通过重复性缺血建立冠状动脉侧支循环生长的小鼠模型

摘要

本文介绍了一种研究小鼠出生后由重复性缺血诱导的冠状动脉侧支生长的方法，包括在左前降支动脉上手术植入气动阻断器、用于重复性缺血方案的自动化充气系统，以及评估侧支生长的潜在方法。

摘要

冠状动脉侧支循环是缺血性心脏病（IHD）中的一种天然旁路，因此多年来，冠状动脉侧支生长（CCG）一直是IHD潜在的治疗靶点，尤其是在CCG功能受损的2型糖尿病或代谢综合征患者中。然而，这一过程的研究仍不充分，部分原因在于缺乏可用于研究CCG的小鼠模型，尽管已有猪、狗和大鼠等其他动物模型被建立。小鼠模型可充分利用该物种丰富的遗传修饰工具，包括谱系示踪和基因调控（过表达或基因敲除），以阐明CCG的过程与机制，包括所涉及的信号通路和细胞类型。  因此，我们着手建立一种通过重复性缺血（RI）诱导CCG的小鼠模型，该模型通过短暂且重复地阻断左前降支动脉（LAD）实现。本文详细介绍了这一小鼠CCG模型，包括在LAD上植入气动阻断装置的RI手术操作、用于控制充气压力和时序的自动化压力驱动充气系统，以及RI方案的具体流程。该方法已支持发表了一项研究成果，揭示了RI诱导的CCG过程，表明在成年小鼠心脏的CCG中，出芽型血管生成可形成成熟的冠状动脉。

引言

缺血性心脏病（IHD）是美国最主要的死亡原因，每年有超过20万例冠状动脉旁路移植手术用于治疗该疾病¹。冠状动脉侧支是冠状动脉树分支之间的吻合支，可作为天然旁路，在阻塞部位下游为缺血组织重新供血²；然而，不同个体之间天然侧支网络的发达程度存在显著差异^3,4。患有IHD且冠状动脉侧支更丰富的患者在心脏事件中预后更好，包括梗死面积更小和死亡率更低。因此，冠状动脉侧支生长（CCG）已成为十多年来的治疗靶点^5,6,7。对于代谢综合征患者日益增多的现状，这一点尤其值得关注⁸，因为这类患者表现出较差的冠状动脉侧支形成能力⁹。然而，在冠状动脉侧支生长的过程和机制尚未被充分阐明之前，试图通过诱导CCG来治疗IHD很难取得成效。

冠状动脉侧支循环已在大型动物模型中得到研究，短暂且重复地阻断主要冠状动脉已被用于在猪¹⁰、狗¹¹和大鼠¹²中诱导冠状侧支血管生成（CCG）。然而，由于存在大量 readily available 的基因修饰小鼠品系，包括谱系示踪、基因特异性或细胞特异性转基因及基因敲除品系，小鼠CCG模型在研究CCG的分子和细胞机制方面具有更多优势。有趣的是，与人类不同，据报道小鼠本身不存在冠状动脉侧支^13,14，这使其成为研究冠状动脉侧支形成的理想模型。事实上，最近一项研究报告指出，在患有阻塞性动脉疾病的患者中，近一半（47%）缺乏侧支循环形成（Rentrop 0级）³；因此，对于本身侧支循环极少的患者而言，小鼠CCG模型具有重要的临床相关性。

因此，我们建立了一种由重复性缺血诱导的侧支血管生成小鼠模型，该模型采用可膨胀球囊阻断器置于左前降支动脉（LAD）上，并通过基于压力的定时自动充气系统进行控制。如近期一项研究报道所示，这种重复性缺血方案能够刺激侧支血管的生长¹⁴。该侧支血管生成小鼠模型将有助于深入理解侧支血管生成在细胞和分子水平上的机制，并可用于验证促进侧支血管生成的潜在靶点。

方案

所述动物实验均遵循《实验动物护理与使用指南》的规定，并已获得东北俄亥俄医科大学机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 手术准备

