勘误：急性高血糖联合短暂局灶性缺血诱导小鼠出血性转化模型

摘要

已发布更正：针对 急性高血糖联合短暂局灶性缺血诱导脑出血转化的小鼠模型。更新了实验方案部分。

摘要

本文更正了文章 10.3791/67371

方案

已发布更正声明，针对： 急性高血糖联合短暂局灶性缺血诱导出血性转化的小鼠模型。原“实验方案”部分已更新，原内容如下：

来源：

实验方案经江汉大学机构动物护理和使用委员会批准（JHDXLL2024-080），并依照中国疾病预防控制中心发布的实验动物伦理指南进行。本研究使用成年雄性 C57BL/6J 小鼠，体重为 21–26 g。所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 动物分组与急性高血糖诱导

1. 将小鼠饲养于江汉大学实验动物中心，环境温度控制在20–22 °C，相对湿度50%–55%，光照/黑暗周期为12小时交替，自由饮水和进食 广告 随意摄取
2. 将小鼠随机分为四组：假手术 + 生理盐水组（n = 12）、假手术 + 葡萄糖组（n = 12）、MCAO + 生理盐水组（n = 12）和 MCAO + 葡萄糖组（n = 20）。

2. 术前准备

注意：所有实验小鼠在手术前禁食 12 小时。

1. 术前、术中及术后给予全身镇痛（美洛昔康，5 mg/kg，皮下注射）以及切口部位局部麻醉（布比卡因，2 mg/kg，皮下注射） 。
2. 将所有手术器械、棉签和外科缝线置于121 °C、15 psi条件下高压灭菌30分钟。
3. 用75%乙醇擦拭手术平台及周围工作区域，并打开加热开关，将温度设定为37 °C。
4. 在麻醉诱导舱内使用3%异氟烷-20%氧气混合气体对小鼠进行麻醉，随后通过脚趾夹捏反射评估麻醉深度。
5. 将小鼠俯卧位置于手术平台上，迅速将其鼻部插入鼻罩，打开向鼻罩供气的气流，同时关闭麻醉诱导舱的气流。将异氟烷比例调整为2%，并将混合气体流速设定为0.4 mL/min以维持麻醉。
6. 在小鼠眼部涂抹眼用凝胶，以维持术中眼球湿润。
7. 使用动物专用电推剪剃除颈部区域毛发，再用消毒棉签交替涂抹碘伏和70%乙醇进行皮肤清洁与消毒。
8. 在颈部覆盖无菌纱布，并剪开一个开口以暴露手术区域。

