Method Article

使用光学相干弹性成像量化环境生物膜的弹性特性

DOI:

10.3791/66118

⸱

March 1st, 2024

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1Theoretical and Applied Mechanics Program, Northwestern University, 2Civil and Environmental Engineering Department, Northwestern University, 3Mechanical Engineering Department, Northwestern University, 4Black & Veatch

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文重点介绍了光学相干弹性成像（OCE）技术在快速、无损地表征生物膜弹性特性方面的功效。我们阐明了用于精确测量的关键OCE实施程序，并提出了两种颗粒生物膜的杨氏模量值。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生物膜是复杂的生物材料，由包裹在自产细胞外聚合物物质 （EPS） 中的组织良好的微生物细胞网络组成。本文详细介绍了为生物膜弹性表征量身定制的光学相干弹性成像 （OCE） 测量的实施情况。OCE是一种无损光学技术，能够以高空间和时间分辨率对部分透明软材料的微观结构、形态和粘弹性进行局部映射。我们提供了一个全面的指南，详细介绍了正确实施该技术的基本程序，以及从收集的测量值中估计颗粒生物膜的体积杨氏模量的方法。这些包括系统设置、数据采集和后处理。在讨论中，我们深入研究了OCE中使用的传感器的基本物理特性，并探讨了OCE测量的空间和时间尺度的基本限制。我们总结了推进OCE技术以促进环境生物膜弹性测量的潜在未来方向。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在废水处理和水资源回收中，越来越多地使用附属生长反应器中的有益生物膜，使微生物能够将不需要的污染物（如有机物、氮和磷酸盐）转化为易于从水中去除的稳定形式1。在这些系统中，生物膜的涌现功能，即生化转化，与居住在其中的微生物的多样性以及这些微生物接受的营养密切相关2。因此，持续的生物膜生长可能会对维持一致的反应器功能构成挑战，因为新的生物膜生长可能会改变生物膜的整体代谢过程、传质特性和群落组成。尽可能稳定生物膜环境可以防止这种变化3.这包括确保营养物质的一致流动，并保持生物膜的结构稳定，厚度稳定4。监测生物膜的硬度和物理结构将使研究人员能够深入了解生物膜的整体健康状况和功能。

生物膜表现出粘弹性 5,6,7。这种粘弹性导致响应外部机械力的瞬时和缓慢、随时间变化的变形的结合。生物膜的一个独特之处在于，当它们发生重大变形时，它们会像粘稠液体一样做出反应。相反，当受到轻微变形时，它们的响应与固体5 相当。此外，在这个小变形区域内，存在一个变形范围，在该范围内，生物膜表现出线性力-位移关系5,6,7。该线性范围内的变形是评估生物膜力学特性的最佳选择，因为这些特性会产生可重复的测量结果。有几种技术可以量化此范围内的弹性响应。光学相干弹性成像 （OCE） 是一种新兴技术，适用于分析该线性范围内的生物膜（菌株量级为 10-4-10-5）8,9。

迄今为止，OCE最成熟的应用是在生物医学领域，该技术已被应用于表征只需要表面光学访问的生物组织。例如，Li 等人使用 OCE 表征皮肤组织的弹性特性10。其他作者描述了猪和人角膜组织的各向异性弹性特性以及它们如何受到眼内压的影响11,12,13,14,15,16。用于研究生物膜的OCE方法的一些优点是它是无损的，并提供中尺度空间分辨率，它不需要任何样品制备，并且该方法本身是快速的;它提供了物理结构和弹性特性（例如孔隙率、表面粗糙度和形态）的共同注册测量值8,9,17,18。

OCE方法使用相敏光学相干断层扫描（OCT）测量样品中传播的弹性波的局部位移。OCT是一种低相干光学干涉仪，可将样品位移的局部变化转换为用光谱仪记录的强度变化。OCT技术还被用于生物膜研究，用于表征中尺度结构、三维孔隙率分布和生物膜变形17,19,20,21。此外，Picioreanu等人使用OCT横截面变形图像的流固耦合逆模型估计了生物膜的力学性能22。

