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方法文章

环氧树脂包埋后关联光学与电子显微镜技术

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DOI：

10.3791/66141

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2024年1月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Public Technology Service Center, Fujian Medical University, 2The School of Pharmacy, Fujian Medical University, 3The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 4College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 5Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, 6NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, Fujian Maternity and Child Health Hospital, 7Institute of Neuroscience, Fujian Medical University, 8Fujian Key Laboratory of Molecular Neurology, Fujian Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍了一种使用荧光蛋白mScarlet进行Epon包埋后共聚焦光镜与电镜联用的详细实验方案。该方法能够同时保持荧光信号与超微结构的完整性，适用于多种生物学研究应用。

摘要

相关联的光学显微镜与电子显微镜技术（CLEM）是一种综合性的显微技术，结合了荧光显微镜（FM）提供的定位信息以及电子显微镜（EM）获取的细胞超微结构背景信息。CLEM 在荧光信号与超微结构之间进行权衡，通常情况下，超微结构的保存会牺牲荧光信号。与其他亲水性包埋树脂（如甲基丙烯酸缩水甘油酯、HM20 或 K4M）相比，Epon 树脂在超微结构保存和切片性能方面更具优势。此前，我们已证明 mEosEM 能够耐受四氧化锇固定和 Epon 包埋处理。利用 mEosEM，我们首次实现了 Epon 包埋后相关联的光学与电子显微镜成像，同时保留了荧光信号与超微结构。本文中，我们详细提供了电子显微镜样品制备、荧光显微镜成像、电子显微镜成像以及图像对齐的逐步操作流程。我们还优化了在电子显微镜成像过程中识别荧光显微镜所成同一细胞的步骤，并详述了荧光显微镜与电子显微镜图像之间的配准方法。我们相信，研究人员可在传统的电子显微镜实验室内，依据本新方案轻松实现 Epon 包埋后相关联的光学与电子显微镜成像。

引言

荧光显微镜（FM）可用于获取目标蛋白的定位与分布信息。然而，目标蛋白周围的环境信息会丢失，而这些信息对于全面研究目标蛋白至关重要。电子显微镜（EM）具有最高的成像分辨率，可提供多种亚细胞结构的细节。但EM缺乏对特定目标的标记能力。通过将FM获取的荧光图像与EM获得的灰度图像进行精确叠加，相关联的光镜与电镜成像技术（CLEM）能够整合这两种成像模式所获得的信息1,2,3,4。

CLEM 在荧光与超微结构之间存在权衡1。由于当前荧光蛋白的局限性以及传统的电镜（EM）样品制备流程，尤其是四氧化锇（OsO4）和疏水性树脂（如 Epon）的使用，超微结构的保存往往以牺牲荧光为代价5。OsO4 是电镜样品制备中不可或缺的试剂，用于增强电镜图像的对比度。与其他包埋树脂相比，Epon 在超微结构保存和切片性能方面更具优势5。然而，目前尚无任何荧光蛋白可在经过 OsO4 处理及 Epon 包埋后仍保留荧光信号6。为了克服荧光蛋白的这些局限性，发展出了包埋前 CLEM 技术，即在电镜样品制备之前完成荧光显微（FM）成像6。但包埋前 CLEM 的缺点在于荧光显微图像与电镜图像之间的定位匹配不够精确5。

相反，包埋后CLEM方法是在透射电镜样品制备完成后进行荧光显微成像，其配准精度可达6-7 nm5,6为了保留荧光蛋白的荧光特性，需使用极低浓度的OsO₄4 (0.001%)3 或高压冷冻（HPF）与冷冻置换（FS）电镜制样方法4,7 在使用后嵌入式CLEM时，曾因超微结构或电镜图像对比度受损而受到限制。mEos4b的开发极大地推动了该技术的发展，尽管所用包埋树脂为甲基丙烯酸缩水甘油酯。5随着mEosEM的发展，该蛋白能够耐受OsO₄4 染色与Epon包埋后，首次实现了Epon后包埋超分辨率CLEM，同时保留了荧光信号与超微结构6经mEosEM处理后，多种荧光蛋白可耐受OsO₄4 染色和Epon包埋已建立8,9,10,11这极大地推动了CLEM的发展。

