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方法文章

从人多能干细胞分化出肠神经系统谱系

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DOI：

10.3791/66133

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2024年5月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 2Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco, 3Program in Craniofacial Biology, University of California, San Francisco

本文内容

摘要

从人类多能干细胞（hPSC）中诱导生成肠神经系统（ENS）谱系细胞，为研究ENS的发育与疾病以及再生医学应用提供了可扩展的细胞来源。本文详细描述了一种 体外 利用化学成分明确的培养条件从人多能干细胞分化出肠神经元的方案

摘要

人类肠神经系统（ENS）是一个由多种胶质细胞和神经元细胞构成的庞大网络，具有显著的神经递质多样性。ENS 控制肠道蠕动、酶的分泌以及营养物质的吸收，并与免疫系统和肠道微生物组相互作用。因此，ENS 的发育性或获得性缺陷可导致多种人类疾病，并可能参与帕金森病症状的发生。由于动物模型系统的局限性以及获取原代组织的困难，对人类 ENS 的研究面临重大的实验挑战。本文提供了一项详细的方案，用于高效 体外 利用定义明确的培养条件，从人多能干细胞（hPSC）诱导生成肠神经系统谱系。本方案在15天内将hPSC定向分化为肠源性神经嵴细胞，并在30天内获得多种功能性的肠神经元亚型。该平台为发育研究、疾病建模、药物筛选及再生医学应用提供了可扩展的资源。

引言

肠神经系统（ENS）是周围神经系统中最大的组成部分。ENS 包含超过 4 亿个位于胃肠道内的神经元，几乎控制着肠道的所有功能1对肠神经系统（ENS）发育、功能及其在肠神经病变中缺陷的分子机制的理解，需要获得可靠且真实的肠神经元来源。人类原代组织的获取受限，而动物模型在许多肠神经病变中无法重现关键的疾病表型。人类多能干细胞（hPSC）技术已被证明在提供所需细胞类型方面具有极大优势，尤其是对于那些难以从原代组织中分离的细胞类型，可实现无限供应。2,3,4,5,6,7. 本文详细介绍了逐步且稳健的方法 体外 从人多能干细胞（hPSCs）获取肠神经元培养物的方法。这些可扩增的hPSC来源培养物为发育研究、疾病建模和高通量药物筛选提供了新途径，并可为再生医学提供可移植细胞。

肠神经元谱系起源于胚胎发生过程中肠神经系统（ENS）发育通路的神经嵴（NC）细胞。在胚胎中，神经嵴细胞出现在折叠的神经板边缘。这些细胞增殖、迁移，并分化为多种不同类型的细胞，包括感觉神经元、施万细胞、黑色素细胞、颅面骨骼细胞以及肠神经元和胶质细胞8,9,10。细胞命运的决定取决于神经嵴细胞所来源的前后轴位置，即颅部神经嵴、迷走神经嵴、躯干神经嵴和骶部神经嵴。肠神经系统由迷走神经嵴和骶部神经嵴细胞发育而来，其中迷走神经嵴细胞因沿肠管全长广泛迁移并定植于肠道，构成了肠神经元的主体11。

从多能干细胞（PSCs）诱导神经嵴细胞（NC细胞）通常需要联合使用双抑制SMAD通路和激活WNT信号通路12,13。直到最近，所有NC细胞诱导方案均依赖于含有血清及其他动物源性添加物的培养条件。化学成分未定义的培养基不仅降低了NC细胞诱导的可重复性，也阻碍了发育机制的深入研究。为克服这些问题，Barber等14开发了一种在化学成分明确的培养条件下进行NC细胞诱导的方案，相较于依赖血清替代物（如KSR）的其他方法具有明显优势13,14。该方案通过更换基础培养基并优化Fattahi等先前提出的从人多能干细胞（hPSCs）诱导肠源性神经嵴细胞的流程而实现。这一改进后的体系构成了本文所呈现的hPSC分化方案的基础。该方案首先通过精确调控BMP、FGF、WNT和TGFβ信号通路以及添加视黄酸（RA），在15天内诱导生成肠源性神经嵴（ENC）细胞。随后，通过施加胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）进一步诱导获得肠神经系统（ENS）谱系细胞。所有培养基成分均为化学成分明确的物质，可在30至40天内稳定获得肠神经元培养物。