另一方面，OCE测量与逆弹动力波建模相结合，可以产生样品中弹性波的波速，从而能够表征样品的弹性和粘弹性。我们小组将OCE技术用于定量测量生物膜弹性和粘弹性8,9,18，并在琼脂糖凝胶板样品中的剪切流变测量中验证了该技术18。OCE方法提供了对生物膜特性的精确和可靠的估计，因为测量的弹性波速与样品的弹性特性相关。此外，由于材料中的粘性效应，弹性波振幅的空间衰减可以与粘弹性能直接相关。我们已经报告了在旋转环形反应器 （RAR） 中试样上生长的混合培养细菌生物膜和使用弹性动力学波模型18 的具有复杂几何形状的颗粒生物膜的粘弹性特性的 OCE 测量。

OCE 技术也是传统流变测量法18的有力替代方案，传统流变测量法用于粘弹性表征。流变测量方法最适合具有平面几何形状的样品。因此，具有任意形状和表面形态的颗粒状生物膜无法在流变仪上准确表征 8,23。此外，与OCE不同，流变测量方法可能难以适应实时测量，例如，在流通池中的生物膜生长过程中24,25。

在本文中，我们表明，表面波的频率无关波速的OCE测量可用于表征生物膜弹性特性，而无需复杂的模型。这一发展将使更广泛的生物膜社区更容易使用OCE方法来研究生物膜的力学特性。

图 1 显示了本研究中使用的 OCT 系统的示意图。该系统包含多种仪器，包括商用频谱域相敏OCT系统、延迟发生器、函数发生器和压电换能器。OCT 系统采用中心波长为 930 nm 的宽带光源，以干涉测量原理运行。收集到的光强度与样品中复杂的结构细节相关，在后处理单元中进行分析，然后转换为样品的横截面图像 - 通常称为OCT图像。OCT 成像深度取决于样品中光学散射的严重程度，该散射源于折射率的局部变化，并且在生物组织和生物膜中仅限于 1-3 mm。由于样品中的光学相位和干涉强度由运动调制，因此OCT可用于检测局部样品位移。我们利用OCE方法中OCT的位移灵敏度来跟踪样品中弹性波的稳态位移场。具体来说，函数发生器输出正弦电压来驱动压电传感器。反过来，换能器会随着振荡时间历史而拉伸和收缩。换能器的振荡位移通过换能器顶端的 3D 打印楔形尖端在样品表面产生正弦力，从而在样品中产生谐波弹性波。楔形尖端与样品轻微接触，使得在致动器从样品表面缩回后样品保持完整。为了记录样品中的局部位移，在样品中的每个像素处采集由固定时间延迟分隔的相邻深度扫描。每个像素点的连续扫描之间的光学相位差与同一点的局部垂直位移成正比。在OCT系统中，传感器的位移和扫描光学器件之间的同步是通过源自函数发生器并在延迟发生器中延迟的触发脉冲实现的。该同步步骤有助于获取样品中局部光学相位分布的一致横截面图像。这些图像与样品中的局部垂直谐波位移成正比，称为OCE图像。在不同的换能器驱动频率下采集OCE图像，以获得弹性波长和波速随频率的变化。使用弹性动力学模型分析测量的波速，以确定样品的弹性特性。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 系统设置

  1. 收集系统组件，包括商用 OCT 系统（基本单元、支架、成像头和计算机）、波形发生器、传感器、延迟/脉冲发生器、带 BNC 连接的开关、BNC 电缆和适配器、光学柱和夹具。
  2. 将函数发生器的同步信号连接到交换机。将交换机的另一个端口连接到延迟发生器。
  3. 将函数发生器的输出连接到换能器引线。
  4. 将延迟发生器的输出连接到 OCT 基本单元背面的触发通道。延迟发生器的输出信号是一个触发脉冲，用于启动OCT系统中扫描光学器件的运动。
  5. 打开系统组件（OCT 基本单元、计算机、函数发生器和延迟发生器）并启动 OCT 软件。
  6. 配置延迟发生器以将晶体管-晶体管逻辑触发信号发送到 OCT 基本单元。有关触发信号要求，请参阅 OCT 系统手册。
  7. 将换能器放置在 OCT 镜头下方。换能器的一端粘有一个3D打印的楔形尖端，用作弹性波的线源。