Epon 包埋后 CLEM 技术包含三个关键方面。首先是荧光蛋白，其应在电镜样品制备后仍能保持荧光信号。根据我们的经验，mScarlet 优于其他已报道的荧光蛋白。其次是如何在电镜成像中定位荧光显微镜（FM）所成像的同一细胞。为解决这一问题，我们优化了该步骤的操作流程，使研究者能够轻松找到目标细胞。最后是荧光图像与电镜图像的对齐方法。本文详细描述了荧光图像与电镜图像之间的配准过程。在本实验方案中，我们在 VGLUT2 神经元中表达 mScarlet，并利用 Epon 包埋后 CLEM 技术证明 mScarlet 可靶向定位于次级溶酶体。我们提供了 Epon 包埋后 CLEM 的逐步操作细节，在不损害荧光信号和超微结构的前提下完成成像。

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方案

动物饲养和实验已获得福建医科大学医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。本方案的逐步操作流程见图1。

1. 样品制备

  1. 小鼠脑组织
    1. 购买转基因小鼠（参见材料表）以及用于小鼠基因型鉴定的寡核苷酸引物（参见材料表）。
    2. 按照先前发表的方案12,13，灌注并从颅腔中完整取出小鼠脑组织。
    3. 使用10 mL固定液（参见材料表）在4 °C条件下过夜固定小鼠脑组织。
    4. 用0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）清洗固定液，每次10分钟，共清洗3次。
    5. 使用振荡切片机（参见材料表）将小鼠脑组织切成厚度为500 µm的切片。
    6. 在体视显微镜下使用解剖刀将荧光区域切割成小块（参见材料表）。
      注意：小块组织的体积不得超过1 mm3。
  2. 培养细胞
    1. 将HeLa细胞接种至6 cm细胞培养皿中，并在生长培养基（低糖Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]，添加10%胎牛血清[FBS]）中培养。
    2. 次日，按照转染试剂盒说明书，使用DNA转染试剂（参见材料表）将含有mScarlet的质粒转染入细胞。
    3. 转染48小时后，用胰酶消化转染后的细胞，并在1,000 × g条件下离心以获得细胞沉淀。该细胞沉淀称为样本块。

2. 透射电镜样品制备

  1. 固定
    1. 使用固定液（参见 材料表在 4 °C 下过夜。
    2. 去除固定液，用 0.1 M PB 缓冲液对样本块冲洗 3 次，每次 10 分钟。
  2. 四氧化锇（OsO₄）4染色
    1. 用四氧化锇固定样品块4 溶液（参见 材料表4 °C 下孵育 1 小时。
    2. 去除 OsO4 溶液并洗去 OsO₄4 溶液，ddH₂O 中处理 3 次，每次 10 分钟2O 来自样本块。
  3. 醋酸铀（UA）染色
    1. 使用2%醋酸铀（UA）溶液对样品块进行染色（参见 材料清单4 °C 下孵育 1 小时。
    2. 移除UA溶液，用ddH₂O冲洗样品块2O，每次10分钟，共3次。
  4. 梯度脱水
    1. 使用梯度乙醇对样品块进行脱水处理，步骤如下：50% 乙醇中 10 分钟，70% 乙醇中 10 分钟，80% 乙醇中 10 分钟，90% 乙醇中 10 分钟，随后在 100% 乙醇中脱水两次，每次 10 分钟。
    2. 用无水丙酮对样品块进行脱水处理，每次10分钟，共3次。
  5. 树脂渗透
    1. 用梯度树脂浸透样本块（参见 材料表：丙酮与树脂按3:1比例混合处理1小时，按1:1比例混合处理2小时，按1:3比例混合处理3小时。
    2. 用纯树脂替换，每次12小时，共3次。
  6. 树脂包埋
    1. 将样本块转移至胶囊中（参见 材料表使用牙签。
    2. 将纯树脂加入含有样品块的胶囊中，于60 °C烘箱内聚合14–16小时。

3. 用金纳米颗粒包被盖玻片

  1. 盖玻片清洗
    1. 用清洗缓冲液（参见材料表）在 142 °C 下清洗盖玻片 2 小时。
    2. 用 ddH2O 漂洗清洗缓冲液，每次 10 分钟，重复 3 次。
    3. 小心将盖玻片转移至含有无水乙醇的烧杯中，过夜孵育。
    4. 在洁净台中将盖玻片晾干数分钟。
  2. 用金纳米颗粒包被盖玻片。
    1. 使用玻璃胶将载玻片固定在台式离心机（参见材料表）旋转中心位置。
    2. 使用便利贴将盖玻片固定在载玻片中央。
    3. 在盖玻片上加入 75 µL 的 1% Pioloform 溶液（参见材料表）。
      注意：我们也测试了 Formvar（参见材料表），效果良好。
    4. 在 1,360 × g 条件下离心 3 分钟（图 2A），在盖玻片表面形成一层薄薄的 Pioloform 膜。
    5. 在室温下用 250 µL 的 0.1% 多聚赖氨酸（参见材料表）孵育盖玻片表面 1 小时（图 2B）。
    6. 用 ddH2O 冲洗，并将盖玻片晾干数分钟。
    7. 将 80 nm 金纳米颗粒（参见材料表）用 ddH2O 稀释至 25%（v/v，OD600 = 0.07）（参见材料表），超声处理 15 分钟。
    8. 在室温下用稀释后的金纳米颗粒孵育盖玻片表面 1 小时（图 2C）。
    9. 用 ddH2O 冲洗，并将盖玻片晾干数分钟。
      注意：盖玻片在包被 Pioloform 和金纳米颗粒后 2 周内使用效果良好，但我们建议包被后立即使用。