除了本文所述的单层细胞培养系统外，已有其他神经嵴诱导方法被开发出来，这些方法采用悬浮培养的类胚体15,16。研究表明，这些培养体系中的迁移细胞可表达神经嵴标志物，其中一部分代表迷走神经嵴。通过与原代肠道组织共培养，可富集这些体系中的肠源性神经嵴前体细胞。这些研究中使用的培养基包含多种因子的组合，如神经生长因子、NT3 和脑源性神经营养因子。目前尚不完全清楚这些因子如何影响肠神经元前体细胞的命运决定。要对单层培养与类胚体培养体系中的肠源性神经嵴诱导效率进行有效比较，还需更多数据支持。鉴于这两种策略的培养体系存在差异，应根据具体应用目的对每种方法进行考量和优化。

本文所述方案具有可重复性，我们及他人已使用不同的人多能干细胞（诱导性和胚胎性）系成功验证过该方案8,14,16。

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方案

1. 培养基制备

注意：本方案中提到的浓度均为培养基组分的终浓度。所有培养基均须在超净工作台中无菌条件下配制，并于4 °C避光保存。请在2周内使用完毕。

  1. 人多能干细胞维持培养基：将无饲养层人多能干细胞维持培养基添加剂（20 µL/mL）与其基础培养基混合。
  2. 培养基A：将骨形态发生蛋白4（BMP4；1 ng/mL）、SB431542（10 μM）和CHIR99021（600 nM）加入分化基础培养基中。
  3. 培养基B：将SB431542（10 μM）和CHIR99021（1.5 μM）加入分化基础培养基中。
  4. 培养基C：将SB431542（10 μM）、CHIR99021（1.5 μM）和视黄酸（RA，1 μM）加入分化基础培养基中。
  5. 神经嵴完全培养基（NCC培养基）：将FGF2（10 ng/mL）、CHIR99021（3 μM）、N2添加剂（10 μL/mL）、B27添加剂（20 μL/mL）、L-谷氨酰胺添加剂（10 μL/mL）和MEM非必需氨基酸（MEM NEAAs，10 μL/mL）加入神经基础培养基（neurobasal medium）中。
  6. 肠神经嵴细胞培养基（ENC培养基）：将GDNF（10 ng/mL）、抗坏血酸（100 μM）、N2添加剂（10 μL/mL）、B27添加剂（20 μL/mL）、L-谷氨酰胺添加剂（10 μL/mL）和MEM非必需氨基酸（MEM NEAAs，10 μL/mL）加入神经基础培养基（neurobasal medium）中。
  7. 乙二胺四乙酸（EDTA）1×：将500 mM EDTA（1000×）用PBS稀释至终浓度为500 μM。
    注意：除非另有说明，本实验方案中始终使用不含Ca2+和Mg2+的PBS。

2. 培养板的包被

  1. 基底膜基质包被培养板：迅速解冻一份500 μL的基底膜基质冻存液，加入50 mL预冷的DMEM:F12培养基中，使用50 mL血清移液管剧烈吹打使其充分混匀并稀释。用稀释后的基底膜基质溶液对培养板孔进行包被（每平方厘米100 μL）2 （每平方厘米表面积）后，在37 °C下孵育过夜。使用前吸除包被液。为防止基底膜基质凝胶化，此步骤应尽快操作，并使用冷的DMEM:F12培养基溶解冻存的基质 aliquot。
    注意：在解冻（置于冰上）和分装（试管置于冰上）过程中，应保持基底膜基质处于低温，以防止凝固。
  2. PO/FN/层粘连蛋白包被板：用 PBS 稀释 1000 倍浓缩液，配制 15 μg/mL 多聚鸟氨酸（PO）溶液。按每平方厘米 100 μL 的量将 PO/PBS 溶液加入孔中进行包被2 根据培养板表面积加入相应体积的PO/PBS，37 °C过夜孵育。次日，吸除PO/PBS，按每平方厘米100 μL的体积对孔进行包被。2 用含有2 μg/mL纤连蛋白（FN）和2 μg/mL层粘连蛋白的现配FN/层粘连蛋白/PBS溶液包被培养板表面。在37 °C孵育至少2 h后即可使用。使用前吸除FN/层粘连蛋白/PBS溶液。