3. MCAO 手术操作

注意：MCAO 采用改良的线栓阻塞法进行，如 Chiang 等人先前所述¹³。

1. 在手术前15分钟，向小鼠腹腔注射30%葡萄糖（7.2 mL/kg）或生理盐水。
   注：假手术+葡萄糖组和MCAO+葡萄糖组小鼠接受腹腔注射葡萄糖；假手术+生理盐水组和MCAO+生理盐水组小鼠接受腹腔注射生理盐水。
2. 使用手术刀沿颈部正中线做一长度为1.5 cm的横向切口。
   注：确保切口保持平直，以获得颈总动脉的最佳视野。
3. 使用手术镊分离皮下组织和浅筋膜。
4. 在浅筋膜下方，定位下颌下腺以及由三块肌肉构成的倒三角区域：位于气管正中线的胸骨舌骨肌；具有光泽白色肌腱部分的二腹肌后腹；以及胸锁乳突肌。
5. 在倒三角区域内进行钝性分离，以识别并游离左侧颈总动脉（CCA）。
6. 使用眼科镊分离紧邻CCA的迷走神经及血管周围的黏膜组织。在CCA上用5.0聚乙醇酸（PGA）可吸收缝线打一个活结，但暂不收紧缝线。
7. 沿CCA向上分离，可见一个"Y"形分叉，将CCA分为外颈动脉（ECA）和内颈动脉（ICA）。
8. 进一步分离该分叉处，充分暴露ECA和ICA。在分叉远端的ECA周围用5.0 PGA可吸收缝线绕圈并牢固结扎。
   注：确保永久结扎部位与血管分叉之间有足够的距离，以防在旋转ECA时缝线脱落。
9. 使用两个8 mm × 2 mm的带光面微动脉夹，暂时夹闭CCA和ICA，以阻断血流从CCA流向ICA。
10. 拉紧ECA远端和CCA上的缝线结，使ECA段伸直。
11. 使用显微剪刀在ECA上两个缝线结之间做一个小切口。
12. 将一根硅胶涂层的单丝缝合线（长30 mm，涂层硅胶部分3–4 mm）插入ECA。在靠近分叉处的ECA上用第二根5.0 PGA可吸收缝线绕圈并轻微打结，防止单丝缝线回退。
13. 在永久结扎线远端完全切断ECA，并移除ICA上的动脉夹。
14. 将缝线退至CCA分叉处，然后小心回缩并旋转ECA残端。调整缝线插入方向，缓慢将其插入约9.0–10.0 mm，从CCA分叉进入ICA，以阻塞大脑中动脉（MCA）。
15. 收紧ECA周围的第二根PGA可吸收缝线，并移除CCA上的动脉夹。
16. 使用5.0 PGA可吸收缝线分别缝合肌肉层和皮肤层。在伤口处涂抹双氯芬酸钠凝胶和莫匹罗星软膏。
17. 打开恢复笼的加热开关，将温度设定为37 °C。在闭塞后期间（60分钟）将小鼠置于恢复笼中。

4. 单丝缝线移除与再灌注

1. 在阻塞期即将结束前，按照先前所述方法重新麻醉小鼠。
2. 使用微型动脉夹夹闭颈总动脉（CCA）。
3. 将单丝线部分从颈内动脉（ICA）撤出，直至硅胶包被的尖端在 ICA 中可见。
4. 在硅胶包被尖端上方的 ICA 处放置另一枚微型动脉夹。
5. 完全撤出单丝线，并紧密结扎颈外动脉（ECA）残端。
6. 依次移除 ICA 和 CCA 上的微型动脉夹。
7. 使用 5.0 PGA 可吸收缝线逐层缝合肌肉和皮肤。
8. 将小鼠置于恢复室中，并持续监测直至其完全清醒。每 12 小时皮下注射一次美洛昔康（5 mg/kg），最多给药 24 小时以缓解疼痛。

5. 血糖测量

注意：在以下时间点测量血糖水平：（1）MCAO 手术前即刻（基线），（2）插入单丝线后即刻（葡萄糖注射后 15 分钟），（3）插入单丝线后即刻撤出单丝线时（葡萄糖注射后 75 分钟）。

1. 用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使尾静脉充分充血。
2. 使用手术剪剪去尾尖1-2 mm。
3. 从尾根部向尾尖方向轻轻挤压，促使血液从切口处流出。
4. 将试纸的样本吸收槽置于血滴边缘。
   注意：由于虹吸作用，血液会自动进入试纸。
5. 读取血糖仪显示的数值并记录结果。
   注意：排除在葡萄糖注射后15分钟内血糖水平未升高至10 mmol/L以上的小鼠。
6. 用棉球清除多余血液，并施加压力以止血。

6. 脑血流量测量

1. 在MCAO手术前，使用动物剪毛器剃除头皮区域的毛发。用消毒棉签交替涂抹碘酒和70%乙醇，清洁并消毒头皮。
2. 在额部区域的皮肤上做一条长约1.0 cm的正中切口，暴露颅骨囟门。用生理盐水保持颅骨湿润。
3. 准备激光多普勒血流仪（LDF），用于测量脑血流量（CBF）的相对变化。
4. 将LDF探头尖端垂直置于左侧顶骨表面（位于bregma后方1 mm，外侧5 mm），直至读数显示稳定的FLUX值，并记录该数值。
   注意：FLUX的测量单位为灌注单位（Perfusion Units, PU），测量范围为0–1000 PU。激光多普勒血流仪的理想基础CBF值>600 PU。连续5秒内波动范围小于10%的读数被视为有效的FLUX值。
5. 在手术操作前及MCA闭塞后立即监测CBF。
   注意：MCAO术后脑血流减少未达到基础值40%以上的实验小鼠将被排除在研究之外¹⁴。