4. 超薄切片

  1. 将样品块表面修整成直角梯形。使用超薄切片机（见材料表）和金刚石刀（见材料表）切割厚度为100 nm的切片。从切片条带中分离出单个切片，并将其漂浮于水浴中。
  2. 在镀有金纳米颗粒的盖玻片中央滴加一滴ddH2O。用样品环捞起切片，将样品环倒置在水滴表面。移除样品环，使切片留在水滴表面。
  3. 将盖玻片在空气中干燥数分钟。用记号笔在盖玻片的另一侧围绕切片位置画出一个环形标记。

5. 光学显微镜成像

  1. 荧光恢复
    注意：工作流程如图3A所示。
    1. 在盖玻片上的超薄切片上加入10 µL封片缓冲液（见材料表）。将一块新的洁净盖玻片置于封片缓冲液上。
      注意：封片缓冲液的关键成分为DABCO，用于恢复荧光蛋白的荧光信号。这对荧光恢复至关重要。
    2. 将这两片盖玻片连同超薄切片一起放入成像室（见材料表）。确保画有环形标记的盖玻片位于上方。
  2. 采集导航图。
    1. 在倒置荧光显微镜的明场成像模式下，利用所画的环形标记定位切片（见材料表）。移动至切片的一个角落，打开白光光源，拍摄明场图像。
    2. 关闭白光光源，开启激光（561 nm），对同一视野（FOV）采集荧光图像。
    3. 关闭激光，移动至相邻视野，确保两个视野之间有10%的重叠区域。采集第二个视野的明场图像和荧光图像。
    4. 重复此操作，直至覆盖整个切片区域。记录成像路径，以便后续拼接视野。
      注意：为获得更高图像质量，建议使用共聚焦显微镜。
  3. 成像目标细胞。
    1. 利用导航图快速定位目标细胞。开启激光（561 nm），对目标细胞连续采集300帧荧光图像，然后关闭激光。
    2. 开启白光光源，连续采集明场图像（约100帧）。
    3. 移动至下一个目标细胞。

6. 透射电镜成像前准备

注意：该工作流程如图3B所示。

  1. 将超薄切片转移至载网。
    1. 用去离子水（ddH2O）装满一个玻璃瓶。
    2. 从样品室中取出盖玻片，用镊子将两片盖玻片分开。夹住带有切片的盖玻片，洗去封片缓冲液，并在空气中自然干燥。
    3. 使用单面刀片在超薄切片周围划出一个#形刻痕，并在#的每个角滴加10 µL 12%的氢氟酸（见材料表）。然后缓慢将盖玻片放入水中。
      注意：氢氟酸可与玻璃发生反应，有助于将火棉胶膜从盖玻片上分离。氢氟酸具有毒性，必须在通风橱内佩戴手套操作。若接触皮肤，需立即就医。
    4. 使火棉胶膜与超薄切片共同漂浮于水面。将一个未镀膜的载网置于切片上方，使切片位于载网中央并被其捕获。
    5. 用石蜡膜（见材料表）覆盖载玻片，用镊子夹取带有火棉胶膜的载网，于室温下空气中干燥。
  2. 切片染色
    1. 使用2%醋酸铀（UA）和Sato三重醋酸铅对切片进行染色。具体操作细节请参考已发表的实验方案2。