注意：对于RI实验方案，使用任一性别的C57BL/6小鼠，体重至少25 g。手术过程中始终采用无菌技术。

1. 设置
   1. 将所有工具在高压灭菌器或干热灭菌器中灭菌。使用环氧乙烷（EtO）对敏感材料和植入物（如封堵器、系线和聚乙烯导管）进行灭菌。
   2. 用70%乙醇擦拭所有区域，清洁手术区域。将所有器械和用品放置在无菌铺巾上，准备操作区域。参见 材料表 有关耗材的完整清单。
2. 小鼠插管
   1. 用3%异氟烷（氧气流速1 L/min）短暂麻醉小鼠，直至翻正反射消失。剃除胸部、背部中央及右耳后方的毛发，并彻底清除松散的毛发。按0.01–0.02 mg/kg剂量肌肉注射格隆溴铵。
   2. 用3%-4%异氟烷再次麻醉5分钟。将小鼠仰卧于斜面上，通过上切牙固定，使用钝头镊子将舌头移开。借助光纤光源和放大喉镜，迅速用20G套管针对小鼠进行气管插管。
   3. 将小鼠仰卧置于加热手术垫上，并将插管连接至含3%异氟烷的小动物呼吸机。通过观察双侧胸廓节律性起伏确认插管成功，通过夹捏足趾无反应确认麻醉深度足够。
3. 手术区域的准备
   1. 涂抹眼用软膏以防止眼睛干燥。
   2. 用聚维酮碘清洁剃毛区域，然后用70%乙醇单向擦拭一次。
   3. 在手术垫的心电图（EKG）电极接触点上涂抹电极膏，并用胶带将小鼠的四肢固定于其上。用无菌纱布覆盖小鼠下半身。
   4. 使用手术垫的软件界面监测手术过程中的呼吸频率、体温和麻醉深度。
4. 左胸开胸术与封堵器植入
   1. 将异氟烷浓度降至2%。使用剪刀在胸部正中线上做一道2-3 cm的切口，然后用弯头镊子轻轻分离胸部左侧的皮肤和肌肉层。图1A).
   2. 使用钝头镊子，轻柔地穿过胸壁制造开口以暴露心脏，通常位于第3肋间^rd 和 5^th 肋间肌
   3. 使用拉钩轻轻撑开肋骨以暴露心脏。用钝头镊子撕开心包膜，暴露心脏。找到左心耳（图1B）并尽可能可视化左前降支动脉（LAD）的基底部。
   4. 将8-0聚丙烯缝线穿过LAD下方的心肌组织。
      注意：入口与出口之间的距离应约等于阻断器的宽度，并且垂直于前降支（LAD）。
   5. 移除牵开器。使用尖头镊子，将阻断管末端从第二肋间下部穿出胸壁，并将阻断管拉出胸壁，直至阻断装置位于胸腔内心脏上方。
   6. 使用外科结将阻断器牢固地系在心脏上（图1C使封堵器位于心脏上但不压入其中。
   7. 使用按钮式充气装置在10 psi压力下短暂充盈阻断器（约10秒）图2检查心电图，确认充气期间是否存在ST段抬高，并尽可能目视确认心尖部是否出现苍白。根据需要调整缝线的位置或张力，以确认缺血状态。
5. 结束
   1. 用6-0聚丙烯缝线缝合肋骨边缘，插入胸腔引流管。排出胸腔内的空气和血液后，拔除胸腔引流管。在胸壁闭合的切口处涂抹2%利多卡因。
   2. 使用尖头镊子将封堵器导管经右侧肩部皮下穿行，从右耳后方皮肤引出。复位胸肌，并用6-0聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线缝合皮肤。图1D).
   3. 将小鼠翻转为俯卧位。在手术结束前至少30分钟，皮下注射酮洛芬，剂量为3 mg/kg（使用0.9%无菌生理盐水配制的1 mg/mL溶液）。
6. 锚定装置植入
   1. 使用小剪刀在背部中央的皮肤上做一个约1厘米的小切口，然后轻轻将皮肤与皮下脂肪和肌肉组织分离。
   2. 将封堵管导管穿隧道至背部正中切口处，引出体外，并穿入悬吊装置中。使用6-0缝线缝合耳部附近的小切口。
   3. 使用6-0聚丙烯缝线将系带固定于背部肌肉图1E用6-0缝线将皮肤缝合覆盖牵拉钮。
7. 恢复
   1. 一旦小鼠能够自主呼吸，即移除插管；将小鼠置于术后恢复用RI笼中（单只动物使用）； 图3在足部捏压反应恢复后，持续监测小鼠，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。将笼子置于加热垫上，直至小鼠恢复完全活动能力。
   2. 第二天，皮下注射3 mg/kg的酮洛芬作为第二剂。
   3. 在开始RI方案前，让小鼠休息5-7天。每天监测小鼠仪器装置的完整性，并根据需要更换笼具。由于小鼠在RI方案期间为单只饲养，应根据需要提供适当的环境丰富化措施。

2. 重复性缺血

1. 在RI方案的第0天，通过超声心动图检查阻断器的位置，方法如前所述¹⁵。观察阻断器充气期间心脏功能的下降情况。
2. 将小鼠的阻断器导管连接至RI充气系统（图4）。该系统将使阻断器以10 psi压力充气6分钟，每天4次，每次充气之间间隔3小时（图5）。
3. 经过17天的RI处理后，按照步骤2.1重新评估心脏功能。

3. 聚合物灌注与组织收获

1. 处死小鼠时，使用 3%–4% 异氟烷麻醉，并腹腔注射肝素（500 U/kg）。通过鼻罩以 2% 异氟烷持续给药至少 5 分钟，随后通过脚趾夹捏无反应确认麻醉深度足够。
2. 打开胸腔以暴露心脏和胸主动脉。使用 PE20 导管插管胸主动脉降部，并横断下腔静脉（IVC）以允许流出；用 1× PBS 逆行灌注心脏，直至从 IVC 流出的液体变澄清，随后灌注 3 mL 1% 利多卡因，再灌注 3 mL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS。在结扎器所处的确切位置对左前降支（LAD）进行永久性结扎。
3. 用放射显影试剂逆行灌注心脏，直至动脉系统完全充填。用止血钳夹闭 PE20 导管，使聚合物固化 90 分钟。在解剖显微镜下对心脏进行成像。