2. 图像采集

  1. 在 OCT 软件上，选择 多普勒采集模式 并启用外部触发器。
  2. 将颗粒状生物膜放在样品架中的透镜下方，并使用平移台将其移向换能器的尖端。确保传感器与样品表面轻轻接触，如 图 2 所示。我们使用了两种具有不同公称直径（4.3 mm和3.3 mm）的颗粒状生物膜（也称为颗粒状污泥）。这一选择是为了研究生物膜尺寸对其机械性能的影响。这些都是商业上获得的。
    注意:本研究中使用的样品架由具有多个半球形压痕的 3D 打印塑料板组成。该支架不允许在天然条件下进行测量。因此，我们在测量过程中引入了自然环境中的水，以防止样品干燥。
  3. 通过单击示例监视器窗口中目标线（波传播路径） 的起点和终点 来指定扫描区域。将这条线相对于换能器尖端居中，并确保它垂直于尖端的边缘。
  4. 指定沿扫描区域的像素数和样品深度，并增加要记录的B扫描（2D横截面图像）的数量，以提高OCE图像的信噪比。所呈现的结果使用沿扫描路径的 1523 像素和沿深度的 1024 像素获得。共进行了 50 次 B 扫描。
  5. 单击 "扫描 "按钮并打开开关。OCT 和 OCE 图像应显示在屏幕上。在触发超时时间和扫描准备时间内激活交换机。
  6. 确保参考强度在最佳范围内，并将样品放置在OCT显微镜物镜的焦点区域内。正确聚焦的样品的顶部边缘应靠近图像的顶部。
  7. 通过增加左侧颜色条的较高值并减小右侧颜色条的较低值，调整显示工具栏上 OCE 图像中的相位等值。这将增加边缘对比度。
  8. 通过按下前面板上的 正弦 按钮，将函数发生器配置为产生单频正弦电压，并指定测量的起始激励频率。本研究中的测量从 4 kHz 开始，到 9.6 kHz 结束。按输出键启用输出连接器。
  9. 为测量设置可接受的电压。该值应最大限度地提高条纹可见性，但也应避免相位环绕。对于本研究中的生物膜和测量的频率范围，5 到 10 V 之间的电压通常会产生具有良好对比度的相图。
  10. 通过单击 "录制 "按钮获取 OCT 和 OCE 映像。
  11. 在不同频率下重复测量，以获得不同波长（或条纹周期）的弹性波场的截面图像。

3. 图像分析

  1. 获取像素的物理大小。x 中的物理像素大小是通过将 x 方向的视野除以 x 方向的图像大小，然后乘以 2 倍来获得的。z 中的物理像素大小是通过将 z 方向的视场除以 z 方向的图像大小来获得的。视场和图像大小值与图像信息一起存储在结构数组中，可以使用 ThorImageOCT 包中 MATLAB SDK 中提供的 OCTFileOpen 函数进行访问。
  2. 分别使用 OCTFileGetIntensity 和 OCTFileGetPhase 函数获取 OCT 和 OCE 矩阵，并取记录帧的平均值。这些函数在 MATLAB SDK 的 ThorImageOCT 包中提供。
  3. 通过对图像进行二值化并从上到下检测每列的白色像素，获得样品顶部边缘的像素位置。
  4. 使用 improfile 函数提取 OCE 图像沿该边的相位分布，并计算实际尺寸的累积弧长。通过取 x 和 z 方向上连续点之间缩放差异范数的累积和来计算弧长。
  5. 使用 plomb 函数计算测量的 OCT 相位分布（即从 OCE 图像）相对于累积弧长的空间快速傅里叶变换。
  6. 确定峰在光谱中的位置。此位置表示波的空间频率。根据换能器激励频率（Hz单位）和空间频率（反长度单位）的比值计算波速（或相速度）。