7. 图像分析

  1. 拼接导航图。
    1. 找到原始数据的位置。打开软件 ImageJ（参见 材料表）以拼接导航图。
    2. 点击 插件 | 拼接 | 网格/集合拼接 | （类型）网格：按列蛇形 | （顺序）上 & 左（根据拍摄顺序）| 设置切片大小 | 选择数据路径 | 设置文件名 | 勾选显示融合。观察结果，该结果是由多个不同视野的明场图像组成的导航图。
    3. 使用相同方法拼接荧光导航图。
  2. 将明场图像与荧光图像合并。
    1. 在软件 ImageJ 中，点击 文件 | 导入 | 图像序列，导入目标细胞的连续明场图像。
    2. 点击 图像 | 图像栈 | Z 轴投影 | 求和切片，获得连续明场图像的总强度投影（SIP）图像。
    3. 点击 编辑 | 反转，反转明场图像的 SIP 图像，使金纳米颗粒的信号呈现为亮白色斑点。
    4. 在 ImageJ 中，点击 文件 | 导入 | 图像序列，导入连续的荧光显微镜（FM）图像。
    5. 点击 图像 | 图像栈 | Z 轴投影 | 求和切片，获得连续 FM 图像的 SIP 图像。
    6. 点击 图像 | 颜色 | 合并通道，将明场 SIP 图像与 FM SIP 图像合并为一幅复合图像。
    7. 金纳米颗粒显示为绿色，荧光蛋白显示为红色。点击 图像 | 类型 | RGB 颜色，将复合图像的格式转换为 RGB。

8. 透射电子显微镜成像

  1. 将载网放置于样品台上，确保载网的切片面朝上。
  2. 利用导航图，通过超薄切片右侧梯形四个不同角的相对距离，在电子显微镜下大致定位相应细胞的位置。
  3. 利用金纳米颗粒确认目标细胞。
  4. 使用透射电子显微镜（TEM）在不同放大倍数下（4,200×、6,000× 或 8,200×）拍摄电镜图像（参见材料表）。

9. FM 图像与 EM 图像的配准

  1. 打开注册软件（参见材料表）。在搜索窗口中输入easyCLEMv014。点击easyCLEMv0以打开easyCLEMv0。点击图像/序列 | 打开，将电镜图像和复合图像导入软件面板中。
  2. 在EasyCLEMv0窗口中，点击2D (x,y,[T])，选择非刚性（2D或3D）作为配准模式。
  3. 在EasyCLEMv0窗口中，点击选择将被变换和调整大小的图像（通常为荧光图像）右侧的下拉框，选择Composite (RGB)color.tif。然后，点击选择不被修改的图像（通常为电镜图像）右侧的下拉框，选择EMimage. tif。
  4. 点击开始以启动配准。
  5. 在名为EMimage. tif的电镜图像窗口中，点击一个金纳米颗粒，将点1标记在该金纳米颗粒上。在名为Composite (RGB)color.tif的荧光图像窗口中，点击对应的金纳米颗粒，将点1标记在该金纳米颗粒上。
  6. 点击更新变换，以确认荧光信号与金纳米颗粒的电镜信号对齐。
  7. 在名为EMimage. tif的电镜图像窗口中重复上述操作，逐个匹配相同金纳米颗粒的荧光信号与电镜信号。
  8. 点击停止以完成配准。
  9. 图像对齐后，点击叠加图像，然后点击图像/序列 | 另存为，导出包含四个通道图像（红、绿、蓝、灰）的图像堆栈。
  10. 打开ImageJ，点击文件 | 打开导入叠加图像。点击图像 | 堆栈 | 堆栈转图像，将叠加图像拆分为四个通道图像。
  11. 点击图像 | 颜色 | 合并通道，将三个通道（红、绿、灰）的图像合并为一张复合图像。
  12. 点击图像 | 类型 | RGB颜色，将复合图像转换为CLEM图像。

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结果

既往研究已证明，mScarlet 可靶向溶酶体15。在本实验方案中，使用立体定位仪将表达 mScarlet 的腺相关病毒（rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA）注射至 Vglut2-ires-cre 小鼠脑的 M1 区（ML：±1.2，AP：+1.3，DV：-1.5）。按照上述方案操作后，最终的关联成像结果如 图 4A所示。利用金纳米颗粒（绿色点状结构）作为定位标记，可实现荧光显微镜图像与电镜图像的精确对齐。如电镜图像所示（图 4C、F），mScarlet 靶向定位于溶酶体，且溶酶体内部内容物具有异质性，这是次级溶酶体的典型特征。

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讨论

本文介绍的方案是一种通用的成像方法，可结合来自光学显微镜（LM）的目标蛋白定位信息以及来自电子显微镜（EM）的目标蛋白周围环境的结构背景信息6。受限于当前荧光蛋白的性能，广泛应用的方法是包埋前相关光学与电子显微镜成像技术（CLEM），即在电镜样品制备之前完成光学显微镜成像。几乎所有现有的荧光蛋白均可用于包埋前CLEM。然而，由于不可避免的形变和收缩，最终图像的精确对齐无法实现6。因此，包埋前CLEM所提供的信息仅能用于在电镜图像中核查经光学显微镜成像的同一细胞的超微结构。

