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用于组合式液滴生成的双层微流控装置

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DOI：

10.3791/66154

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2023年12月1日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的双层装置的制备方法，用于在油包水乳液（液滴）中生成组合文库。方案中详细描述了实现液滴自动化生成所需的硬件和软件，并展示了荧光液滴定量文库的制备过程。

摘要

液滴微流控是一种多功能工具，可在化学性质不同的纳升级反应腔室中执行大量反应。此类系统已被用于包封多种生化反应——从单细胞培养到聚合酶链式反应（PCR）的实施，从基因组学到化学合成均有应用。将微流控通道与调控阀耦合，可控制其开关状态，从而快速生成由具有独特组分的液滴群体构成的大规模组合文库。本文介绍了用于制备和操作基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的压力驱动双层微流控装置的实验方案，该装置可用于生成被称为“塞状液滴”（plugs）的水包油乳液组合文库。通过结合软件程序与微流控硬件，可精确控制和调节目标流体在装置中的流动，以生成组合式塞状液滴文库，并调控各子代塞状液滴群体的组分与数量。这些方案将加速组合筛选实验的构建过程，尤其适用于研究癌症患者活检样本中细胞对药物的响应。

引言

微流控技术能够在微通道中操控微量流体1。典型微流控装置的操作尺度为数十至数百微米，这使得化学和生物反应得以微型化，从而可以用相对少量的试剂完成这些反应。最初，微流控装置由硅2和玻璃3等材料制造而成。尽管这些材料仍在使用4，但存在一些问题，例如溶剂相容性差、制造成本高以及难以集成流体流动控制元件5,6。基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的制造方法，即所谓的软光刻技术，为设备的快速原型制作提供了低成本的替代方案7，并为构建复杂的多层结构装置开辟了途径8。在PDMS装置中加入阀门和泵，可实现对流体在装置内流动路径和速度的控制9,10。目前已开发出多种可逆或不可逆驱动微阀的方法，例如由硅和铝制成的双金属热驱动阀11，或利用电化学反应产生的气体使氮化硅膜发生偏转的装置12。Gu等人 展示了利用盲文显示器的机械针脚对微通道施加压力以调节流体流动的方法13。其中一类广受欢迎的微阀是Stephen Quake研究团队率先开发的气动PDMS基微阀14。这类阀门通常由两个正交的微通道组成——一条为流体通道，另一条为控制通道。当控制通道加压时，一层薄的PDMS膜会向流体通道偏转，将其封闭，从而阻断流体流动；当控制通道减压后，PDMS膜恢复原状，重新打开流体通道，使流体流动得以恢复。由于控制通道可以多次加压和减压，PDMS阀门能够以稳定且可逆的方式实现流体调控15。此外，由于这类阀门可通过施加压力来驱动，因此为实现数字化控制和自动化提供了可能16。同时，由于阀门与装置主体材料相同，可利用软光刻技术无缝集成到PDMS基装置的制造过程中8,17,18。这些特性使PDMS阀门成为微流控装置中流体调控的理想选择。Thorsen等人利用此类阀门的原理设计了一种流体多路复用器——一种组合式的气动阀门阵列——仅用20条控制通道即可寻址近一千条输入流体通道19。该原理已被进一步拓展，用于将流体选择性地引导至芯片上的微流控恒化器，从而在每个反应器中同时进行独立的反应20,21,22,23。然而，尽管此类微反应器在优化有限试剂使用方面具有优势，但无法实现多个反应的并行处理，因而不足以满足高通量研究的需求。

液滴微流控是微流控的一个子领域，涉及通过操控微流控装置中不混溶的多相液体流动来生成液滴24。液滴的形成是通过引入一种不混溶的流体使连续相流体发生断裂，由于界面能不稳定而导致 pinch-off 现象，并形成乳液25。当乳液离开微通道时，表面活性剂可通过稳定界面能促进形成圆形液滴26。较大的液滴称为液塞（plugs），其稳定性较差，可被收集到一个储存腔室（例如一段管路）中，形成由一种或多种不混溶液体分隔开的阵列式水相微区27。除了微型化和区室化之外，液滴微流控还能显著提高生物反应的通量，因为可大量生成单分散性液滴，每个液滴均可作为纳米反应器28。一旦生成，液滴还可进一步进行多种操作，如分裂29,30、融合31,32、分选33,34，以及组装成更高阶的结构35,36。液滴微流控已彻底改变了多个科学领域和技术，从聚合酶链式反应（PCR）37到单细胞转录组学38，从药物发现39,40到病毒学41，从下一代测序42到化学合成43。