3. hPSC 培养的维持

注意：所有细胞培养步骤均在加湿培养箱中，于 5% CO2 和 37 °C 条件下进行。

  1. 从hPSC培养物中吸除hPSC培养基，并加入新鲜培养基（每平方厘米200 μL）2 每隔一天更换一次培养基（按每平方厘米培养皿表面积计算），直至细胞集落融合度达到约80%。
  2. 传代时，吸除hPSC培养基，每平方厘米用100 μL PBS洗涤细胞2 的培养孔表面积。
    注意：必须使用 Ca2+ 和 Mg2+ 用游离的PBS洗涤细胞。
  3. 加入500 μM EDTA（每平方厘米100 μL）2 （按培养孔表面积计算）。更换培养板盖，通过倒置显微镜观察细胞，监测克隆边缘是否出现脱落（2–4 分钟）。
  4. 使用5或10 mL刻度吸管向每个孔中加入等体积的hPSC培养基，并通过反复吹打数次以机械法收获细胞。
    注意：EDTA 孵育的最佳时间取决于 iPSC 系。在脱离集落时避免剧烈吹打，以免导致集落过度解离和细胞死亡。当传代以开始分化培养时，将细胞与 EDTA 孵育的时间延长 1–2 分钟。
  5. 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。离心细胞（2分钟，290 × g） g，20-25 °C）并小心弃去上清液。
  6. 用适量的hPSC培养基重悬细胞，并转移至已包被基底膜基质的新培养板孔中。
    注意：常规人多能干细胞（hPSC）传代培养时，使用1:18至1:24的传代比例（1:18指将一个6孔板中单个孔的细胞消化后，取其中三分之一接种至一个全新的完整培养板中）。启动分化培养时，采用5:6的传代比例。
  7. 在5% CO₂条件下孵育2 和 37 °C。

4. 神经嵴诱导

注意：此步骤在示意图中表示如下 图1A当细胞融合度达到约80%时开始神经嵴（NC）分化。若按5:6比例传代，通常在1-2天内可达到此状态（见上文）。在第0天使用多能性且完全未分化的hPSC细胞启动NC分化。为获得高分化效率，细胞集落边缘应尽可能少含已分化细胞。当集落较大，或在倒置显微镜下观察到集落中心开始增厚或变暗时，应及时传代并接种hPSC用于分化。相较于接种细胞数量（该数值因细胞系不同可能在每平方厘米50,000至200,000之间波动），关注细胞融合度和形态更为可靠。2.

  1. 第0天，将hPSC维持培养基更换为含有1 ng/mL BMP4、10 μM SB431542和600 nM CHIR99021的A培养基（每平方厘米培养面积加入200 μL培养基）2 （单位为孔表面积）
  2. 第2天，细胞应达到100%汇合度。轻柔吸除用过的A培养基，加入含10 μM SB431542和1.5 μM CHIR99021的B培养基（每平方厘米培养面积加入200 μL培养基）2 （单位为孔表面积）
    注意：在神经嵴诱导过程中，随着细胞培养的生长，细胞可能会从底层单层脱落。为避免细胞过度丢失，应轻柔地从孔板一侧移除旧培养基并添加新鲜培养基。
  3. 第4天，再次使用培养基B对细胞进行换液（每平方厘米培养面积加入200 μL培养基）2 （单位为孔表面积）
  4. 第6天，将培养基B更换为含有10 μM SB431542、1.5 μM CHIR99021和1 μM视黄酸的培养基C（每平方厘米加入400 μL培养基）2 （单位为孔的表面积）
  5. 第8天和第10天的喂养操作同第6天。