Results

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在这项研究中，我们使用了商业上获得的颗粒状生物膜（也称为颗粒状污泥）。颗粒是通过自聚集形成的球形生物膜，这意味着它们不需要在其上生长的载体或表面26。 图3A 显示了由于颗粒生物膜中局部折射率的空间变化而产生的具有代表性的横截面OCT图像。生物膜的标称直径为 3 毫米。在图像中可以看到一些内部特征，包括靠近样品表面的孔隙和空隙。沿样品深度增加的光学散射会阻止OCT光源到达样品中心，从而使中心区域没有任何可辨别的信息。 图3B 显示了传感器激励频率为5.1 kHz时样品的横截面OCE图像。图像中的局部对比度与样品中传播的弹性波引起的局部垂直位移相关。条纹沿传播路径的物理间距对应于弹性表面波的波长。表面波在样品表面附近传播，其穿透深度接近波长。由于OCT光源在样品中的光学穿透有限，因此在图像中看不到表面波位移的空间范围。沿弹性波传播路径的光学相位分布（图4A）用于确定表面波的空间频率。通过快速傅里叶变换（FFT; 图4B）并选择FFT频谱幅度最大的频率。

选择足够幅度的函数发生器电压以产生在 OCE 图像中表现出最佳对比度的条纹图案至关重要。但是，应避免过大的电压，因为这可能导致OCE图像中的相位环绕，如 图5A所示。相位环绕的出现是因为测量中的光学相位差被限制在-π和π之间的间隔内。当相位超过这些限值之一时，它会折叠到相反的限值，从而产生不连续的相位分布。因此，出现了相位展开的需求，这带来了挑战，并可能带来潜在的不准确性。精确测量波的另一个要考虑的因素是OCE图像中存在的条纹数量。在 图5B所示的低换能器频率下，由于颗粒尺寸小，可能无法完全捕获表面波的完整振荡周期，并且FFT光谱可能会对空间频率（或反波长）产生错误的估计。空间频率估计的另一个误差来源是OCT影像中存在空间重叠的弹性波模式，例如表面波和体横波。这些波模式混合在一起，形成了复杂的干涉模式，可能难以分析。表面波以外的各种波模式的存在会在换能器附近引入干涉效应，具体取决于特定样品、激发频率和振幅。 图6 是以5.5 kHz激励频率获得的OCE图像示例，其中局部激发点附近的体横波干扰了表面波场。 图7A 描绘了与 图4A中观察到的衰减正弦波模式不同的相位分布，这归因于波模式的组合。因此，所得FFT表现出更宽的峰，如 图7B所示。同样的现象也可能发生在缺陷附近，如空隙或弹性/粘弹性特性有明显变化的区域。在这些区域中，由于入射波或表面波的干扰以及来自缺陷的散射波，局部位移场被修改。

我们计算了两种具有不同标称直径（4.3 mm 和 3.3 mm）的颗粒生物膜在 4.0 和 9.6 kHz 频率下的表面波的波速。波速图称为色散曲线。对于所使用的设置，每次色散测量大约需要 15 分钟。在选定的频率间隔内，OCE图像中存在多个正弦位移剖面周期，从而能够精确确定空间频率以及显着的相差。 图8 显示了获得的色散曲线。这些曲线表示每个样品中三个位置的平均色散曲线。表面波速接近一个恒定值，称为瑞利波速 cR，它与样品的剪切模量通过关系，

cR = （（0.862 + 1.14ν）/ （1 + ν）） x （G/r）1/2

其中，G 是剪切模量，r 是质量密度，ν 是泊松比27,28。它是恒定的，因为弹性波的穿透深度短于样品的直径。从本质上讲，弹性波以与杨氏模量28 的平方成正比的波速靠近样品表面传播。然而，由于测量噪声，波速在这个频率范围内并不完全恒定。对于较小的样本，我们取频率在6.0到9.6 kHz之间的波速的平均值，对于较大的样本，我们取4.0到9.6 kHz之间的波速的平均值。然后使用该平均波速来估计样品的杨氏模量。