7. 氯化三苯基四氮唑（TTC）染色

1. 通过腹腔注射过量戊巴比妥（300 mg/kg）处死小鼠。
2. 小鼠呼吸停止后，立即将其固定为仰卧位。
3. 使用剪刀打开胸腔，并剪除膈肌以暴露心脏。
4. 将23 G注射针插入小鼠左心室，同时用剪刀剪开耳状 appendix（耳状突）。
5. 灌注15 mL生理盐水，直至从耳状 appendix 流出的液体变得清澈透明。
6. 将小鼠断头，剪开头皮以充分暴露颅骨。将剪刀尖端插入颅骨冠状缝前方约2 mm处，撬开颅骨。
7. 使用镊子完整取出小鼠脑组织。
8. 将脑组织置于啮齿类脑切片模具中，切成2 mm厚的冠状切片。
9. 将切片转移至24孔板中，加入2% TTC溶液，在37 °C下孵育15分钟。
10. 启动扫描软件，将参数设置为1200 dpi分辨率，图像格式设为JPG，用于图像分析。
11. 用弯头镊子将组织切片从24孔板中取出，并整齐排列在玻璃扫描板上。
12. 扫描组织切片，随后导出图像用于测量分析。
13. 通过校正组织水肿来测量梗死面积。使用ImageJ软件¹⁵，从对侧半球面积中减去同侧未梗死区域的面积，计算梗死体积占对侧半球的百分比。有关梗死面积分析的更多细节，请参阅Friedländer等人的研究¹⁶。

8. 大体观察

1. 重复步骤 7.1–7.8。
2. 用弯头镊子将脑组织切片从脑基质中取出，并将切片整齐排列在玻璃扫描板上。
3. 按照步骤 7.10 和 7.12 中所述方法对脑冠状切片进行扫描。

9. 苏木精-伊红（H&E）染色

1. 重复步骤 7.1–7.4。缓慢灌注 15 mL 生理盐水，随后灌注约 15 mL 多聚甲醛（PFA）。
2. 重复步骤 7.6–7.7。在室温下用 4% PFA 固定脑组织 24 小时。
3. 将固定后的脑组织放入自动组织脱水机中进行脱水、透明和浸蜡处理。
4. 将组织包埋于石蜡中，并使用切片机将脑组织切成 5 µm 厚的冠状切片。
5. 将切片浸入二甲苯中三次，每次 8 分钟，以脱蜡。然后依次浸入浓度递减的乙醇溶液（100%、95%、90%、80%、70%），再进入蒸馏水，每步持续 5 分钟。
6. 用苏木精溶液染色 3 分钟，随后用 5% 盐酸乙醇溶液分化 5 秒。
7. 将切片在伊红溶液中孵育 1 分钟，然后用梯度乙醇溶液（90%、95%、100%）和二甲苯进行脱水和透明处理。
8. 用中性树胶封片。
9. 在荧光显微镜下使用明场观察并采集 H&E 染色脑切片的图像。