5. ENC 类球体的形成

注意：此步骤在图1B中以示意图形式表示。

  1. 第12天，轻柔吸除C培养基，并用每平方厘米100 μL的PBS洗涤细胞2 的培养孔表面积。加入相同体积的细胞解离溶液，于5% CO₂条件下孵育30分钟2 和 37 °C。
  2. 将细胞解离溶液与含有10 ng/mL FGF2、3 μM CHIR99021、10 μL/mL N2添加剂、20 μL/mL B27添加剂、10 μL/mL L-谷氨酰胺添加剂和10 μL/mL MEM NEAA的NCC培养基等体积混合进行稀释。使用血清移液管收集单细胞悬液，并转移至15 mL锥形管中。
  3. 离心细胞（2 分钟，290 x g，20–25 °C）并小心弃去上清液。
  4. 使用10 mL血清移液管，加入12 mL（用于完整的6孔板）NCC培养基，并通过机械吹打1–2次彻底重悬细胞。将细胞悬液转移至超低吸附培养板中。
    注：约 10 cm2 将ENC单层细胞重悬于2 mL NCC培养基中，并转移至超低吸附培养板的一个孔内。此操作相当于将一个完整的6孔神经诱导培养板中的细胞全部转移至一个完整的6孔超低吸附培养板中。
  5. 第14天，轻轻摇晃培养板，使小球体聚集于每孔中央。使用1000 μL移液器，沿每孔边缘缓慢以环形方式吸除用过的NCC培养基，注意避免吸走悬浮的球体。
  6. 用原始体积的NCC培养基喂养细胞。

6. 外胚层神经诱导

注意：此步骤在图1B中以示意图形式表示。

  1. 第15天，采用与第14天相同的技术，轻柔地移除培养基，并用PBS洗涤类球体。尽可能去除PBS，避免损伤类球体。
  2. 加入细胞解离溶液（每cm2孔表面积加入100 μL），在5% CO2、37 °C条件下孵育30分钟，将类球体解离为单细胞。
  3. 使用10 mL血清移液管，向每孔加入等体积的ENC培养基（含10 ng/mL GDNF、100 μM抗坏血酸、10 μL/mL N2补充剂、20 μL/mL B27补充剂、10 μL/mL L-谷氨酰胺补充剂和10 μL/mL MEM非必需氨基酸，在Neurobasal培养基中配制），通过2–3次机械吹打破碎残留的类球体。将细胞转移至50 mL锥形管中。
    注意：避免因强力吹打或使用尖端开口较小的移液管而造成过度剪切应力和细胞死亡。
  4. 离心细胞（2分钟，290 × g，20–25 °C），小心弃去上清液。使用10 mL血清移液管加入约5–10 mL ENC培养基，上下吹打1–2次，彻底重悬细胞。
  5. 使用台盼蓝染色及细胞计数方法（如血细胞计数板）测定活细胞浓度。
    警告：台盼蓝为疑似致癌物，请小心操作并妥善处理废弃物。
  6. 加入足够体积的ENC培养基，使接种密度约为每mL 1,000,000个细胞，每cm2表面积接种约300,000–400,000个活细胞。吸除孔板中FN/层粘连蛋白/PBS溶液。
    注意：根据计划对肠神经元（EN）培养物进行的检测选择合适的板型，因为此步骤为本方案中的最终传代步骤。肠神经元前体细胞可在第15天冻存。使用细胞解离溶液解离类球体后，将前体细胞以约5 × 106个细胞/mL的密度重悬于冻存液（如10% DMSO或Stem-cellbanker）中。需要时，在含5 μM Y-27632 ROCK抑制剂的温热ENC培养基中快速解冻。将细胞接种至目标板型中，数小时后更换为新鲜ENC培养基。
  7. 轻柔地将细胞加入PO/FN/层粘连蛋白包被的孔中。避免气泡滞留在细胞悬液下方，防止细胞无法附着于PO/FN/层粘连蛋白包被表面，尤其是在使用孔径较小的板（如384孔板）时。否则可能导致细胞死亡。
  8. 每隔一天使用ENC培养基（每cm2孔表面积200 μL）换液，持续至第30–40天；此后降低换液频率（每周一次或两次），但加倍换液量（每cm2孔表面积400 μL）。
    注意：此操作至关重要，因为频繁更换培养基可能促进神经元培养物从孔表面脱落。为前瞻性防止脱落，尤其是长期培养时，建议每周在ENC培养基中补充纤连蛋白（FN，2 µg/mL）和层粘连蛋白（laminin，2 µg/mL）。