我们假设样品由于其高含水量而不可压缩。因此，ν = 0.5。因此，对于不可压缩固体，cR 与 E = 3G 直接相关，其中 E 是样品27,28 的杨氏模量。图 8 中的虚线表示不同样品的瑞利波速。我们假设生物膜成分主要由水组成，密度为 1000 kg/m3。因此，对于标称直径为 4.3 mm 和 3.3 mm 的颗粒生物膜，计算出的颗粒生物膜的杨氏模量分别为 85 kPa 和 205 kPa。该测量证实了该技术能够辨别生物膜之间的机械性能差异。

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图 1:光学相干弹性成像设置。 此处使用的系统原理图如图所示。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 2:已安装的样品。 颗粒状生物膜位于样品架上，同时换能器与其轻轻接触。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 3:颗粒生物膜的 OCT 和 OCT 图像。 （A） OCT图像。（B）在5.1 kHz传播的表面波的OCE图像，显示出良好的条纹对比度。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 4:相位分布和 FFT。对于图3B所示的图像，（A）沿样品顶部边缘的相位差分布和（B）相位差分布的FFT显示窄峰。请点击这里查看此图的较大版本.

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图 5:颗粒生物膜的 OCT 和 OCT 图像。 （A） 以 5.1 kHz 传播的表面波的 OCE 图像，显示相位包裹。（B）以1.3 kHz传播的表面波的OCE图像，没有一个完整的周期。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 6:显示模式组合的 OCE 图像。 该图像来自样本的不同位置，说明了以 5.5 kHz 传播的波的模式组合。 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-results-7
图 7:相位分布和 FFT。对于图6所示的图像，（A）沿样品顶部边缘的相位差分布和（B）相位差分布的FFT显示出更宽的峰。请点击这里查看此图的较大版本.

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图 8:色散曲线。 两个不同大小的样本的波速以不同的频率显示，并带有标准偏差条。曲线平坦部分的相应瑞利波速绘制在顶部。 请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OCT系统中可达到的成像深度由光源的光穿透程度决定，这取决于光源的波长。此外，波长决定了轴向分辨率。较长的波长可以更深入地穿透样品，但与较短的波长相比，轴向分辨率会降低。另一方面，横向分辨率取决于系统的数值孔径和波长，波长越短，分辨率越高。增加数值孔径通过限制景深29 来引入权衡。空间分辨率被限制为以足够的信噪比可以检测到的最短弹性波长。目前的 OCE 方法仅限于 0.5 mm 9,30。虽然这种技术受到样品大小的限制，但它应该适用于各种生物膜类型。生物膜的形状，颗粒状或扁平状，不会抑制该技术。样品的透明度在确定穿透深度方面也起着重要作用。具有高透明度的材料使光能够穿过所有样品，使其无法被观察，而不透明的样品会阻碍光的穿透，从而产生关于其内部结构的最小细节9,28。在这项研究的背景下，毫米范围内的穿透深度就足够了。

这些测量的另一个可能问题是，在较大的样品中，尺寸不限制弹性波周期的数量，OCT显微镜的视场（FOV）可能是测量周期数的限制因素。对于此处的测量，FOV 限制为 9 mm x 9 mm;因此，长度超过9 mm的弹性波长无法在OCT显微镜中分辨。使用具有更宽视场的镜头将能够对更大的样品进行成像，从而在这些较低频率下产生更多的条纹。在更高的频率下也会出现挑战。对于本研究中的样本，超过10 kHz时，波会经历显着衰减，从而减小相位差分布的幅度，并使空间频率的确定复杂化。这种担忧可以通过增加函数发生器的电压来缓解，从而增加换能器的位移。然而，增加位移只是在某个点上有用，因为这最终会在相位包装9 中结束。或者，通过实现更高功率的光源来提高系统的灵敏度，可以抵消由较大位移引起的相位包裹，并有助于检测对较小激励的动态响应。更高的灵敏度有助于声学OCE方法的实施，这些方法具有非接触式负载的优势，但受高衰减的影响更深远31。