10. 伊文思蓝（EB）渗漏的测定

注意：有关此操作步骤的详细信息，请参见 Wang 等人¹⁷。

1. 注射2%（w/v）伊文思蓝（EB）溶液（2 mL/kg） 通过 MCAO术后23小时尾静脉
2. 在EB注射一小时后，重复步骤7.1–7.7，并拍摄全脑照片。
3. 将脑组织置于啮齿类动物脑切片模具中，冠状面切成2 mm厚的切片。按照步骤7.10–7.12所述方法扫描脑组织冠状切片，以观察伊文思蓝（EB）渗漏情况。
4. 将切片分为左右两部分，分别放入离心管中。
5. 将每份脑组织切片用三氯乙酸均质化，脑组织与三氯乙酸的比例为100 mg : 0.4 mL，三氯乙酸浓度为50%。
6. 4 °C 下孵育过夜后，在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 30 分钟.
7. 将上清液转移至另一离心管中，并用乙醇稀释四倍。
8. 使用分光光度计在620 nm处测定上清液的吸光度。
9. 使用乙醇中EB的标准曲线（例如，31.25、62.5、125和250 ug/mL）将吸光度值转换为EB的浓度。
   注意：结果以每克脑组织中含有的微克EB表示。

11. FITC-葡聚糖渗漏的测定

1. 在MCAO术后24小时，将FITC-葡聚糖（10 KDa，6 mg/mL，用0.01 M PBS稀释；4 mL/kg）注入尾静脉，使其在血液中循环10分钟。
2. 重复步骤7.1–7.7，进行灌注并取出完整脑组织。
3. 将脑组织在4%多聚甲醛（PFA）中室温避光固定24小时。
4. 将固定后的脑组织依次转移至10%、20%和30%梯度浓度的蔗糖溶液（用0.01 M PBS稀释）中进行脱水处理。
5. 使用最佳切割温度化合物（OCT）包埋脑组织，并切成30 µm厚的脑组织切片。用接种环将切片转移至载玻片上，确保其牢固贴附于玻片表面。
6. 使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂对脑组织切片进行封片。
7. 启动激光共聚焦显微镜及其控制软件。
8. 将载玻片固定在载物台上，使用200倍目镜定位梗死区域。
9. 将分辨率设置为1024 × 1024，并调节增益值和曝光时间，以获得最清晰的图像。
10. 在激发波长为488 nm的条件下，采集脑梗死区FITC-葡聚糖染色部位的图像。

至：

实验方案经江汉大学实验动物福利与使用委员会（JHDXLL2024-080）批准，并依照中国疾病预防控制中心发布的实验动物伦理指南实施。本研究采用成年雄性C57BL/6J小鼠，体重为21–26 g。所用试剂与仪器的详细信息列于下文 材料表.

1. 动物分组与急性高血糖诱导

1. 将小鼠饲养于江汉大学实验动物中心，环境温度控制在20–22 °C，相对湿度50%–55%，光照/黑暗周期为12小时交替，自由饮水和进食 广告 随意摄取
2. 将小鼠随机分为四组：假手术+生理盐水组（n = 12）、假手术+葡萄糖组（n = 12）、MCAO+生理盐水组（n = 12）和MCAO+葡萄糖组（n = 20）。

2. 术前准备

注意：所有实验小鼠在手术前需禁食 12 小时。

1. 术中给予全身镇痛（美洛昔康，5 mg/kg，皮下注射）及切口部位局部麻醉（布比卡因，2 mg/kg，皮下注射）。
2. 所有手术器械、棉签及外科缝线均在121 °C、15 psi条件下高压灭菌30分钟。
3. 用75%乙醇擦拭手术平台及周围工作区域，并打开加热开关，将温度设定为37 °C。
4. 在麻醉诱导舱内使用3%异氟烷-20%氧气混合气体对小鼠进行麻醉。随后，通过评估 趾部夹捏反射 来检测 麻醉深度。
5. 将小鼠以俯卧位置于手术平台上，迅速将其鼻部插入鼻罩中。 打开至鼻罩的气体流量，同时关闭至麻醉诱导舱的气流。将异氟烷比例调整为2%，并设置混合气体流量为0.4 mL/min以维持麻醉。
6. 在小鼠眼部涂抹眼用凝胶，以保持术中眼球湿润。
7. 使用动物专用电推剪剃除颈部区域毛发。通过交替使用碘伏和70%乙醇的消毒棉棒对皮肤进行清洁和消毒。
8. 在颈部覆盖无菌纱布，并剪开一个开口以暴露手术区域。