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结果

该方案提供了一种在化学成分明确的培养条件下，由人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肠神经嵴及肠神经元的方法（图1A- B）。高质量神经元的生成依赖于高效的肠神经嵴诱导步骤。可通过观察游离球体的形态来直观评估，这些球体应呈圆形、表面光滑，直径约为0.1–0.4 mm，如图所示。 图1C这些类球体还应表达神经嵴标志物SRY-盒转录因子10（SOX10）。17,18，如图所示 图1D在肠神经元诱导阶段，神经突起最早可在第25-30天可见图1E）。然而，在分化效率较低且含有不期望的间充质细胞污染的情况下，这一过程可能会延迟。人类肠神经系统由表达不同神经递质的多种神经元组成。这种异质性在体外分化模型中得以重现。 体外 根据所提供的方案，可通过细胞...

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讨论

此处所述的分化方案提供了一种可靠的方法 体外 在30-40天内从人多能干细胞获得肠神经元的方法（图1E) 以及在较老的培养物中表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和 SOX10 的肠胶质细胞> 第55天13,14,19,22这些神经元和胶质细胞是通过将人多能干细胞（hPSCs）逐步分化为迷走神经和肠神经嵴细胞，进而诱导为肠神经元和胶质细胞前体而获得的。13,14神经嵴细胞表达神经嵴标志物，即转录因子 AP-2 alpha 和 AP-2 beta，分别为 TFAP2A 和 TFAP2B21我们先前已证明，CD49 可作为标记物用于指示人多能干...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了加州大学旧金山分校（UCSF）突破性生物医学研究计划和桑德勒基金会的资助，以及美国出生缺陷基金会资助项目（编号：1-FY18-394）、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（1DP2NS116769-01）、NIH主任创新者奖（DP2NS116769）（授予F.F.）以及美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所资助项目（R01DK121169）（授予F.F.）。H.M. 获得了拉里·L·希尔布洛姆基金会博士后奖学金、NIH T32-DK007418 博士后奖学金以及加州大学旧金山分校（UCSF）突破性生物医学研究计划独立博士后奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗坏血酸Sigma-AldrichA5960
B27添加剂（无血清，不含维生素A）Gibco12587-010
基底膜基质，GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R&D systems314-BP
细胞培养离心机Eppendorf，型号 5810R02262501
细胞解离液，AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021Tocris4423
锥形管USA scientific1475-0511, 1500-1211
分化基础培养基，Essential 6Life TechnologiesA1516401
DMEM/F-12 无谷氨酰胺Life Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
无饲养层hPSC维持培养基，Essential 8 Flex Medium KitLife TechnologiesA2858501
FGF2R&D systems233-FB/CF
纤连蛋白Corning356008
GDNFPeprotech450-10
血细胞计数板Hausser Scientific1475
人多能干细胞，H9 ESCWiCellRRID: CVCL_1240
具有湿度、温度和CO2控制的培养箱Thermo Fisher ScientificHerralcell 150i
倒置显微镜Thermo Fisher ScientificEVOS FL
层流罩Thermo Fisher Scientific1300系列 II级A2型
层粘连蛋白Cultrex3400-010
L-谷氨酰胺添加剂，GlutagroCorning25-015-CI
MEM非必需氨基酸Corning25-025-CI
多孔板，FalconBD353934, 353075
N-2添加剂CTSA1370701
Neurobasal培养基Life Technologies21103049
PBS（无钙镁）Life Technologies10010023
移液器吸头填充器EppendorfZ768715-1EA
移液器吸头USA scientific1111-2830
移液器Fisherbrand13-678-11E, 13-678-11F
POSigma-AldrichP3655
聚合物盖玻片底成像板，ibidiibidi81156
RASigma-AldrichR2625
SB431542R&D systems1614
台盼蓝染色液，0.4%Thermo Fisher Scientific15250-061
超低吸附板Fisher Scientific07-200-601
Y-27632二盐酸盐R&D systems1254

参考文献

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