在对生物膜进行这些测量时，保持样品水分至关重要。干燥会导致硬度的不良增加，这无关紧要，因为重点是评估样品在其天然环境下的特性。我们没有研究光照诱导的干燥。然而，我们注意到，在整个测量过程中，自然环境中的水是定期添加的，在此期间，通过OCT图像监测样品形态，没有观察到明显的形态变化。此外，在定位探头和捕获OCE图像时，必须考虑OCT图像中识别的特征。沿波传播路径的异质性有可能使波场失真，因此应避免9.此外，保持与生物膜的温和接触至关重要，因为对样品的过度压力除了可能改变其机械特性外，还可能导致波场失真。最后，扫描区域必须垂直于波前，以确保从测量中准确确定谐波的空间频率。

对于某些频率，在两个样品中都观察到波速的显着变化，这可以归因于它们固有的异质性、该特定频率的波场以及传播路径的形态。我们之前表明，由于异质微观结构9，在切片颗粒生物膜上测量的波速曲线是不均匀的。因此，当在颗粒生物膜上采用这种技术时，必须在样品的多个位置进行测量，以得出平均表示。

关于离散曲线的一个重要观察结果是，它们对不同的样本量表现出不同的行为。对于较大的样品，曲线在整个测量范围内保持相对恒定。然而，对于较小的样本，波速呈上升趋势，频率增加，特别是在范围的较低部分。这种现象可以归因于较低频率下粘弹性效应的存在和弹性波导模式的产生。我们在之前的工作中使用更复杂的逆模型 8,9,18 解释了这些效应。

需要注意的是，在好氧颗粒系统中，生物质并不均匀地分布在整个反应器的高度上。在非曝气阶段，较大的颗粒往往会沉降在反应器底部。这种不均匀的分布导致不同尺寸的聚集体可以接触到不同数量的基质。因此，不同大小的聚集体表现出不同的群落组成。此外，由于有选择地去除多余的污泥，较大的颗粒往往在反应器中保留更长的时间，而较小的颗粒更容易被去除32。杨氏模量的明显差异表明生物膜组成、年龄和机械性能之间存在潜在联系。

总之，光学相干弹性成像（OCE）方法提供了一种快速且无损的方法来评估生物膜中的弹性波速。该方法克服了流变测量的局限性，并表现出与其他弹性成像技术相比的增强属性8,18。此外，它的适用性超越了颗粒生物膜，包括任何具有合适光学穿透深度和尺寸的部分透明样品，这些样品足够大，可以被系统分辨，包括水凝胶33、角膜34和皮肤35等例子。该方法的未来发展包括几个关键方面。首先，将谐波弹性波的频率提高到数百kHz范围将允许几微米的波长，从而实现类似尺度的空间分辨率。其次，通过将OCT系统的光功率从2 mW（电流）增加到20 mW，可以提高光学检测系统的信噪比。最后，我们将用非接触式声辐射压力源替换接触式谐波执行器。这一添加将促进非侵入性和非破坏性操作，并允许在其天然环境中询问生物膜样品。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢Aqua-Aerobic Systems，Inc.（美国伊利诺伊州罗克福德）提供本文研究的颗粒状生物膜。作者还感谢美国国家科学基金会通过奖项#210047和#193729的支持。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3D打印样品架
3D打印楔形尖端3毫米宽
BNC电缆任何品牌
延迟发生器斯坦福研究系统DG535DG535 数字延迟/脉冲发生器 
函数发生器Agilent Technologies33250A 80 MHz 函数/任意波形发生器
从好氧颗粒污泥反应器（Aqua-Aerobic Systems， Inc.） 获得的颗粒生物膜Aqua-Aerobic 系统
MATLABMathWorks版本 2022a （MATLAB 9.12）
压电传感器ThorlabsPK2JUP1分立式压电堆栈，75 V，30.0 µm 位移
SD-OCT 系统ThorlabsGanymede II，LSM03 扫描镜头
ThorImageOCTThorlabs版本：5.5.5

References

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