本研究提供的方法是包埋后CLEM，即在电镜样品制备完成后进行光镜成像。由于电镜样品制备过程中化学固定引起的收缩不会影响最终图像的精确对齐。此外，由于光镜成像和电镜成像均在同一超薄切片上进行，并借助金纳米颗粒实现定位，最终图像的对齐可达到很高的精度。包埋后CLEM要求荧光蛋白在常规电镜样品制备后仍能保留荧光信号。此前，我们报道了首个可在Epon包埋后仍保留荧光信号的荧光蛋白mEosEM...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本项目受到国家自然科学基金（32201235，付志飞）、中国福建省自然科学基金（2022J01287，付志飞）、中国福建医科大学高层次人才科研启动基金（XRCZX2021013，付志飞）、中国福建省财政专项科学基金（22SCZZX002，付志飞）、国家卫生健康委员会非人灵长类生育调控技术评价重点实验室基金以及福建省妇幼保健院基金（2022-NHP-04，付志飞）的资助。我们感谢福建医科大学公共技术服务中心的周林英、吴敏霞、林曦和胡艳在电镜样品制备和电镜成像方面提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 M 磷酸盐缓冲液（PB）NaH2PO4 · 2H₂O + Na2HPO4 · 12H2O
0.2 M Tris-Cl（pH 8.5）上海源叶生物科技R26284
25% 戊二醛（GA）Alfa AesarA17876危险化学品
Abbelight 3D纳米洞察
丙酮SCR10000418
氢氧化铵J&K Scientific335213
BioPhotometer D30Eppendorf
盖玻片清洗缓冲液50 mL 氨水，50 mL 过氧化氢，250 mL H2O
盖玻片沃纳64-0715
DABCO Sigma290734危险化学品
DDSASPI 公司GS02827危险化学品
台式离心机WIGGENSMINICEN 10E
金刚石刀DiATOMEMX6353
DMP-30SPI 公司GS02823危险化学品
DNA转染试剂赛默飞世尔科技 2696953Lipofectamine 3000 转染试剂盒
Epon 812 SPI 公司GS02659危险化学品
乙醇SCR10009218
Fiji 图像 J美国国立卫生研究院
固定液 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
FormvarSigma9823
甘油SCR10010618
金纳米颗粒颗粒的790120-010
梯度树脂丙酮与树脂 3:1、1:1、1:3
氢氟酸SCR10011118
过氧化氢SCR10011218
ICY（https://icy.bioimageanalysis.org/about/）Easy CLEMv0 插件
成像室赛默飞世尔科技 A7816
大号明胶胶囊电子显微镜科学公司70117
封片液Mowiol 4-88，甘油，0.2 M Tris-Cl（pH 8.5），DABCO
Mowiol 4-88Sigma9002-89-5
Na2HPO4 ž12H2OSCR10020318
NaH2PO4 ž2H2OSCR20040718
NMASPI 公司GS02828危险化学品
寡核苷酸引物宝生物医学技术（北京）使用三条寡核苷酸引物同时检测 Vglut2-ires-Cre 和野生型。引物 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, 和 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, 旨在检测 Vglut2-ires-Cre。引物  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, 和 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, 旨在检测野生型。
振荡切片机LeicaVT1000S
四氧化锇SCRL01210302危险化学品
OsO₄4 溶液1% 四氧化锇 + 1.5% 钾4Fe (CN)6·3H2O
ParafilmAmcorPM-996
多聚甲醛（PFA）SCR80096618危险化学品
灌注缓冲液4% PFA+0.1 M PB
PioloformSigma63148-65-2危险化学品
聚-L-赖氨酸 Sigma25986-63-0
亚铁氰化钾（K4Fe (CN)6·3H2O SCR10016818
手术刀片默克S2771
手术刀柄默克S2896-1EA
体视显微镜OLYMPUSMVX10
转基因小鼠杰克逊实验室Vglut2-ires-Cre 小鼠（品系：129S6/SvEvTac）在标准条件下饲养（25 °C，12小时光照/12小时黑暗循环，自由饮水和进食。实验使用2周龄的雄性和雌性小鼠。–3个月大，体重范围20-30 g。  
透射电子显微镜（TEM）FEITECNAL G2
UA溶液（2% UA）水溶液
超薄切片机LeicaLEICA EM UC6
醋酸铀酰（UA）TED PELLA19481危险化学品

参考文献

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