将基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的软光刻技术与微阀同液滴技术相结合，是一种强大的组合，可实现对微通道中流体流动的调控，进而精确控制液滴的内容物。通过控制通道的开启与关闭，能够生成具有特定组分的不同液滴群体。此类平台有望实现生化反应的微型化、区室化和并行化，因此在组合筛选中具有重要应用价值44。组合筛选是一种高通量方法，通过组合多种选定试剂生成数以万计的不同组合，构建出由已知组分的独立群体组成的文库。该技术已被用于发现药物与抗生素在抑制细菌生长方面的协同效应45。在癌症治疗领域，组合筛选可用于针对特定患者测试多种抗癌药物的组合，从而推动个体化治疗的发展46,47。Mathur 等人在此基础上进一步整合了组合式DNA条形码技术，用于在高通量药物筛选中评估转录组变化48。因此，组合筛选是一项强大但尚处于发展初期的技术，亟需开发多样化的微流控技术以支持和促进此类筛选过程的实施。

本文旨在提供一套完整的双层微流控装置制备方案，该装置能够生成水包油液滴的组合文库，并介绍此类装置运行所需的硬件与软件。流体流动通过压力控制的PDMS气动阀进行调控，而气动阀则由定制的LabVIEW程序控制。装置中的试剂流动由市售的压力泵实现。本文展示了一种八入口原型装置，其中液滴由三个入口的内容物形成，每个入口均含有水相试剂。水相与连续的油相在T型 junction 处交汇，以0.33 Hz的频率生成液滴。通过生成包含三种不同荧光液滴群体的定量文库，验证了系统的功能。该技术及配套方案将有助于加快组合文库的构建，用于高通量筛选研究。

方案

1. 软光刻技术

注意：微流控装置由两层组成，即流体层和控制层（图1A），每层分别使用正性光刻胶和负性光刻胶，通过独立图案化的晶圆进行模塑制备（有关光刻胶和显影剂的详细信息，请参见材料表）。

