的横截面OCE图像。图像中的局部对比度与样品中传播的弹性波引起的局部垂直位移相关。沿传播路径的条纹物理间距对应于弹性表面波的波长。该表面波在样品表面附近传播，其穿透深度接近波长。由于OCT光源在样品中的光学穿透能力有限，图像中无法观察到表面波位移的空间范围。沿弹性波传播路径的光学相位分布（图4A）用于确定表面波的空间频率。通过对接收到的...

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讨论

OCT 系统中可达到的成像深度由光源的光穿透能力决定，而穿透能力取决于光源的波长。此外，波长还决定了轴向分辨率。较长的波长能够更深入地穿透样品，但与较短波长相比，其轴向分辨率会降低。横向 分辨率则取决于系统的数值孔径和波长，较短波长可提供更高的分辨率。增大数值孔径会带来折衷，即限制了焦深29。空间分辨率受限于能够以足够信噪比检测到的最短弹性波波长。目前的 OCE 方法仅限于 0.5 mm9,30。尽管该技术受样品尺寸的限制，但它应适用于多种类型的生物膜。生物膜的形态，无论是颗粒状还是平坦状，均不会阻碍该技术的应用。样品的透明度也在决定穿透深度方面起着作用。高透明度的材料允许光完全穿过整个样品，使其难以被观察到；而不透明的样品则会阻碍光的穿透，导致其内部结构细节极少9,28。在本研究的背景下，毫米量级的穿透深度已足够。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢美国伊利诺伊州罗克福德的Aqua-Aerobic Systems, Inc.公司提供了本研究中所用的颗粒状生物膜。作者同时感谢美国国家科学基金会通过资助编号#210047和#193729提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D 打印样品支架
3D 打印楔形探头3 mm 宽度
BNC 电缆任意品牌
延迟发生器Stanford Research SystemsDG535DG535 数字延迟/脉冲发生器 
函数发生器Agilent Technologies33250A 80 MHz 函数/任意波形发生器
颗粒状生物膜Aqua-Aerobic Systems取自好氧颗粒污泥反应器（Aqua-Aerobic Systems, Inc.）
MATLABMathWorksRelease 2022a (MATLAB 9.12)
压电换能器ThorlabsPK2JUP1分立式压电堆栈，75 V，30.0 µm 位移
SD-OCT 系统ThorlabsGanymede II，LSM03 扫描透镜
ThorImageOCTThorlabs版本：5.5.5

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