3. 脑血流量基线测量

1. 使用动物电推剪剃除头皮区域的毛发。用消毒棉签交替涂抹碘伏和70%乙醇，清洁并消毒头皮。
2. 在额部正中皮肤做一处长约1.0 cm的切口，暴露颅骨囟门区域。用生理盐水保持颅骨湿润。
3. 准备激光多普勒血流仪（LDF），将LDF探头垂直置于左侧顶骨表面（位于bregma后方1 mm、外侧5 mm）；待血流信号（FLUX）稳定后，记录基线值。
   注：FLUX的测量单位为灌注单位（Perfusion Units, PU），测量范围为0–1000 PU。激光多普勒血流仪测得的理想基线脑血流（CBF）应>600 PU。连续5秒内波动范围小于10%的FLUX读数视为有效。
4. 使用5.0 PGA可吸收缝线分别缝合肌肉和皮肤。在伤口处涂抹双氯芬酸钠凝胶和莫匹罗星软膏。

4. MCAO 手术操作

注意：MCAO 采用改良的线栓阻塞法进行，如 Chiang 等人先前所述¹³。

1. 将小鼠轻轻翻转至仰卧位，在手术操作前15分钟，经腹腔注射30%葡萄糖溶液（7.2 mL/kg）或生理盐水。
   ​注意：假手术+葡萄糖组和MCAO+葡萄糖组小鼠接受腹腔注射葡萄糖；假手术+生理盐水组和MCAO+生理盐水组小鼠接受腹腔注射生理盐水。
2. 使用动物专用电推剪剃除颈部区域的毛发。用消毒棉签交替涂抹碘酒和70%乙醇，对皮肤进行清洁和消毒。在颈部覆盖无菌纱布，并剪开一小口以暴露手术区域。
   注意：切口应保持平直，以获得颈动脉的最佳可视化效果。
3. 使用手术刀在颈部腹侧做一条1.5 cm的正中切口。用外科镊子分开皮下组织和浅筋膜。
   注意：确保切口保持平直，以获得颈动脉的最佳可视化效果。
4. 在浅筋膜下方，找到下颌下腺以及由三块肌肉构成的倒置三角形区域：位于气管正中线前方的胸骨舌骨肌；具有明显闪亮白色肌腱部分的二腹肌后腹；以及最后的胸锁乳突肌。
5. 在倒置的三角区内进行钝性分离，以辨认并游离左侧颈总动脉（CCA）。
6. 使用眼科镊子分离颈总动脉（CCA）旁的迷走神经及血管周围的黏膜组织。使用5.0聚乙醇酸（PGA）可吸收缝线在颈总动脉上打一个结环，但保持缝线处于无张力状态。
7. 沿 CCA 向上分离 "Y" 可见分叉将CCA分为颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。
8. 分离分叉处，充分暴露颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。在分叉远端用5.0 PGA可吸收缝线环绕ECA并结扎紧密。
   注意：确保永久结扎部位与血管分叉之间有足够的距离，以防止在旋转颈外动脉（ECA）时缝线脱落。
9. 使用两个8 mm × 2 mm的带光源显微锯齿动脉夹，暂时夹闭CCA和ICA，以阻断血流从CCA流向ICA。
10. 拉紧位于ECA远端和CCA处的缝合线，以拉直ECA血管段。
11. 使用显微剪刀在ECA的两根结扎线之间做一个小切口。
12. 将一根硅胶涂层单丝缝线（30 mm长，3–4 mm涂覆硅胶）插入颈外动脉（ECA）。在ECA分叉附近用第二根5.0号聚羟基乙酸可吸收缝线打环并轻轻结扎，以防止单丝缝线回退。
13. 在永久结扎线远端完全切断颈外动脉，并从颈内动脉上移除动脉钳。
14. 将缝合线回撤至颈总动脉分叉处，然后小心牵拉并旋转颈外动脉残端。调整缝合线的插入方向，缓慢将其插入，从颈总动脉分叉处沿颈内动脉推进约9.0–10.0 mm，以阻塞大脑中动脉。
15. 用第二根可吸收的PGA缝线结扎ECA，并移除CCA上的动脉夹。
16. 使用5.0 PGA可吸收缝线分别缝合肌肉和皮肤。应用双氯芬酸 钠 将凝胶和莫匹罗星软膏涂抹于伤口。
17. 将小鼠轻轻翻转至俯卧位，重复步骤3.4，以记录MCA闭塞后的血流情况。
    注意：在大脑中动脉闭塞（MCAO）后，脑血流减少程度低于基线值40%的小鼠被排除在研究之外。¹⁴.
18. 打开回收笼的加热开关，将温度设置为37°C。在再灌注期（60分钟）内，将小鼠置于回收笼中。