  1. 按照以下步骤进行流体层晶圆的制备。
    1. 将一片硅晶圆（直径 100 mm，<1-0-0> 晶向，525 厚度）在 250 °C 下脱水处理过夜（12–16 小时）。
    2. 待晶圆冷却后，进行旋涂。在晶圆中心滴加 3–4 mL 正性光刻胶。
    3. 以 1400 rpm（344 rpm/s）的转速旋涂 40 秒，获得 45 µm 的特征高度。
    4. 在热板上进行软烘，采用温度梯度程序，以 450 °C/h 的速率从 35 °C 升温至 105 °C。此步骤也可在超细纤维布上进行，以避免直接接触并减少光刻胶起泡。烘完后将晶圆从热板上取下，并在超细纤维布上冷却。
    5. 将对应于流体层的光掩模（乳剂面朝下，商业制备）放置在涂有光刻胶的硅晶圆上，并在紫外灯下曝光，光强为 10 mW/cm2，直至总曝光量达到 200 mJ/cm2。
    6. 使用两个热板——一个设定在 65 °C，另一个在 95 °C——分别对晶圆进行曝光后烘烤，时间为 1 分钟和 7 分钟。
    7. 将晶圆转移至盛有正性光刻胶显影液的培养皿中进行显影。将培养皿置于台式摇床上，使晶圆完全浸没并持续摇动，期间定期更换显影液，直至晶圆完全显影且特征清晰可见。
    8. 用去离子水冲洗晶圆以去除残留的光刻胶，并在体视显微镜下检查通道内是否有残留物。如有残留，可将晶圆重新放入显影液中，或使用移液枪小心地向晶圆表面添加显影液进行清除。完成后，使用氮气喷枪将晶圆吹干。
    9. 将晶圆置于设定为 110 °C 的热板上回流 25 分钟，使特征结构边缘变圆滑。
    10. 按照步骤 1.3 所述进行晶圆硅烷化处理。
      ​注意：在涂布光刻胶前，也可对硅晶圆进行六甲基二硅氮烷（HMDS）蒸气沉积处理，以增强光刻胶与晶圆之间的附着力。
  2. 按照以下步骤进行控制层晶圆的制备。
    1. 取另一片硅晶圆，置于设定为 110 °C 的热板上加热 15 分钟进行脱水处理。
    2. 取下晶圆，待其冷却至室温后，进行旋涂。
    3. 在晶圆中心滴加 5 mL 负性光刻胶。
    4. 采用以下旋涂程序获得 40 µm 的特征高度：以 100 rpm/s 的加速度在 500 rpm 下旋转 5 秒，随后在 1400 rpm 下以 300 rpm/s 的加速度旋转 33 秒，最后以 300 rpm/s 的减速度在 5 秒内减速至 0 rpm。
    5. 使用两个分别设定为 65 °C 和 95 °C 的热板进行软烘，时间分别为 1 分钟和 15 分钟。烘完后将晶圆从热板上取下，并在超细纤维布上冷却。
    6. 将对应于控制层的光掩模（乳剂面朝下，商业制备）放置在涂有光刻胶的晶圆上，并在紫外灯下曝光，光强设定为 15 mW/cm2，直至总曝光量达到 250 mJ/cm2。
    7. 使用两个热板——一个设定在 65 °C，另一个在 95 °C——分别对晶圆进行曝光后烘烤，时间为 2 分钟和 5 分钟。烘完后将晶圆从热板上取下，并在超细纤维布上冷却。
    8. 将晶圆转移至盛有负性光刻胶显影液的培养皿中显影 4 分钟。更换显影液后继续显影 4 分钟。
    9. 用异丙醇冲洗晶圆以去除残留的光刻胶，并使用体视显微镜检查通道内是否有残留物。
    10. 如有残留，可将晶圆重新放入显影液中，或使用移液枪小心地向晶圆表面添加显影液进行清除。完成后，使用氮气喷枪将晶圆吹干。
    11. 显影完成后，将晶圆置于设定为 95 °C 的热板上进行硬烘 10 分钟。
    12. 按照步骤 1.3 所述进行硅烷化处理。
  3. 按照以下步骤进行硅烷化处理。
    1. 将晶圆放入干燥器中。在干燥器内放置一个玻璃瓶，并加入 4–5 滴 1,1,3,3-四甲基二硅氧烷。
      警告：1,1,3,3-四甲基二硅氧烷无毒但易燃。可使用其他硅烷，但可能具有毒性。建议在通风橱中操作，并穿戴必要的个人防护装备（PPE），如实验服、护目镜和丁腈手套。
    2. 抽真空 15 分钟后密封干燥器，静置 12–16 小时，使硅烷在晶圆表面沉积。
    3. 打开干燥器，取出并处理玻璃瓶。将晶圆放入洁净的培养皿中。
  4. 按照以下步骤进行微流控器件的制备。
    注意：以下方案改编自先前的研究23。
    1. 分别配制两种 PDMS 溶液——一种用于流体层，另一种用于控制层。每种溶液均在烧杯中将 PDMS 套件的基体剂与固化剂混合，并用搅拌棒搅拌。控制层需使用 10 g 基体剂和 0.5 g 固化剂（20:1 比例），而流体层需使用 40 g 基体剂和 8 g 固化剂（5:1 比例）。
    2. 将 PDMS 溶液置于干燥器中脱气，直至溶液中无气泡。
    3. 将硅烷化处理后的流体层晶圆放入用铝箔覆盖的培养皿中，将对应的 PDMS 溶液浇注在晶圆表面。将培养皿重新放入干燥器中，抽真空进一步脱气（约 20 分钟）。
    4. 对硅烷化处理后的控制层晶圆进行 PDMS 旋涂。在晶圆中心滴加 3–4 mL 溶液，以 1500 rpm（408 rpm/s）的转速旋涂 20 秒。随后将晶圆平放在密闭的培养皿中静置 20 分钟。
    5. 将流体层和控制层同时放入 80 °C 烤箱中加热 18–20 分钟。期间定期观察两层是否已固化。当两层材料变得坚韧且可塑、表面略带黏性时即为合适状态，此状态有助于两层之间的键合。
    6. 使用手术刀在流体层晶圆上沿每个器件边缘切割 PDMS。注意不要过于靠近特征结构，应在特征与 PDMS 边缘之间保留约 2 cm 的空间。从硅晶圆上取下 PDMS 块后，用胶带覆盖其特征面，以防灰尘污染。
    7. 所有 PDMS 块切割完成后，依次将其粗略对准并放置在对应的控制层晶圆上，通过目视进行初步对齐。
    8. 当所有 PDMS 块均放置在控制层晶圆的对应位置后，调整每个块的位置，使控制阀与对应的流体通道完全重叠，完成精确对齐。此步骤也可借助体视显微镜完成。
    9. 通过施加压力去除两层之间的气泡。若气泡位于或靠近特征结构，加压时需小心避免通道塌陷。
    10. 将器件放入 80 °C 烤箱中，在 12–16 小时内完成键合。在每个器件上放置 100 g 的重物，以增强两层之间的键合强度。
    11. 取出晶圆，逐个切割出独立的器件。将器件从控制层晶圆上剥离，并用胶带覆盖其特征面。
    12. 将每个独立器件放置在切割垫上，特征面朝上，使用 0.75 mm 的活检打孔器在特征面朝上的情况下，为流体层的八个入口、控制层的八个通道入口、油相入口以及出口分别打孔。
    13. 将显微载玻片和一个已去除胶带、特征面朝上的器件放入等离子清洗机中。以 30 W 功率进行 20 秒的氧气等离子体处理。
    14. 等离子处理一结束，立即取出器件和载玻片，将器件特征面朝下贴附在载玻片上。PDMS 与玻璃之间的粘附应肉眼可见。对存在气泡的区域施加压力，挤出空气。
    15. 将器件放置在设定为 110 °C 的热板上，顶部压上重物，加热 60 分钟，以增强 PDMS 与玻璃之间的键合。