结果

在136只C57BL/6小鼠（包括雄性和雌性）中，肾动脉缩窄术（RI手术）的存活率为93.4%，其中80.9%的小鼠成功存活至整个17天的RI实验方案结束。

小鼠可逆性缺血（RI）方案的优化基于既往的动物RI模型^12,16，这些模型具有短暂的缺血发作，且不造成心肌永久性损伤。在手术过程中，可通过观察左心室心尖部明显的变白以及在阻断器充气时心电图出现ST段抬高来评估阻断器的功能，上述变化在阻断器放气后均恢复正常（图6）。术后恢复期结束后，在第0天可通过超声心动图再次检查阻断器功能，分别在阻断器充气前和充气期间进行评估。充气期间射血分数（EF）和缩短分数（FS）均下降，表明阻断器位置正确，且在充气状态下可引起缺血并导致心功能降低（图7A）。这些参数可在第17天再次评估；若在阻断器充气状态下，心脏功能在17天内有所改善（如

讨论

冠状动脉侧支循环是缺血性心脏病（IHD）患者的天然旁路。在针对血管生成的临床试验失败后¹⁷，促进冠状动脉侧支循环的发育可能成为这类患者更优的治疗策略。与源自血管生成、仅由单层内皮细胞构成的毛细血管不同，侧支循环是具有平滑肌细胞覆盖的成熟动脉。侧支循环可将血流重新供应至因阻塞性动脉病变而引起心肌缺血的区域。深入了解冠状侧支血管形成（CCG）的调控机制，对于开发治疗IHD的新靶点至关重要。

利用重复性缺血研究慢性移植物血管病（CCG）的大型动物模型已被证明具有重要价值^10,11,12，尤其是当采用自动化手段以减少变异并提高时间效率时¹⁸，但这类模型无法充分利用当前的遗传学技术。将此类CCG模型缩小至小鼠体型存在诸多挑战，但其带来的实际与科学优势十分显著：小鼠饲养成本更低、所需空间更小，同时可提供更为丰富的遗...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#5/45度镊子	Fine Science Tools	11251-35
1/4" 闭合式黄铜电动电磁阀	U.S. Solid	USS2-00054	充气系统
1/4" 开放式黄铜电动电磁阀	AceCrew		充气系统
1/4" 气动管路	‎China SNS Pneumatic Co.,Ltd	‎APU1/4-32.8ft	按钮装置
1/4" 插入式接头	RuoFeng	543Y	按钮装置
1/8" 黄铜管件	Edge Industrial		充气系统
两位气动电动电磁阀	U.S. Solid	USS- PSV00033	按钮装置
20G 血管导管	BD	381703
45度Castroviejo持针器	Roboz	RS-6421
6-0 聚乳酸羟基乙酸缝合线	DemeTECH	G176011B13M
6-0 聚丙烯缝合线	AD Sugical	XS-P618R11
70% 乙醇
8-0 聚丙烯缝合线	DemeTECH	PM19800, 65G0P
聚维酮碘	Purdue Products	367618150085
钝头剪刀	World Precision Instruments	500366
碳纤维箭杆			术后笼具；裁剪至12.5 cm
棉签（3"）	Puritan	872-PC DBL
Curity 纱布敷料（2x2英寸）	Cardinal Health	2146
Dipsey 旋转沉子	Water Gremlin		术后笼具
电极膏	Signacreme	17-05
格隆溴铵	Westward	0143-9679-01
Hartman 止血钳	Fine Science Tools	13003-10
异氟烷	Covetrus	29404
凯酚（酮洛芬）	zoetis	10004031
利多卡因（2%）	Covetrus	14583
MICROFIL（黄色）	Flow Tek	MV-122
微型按钮开关	Interactivia	E-SWC-PBM-PBS-105	按钮装置
微型空气压力调节器	PneumaticPlus	PPR2-N02BG-4	按钮装置
Mini-Colibri 弹簧牵开器	Fine Science Tools	17000-01
MiniVent 呼吸机	Harvard Apparatus	73-0044
阻断器			定制
八角手柄镊子	Fine Science Tools	11041-08
Ohan 啮齿类动物插管系统	BMR Supply	Ohan-201
4% 多聚甲醛 PBS 溶液	Santa Cruz	sc-281692
PE20 管路
PE50 管路
塑料旋转接头（单通道）	Instech	375/25PS	术后笼具
预混 PBS 缓冲液，10x	Roche	11666789001	稀释至1x
压力表	PIC Gauges	102D-158D-10/32	按钮装置
可编程数字插座定时器	BN-LINK	‎BND-60/SU105	充气系统
Puralube Vet 眼科软膏	Dechra	17033-211-38
带18200-07弹性体的牵开器	Fine Science Tools	18200-10 和 18200-11
啮齿类动物手术监测仪+	Scintica	900-0053-01
圆柄打结镊	Fine Science Tools	18026-10
快扣式 barrel 旋转接头（5号）	Eagle Claw	‎01032-005	术后笼具
直型持针器	Fine Science Tools	12060-01
束缚装置	Instech	PS62