5. 单丝去除与再灌注

1. 在阻塞期即将结束前，按照之前所述方法重新麻醉小鼠。
2. 使用微型动脉夹夹闭颈总动脉（CCA）。
3. 将单丝线部分从颈内动脉（ICA）撤出，直至硅胶涂层的尖端在颈内动脉中可见。
4. 在硅胶涂层尖端上方的颈内动脉处放置另一个微型动脉夹。
5. 完全撤出单丝线，并紧密结扎颈外动脉（ECA）残端。
6. 依次移除颈内动脉和颈总动脉上的微型动脉夹。
7. 使用5.0 PGA可吸收缝线逐层缝合肌肉和皮肤。
8. 将小鼠置于恢复舱中，并持续监测直至其完全清醒。每12小时皮下注射一次美洛昔康（5 mg/kg），最多持续24小时，以缓解疼痛。

6. 血糖测量

注意：在以下时间点测量血糖水平：（1）MCAO 手术前即刻（基线），（2）插入单丝线后即刻（葡萄糖注射后 15 分钟），（3）拔出单丝线后即刻（葡萄糖注射后 75 分钟）。

1. 用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使尾静脉充分充血。
2. 使用手术剪剪去尾尖1–2 mm。
3. 从尾根部向尾尖方向轻轻挤压，促使血液从切口处流出。
4. 将试纸的样品吸收槽置于血滴边缘。
   注意：由于虹吸作用，血液将自动吸入试纸中。
5. 读取血糖仪数值并记录结果。
   注意：葡萄糖注射后15分钟内血糖水平未升高至10 mmol/L以上的小鼠应予以剔除。
6. 用棉球清除多余血液，并施加压力以止血。

7. 氯化三苯基四氮唑（TTC）染色

1. 通过腹腔注射过量戊巴比妥（300 mg/kg）处死小鼠。
2. 小鼠呼吸停止后，立即将其固定于仰卧位。
3. 使用剪刀打开胸腔，并剪除膈肌以暴露心脏。
4. 将23 G注射针插入小鼠左心室，同时用剪刀剪开耳状 appendix。
5. 用15 mL生理盐水灌流，直至从耳状 appendix流出的液体变得清澈透明。
6. 将小鼠断头，剪开头皮充分暴露颅骨。将剪刀尖端插入颅骨冠状缝前方约2 mm处，撬开颅骨。
7. 使用镊子完整取出小鼠脑组织。
8. 将脑组织置于啮齿类脑切片模具中，切成2 mm厚的冠状切片。
9. 将切片转移至24孔板中，加入2% TTC溶液，于37 °C孵育15分钟。
10. 启动扫描软件，设置参数为1200 dpi分辨率，图像格式为JPG，用于图像分析。
11. 用弯头镊子从24孔板中夹取组织切片，并将其整齐排列于玻璃扫描板上。
12. 扫描组织切片，随后导出图像用于测量分析。
13. 通过校正组织肿胀来测量梗死面积。使用ImageJ软件¹⁵，以对侧半球面积减去同侧未梗死区域面积，计算梗死面积占对侧半球的百分比。有关梗死面积分析的更多细节，请参见Friedländer等¹⁶。

8. 大体观察

1. 重复步骤 7.1–7.8。
2. 使用弯头镊子将脑组织切片从脑基质中取出，并将其排列在玻璃扫描板上。
3. 按照步骤 7.10 和 7.12 中所述方法对脑冠状切片进行扫描。

9. 苏木精-伊红（H&E）染色

1. 重复步骤 7.1–7.4。缓慢灌注 15 mL 生理盐水，随后灌注约 15 mL 多聚甲醛（PFA）。
2. 重复步骤 7.6–7.7。用 4% PFA 在室温下固定脑组织 24 小时。
3. 将固定后的脑组织放入自动组织脱水机中进行脱水、透明和浸蜡处理。
4. 将组织包埋于石蜡中，并使用切片机将脑组织切成 5 μm 厚的冠状切片。
5. 将切片浸入二甲苯中三次进行脱蜡，每次 8 分钟。然后依次将切片浸入浓度递减的乙醇溶液（100%、95%、90%、80%、70%），再转入蒸馏水中，每步持续 5 分钟。
6. 用苏木精溶液染色 3 分钟，随后用 5% 盐酸乙醇溶液浸染 5 秒进行分化。
7. 将切片在伊红溶液中孵育 1 分钟，然后用梯度乙醇溶液（90%、95%、100%）和二甲苯进行脱水和透明处理。
8. 用中性树胶封片。
9. 在荧光显微镜下使用明场模式采集 H&E 染色脑切片的图像。

10. 伊文思蓝（EB）渗漏的测定

注意：有关此实验步骤的详细信息，请参见 Wang 等人¹⁷。

1. 注射2%（w/v）伊文思蓝（EB）溶液（2 mL/kg） 通过 MCAO术后23小时尾静脉
2. 在EB注射一小时后，重复步骤7.1–7.7，并拍摄整个大脑的照片。
3. 将脑组织置于啮齿类动物脑切片模具中，冠状面切成2 mm厚的切片。按照步骤7.10–7.12所述方法对脑组织冠状切片进行扫描，以观察伊文思蓝（EB）渗漏情况。
4. 将切片分为左右两部分，分别放入离心管中。
5. 将每份脑组织切片在50%三氯乙酸中匀浆，脑组织与三氯乙酸的比例为100 mg : 0.4 mL。
6. 4 °C 下孵育过夜后，将匀浆在 10,000 x 转速下离心 30 分钟 g （4 °C下）.
7. 将上清液转移至另一离心管中，并用乙醇稀释四倍。
8. 使用分光光度计在620 nm处测定上清液的吸光度。
9. 利用乙醇中EB的标准曲线（例如，EB浓度分别为31.25、62.5、125和250 μg/mL）将吸光度值转换为EB浓度。
   注：结果以每克脑组织中含有的微克EB表示。

11. FITC-葡聚糖渗漏的测定

1. 在MCAO术后24小时，经尾静脉注射  FITC-葡聚糖 （10 KDa，6 mg/mL，用0.01 M PBS稀释；剂量为4 mL/kg），使其在血液中循环10分钟。
2. 重复步骤7.1–7.7，进行灌注并取出完整脑组织。
3. 将脑组织在4%多聚甲醛（PFA）中室温避光固定24小时。
4. 将固定后的脑组织依次转移至10%、20%和30%梯度浓度的蔗糖溶液（用0.01 M PBS稀释）中进行脱水处理。
5. 使用最佳切割温度化合物（OCT）包埋脑组织，并切成30 μm厚的脑组织切片。用接种环将切片转移至载玻片上，确保其牢固贴附于载玻片表面。
6. 使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂对脑组织切片进行封片。
7. 启动激光共聚焦显微镜及其控制软件。
8. 将载玻片固定在显微镜载物台上，使用200倍目镜定位梗死区域。
9. 将图像分辨率设置为1024 × 1024，并调节增益值和曝光时间，以获得最清晰的图像。
10. 在激发波长为488 nm的条件下，采集脑梗死区FITC-葡聚糖染色部位的图像。