2. 硬件设置

注意：微流控装置连接方式的示意图见图1B，使用必要硬件实现该方案的实际连接情况见图2。

  1. 按照以下说明设置气动阀。
    注意：每个控制通道用于调节芯片上的PDMS阀，而每个控制通道又由一个电磁阀控制。此处展示的原型包含八个控制通道（图1A），因此需要八个电磁阀。
    1. 使用定制的LabVIEW软件程序（主界面程序；图3 和 补充文件1、补充文件2、补充文件3、补充文件4）控制电磁阀。该程序通过TCP连接（补充文件5、补充文件6）向WAGO控制器发送MODBUS指令。使用网线将WAGO设备连接至运行LabVIEW程序的计算机。随后依次将电磁阀连接至WAGO控制器的端口。更详细的描述请参见先前报道的方案23。
    2. 使用1/4英寸管路将电磁阀阵列连接至压缩空气源，并将阀阵列的压力设定为3.5 bar。在本系统中，使用了标记为9-16的八个阀门。
  2. 按照以下说明设置压力调节器 。
    注意：使用市售的压力泵来控制流体流动（图2）。本装置采用一个八通道和一个四通道泵组，以满足装置中八个水相入口和两个油相入口的需求。各通道的压力通过制造商提供的软件进行调节。
    1. 将压力泵连接至压缩空气源，确保供气压力不超过泵所允许的最大压力（八通道和四通道控制器均为2.2 bar）。
    2. 使用USB连接线将压力泵连接至计算机。
    3. 开启泵后，应在相应软件中可见。在设置泵时，先将各通道压力设为零。
    4. 将每个控制器上的12个雌性鲁尔锁输出端口分别连接一个雄性鲁尔接头转3/32英寸卡套接头。
    5. 将一段软管（外径：3 mm，内径：1 mm，长度：15 cm）连接至卡套接头。在软管另一端连接另一个雄性鲁尔接头转3/32英寸卡套接头。
    6. 将一个鲁尔短接头（23 G，0.5英寸）连接至卡套接头。此时压力调节器已安装完毕，可投入使用。

3. 微流控装置设置

  1. 按照以下说明连接控制通道管路（图2）。
    1. 针对每个控制通道，截取一段聚四氟乙烯（PTFE）管路（外径：0.042 英寸，内径：0.022 英寸）。在一端插入23 G、0.5 英寸鲁尔短管的针头。
    2. 将鲁尔短管连接至一个公鲁尔转 3/32 英寸尼龙卡套接头。将接头的卡套端插入一段聚氨酯管路（外径：4 mm，内径：2.5 mm）。将聚氨酯管路的另一端直接连接至电磁阀。
    3. 用注射器吸取水，并在末端连接一个23 G、0.5 英寸鲁尔短管。
    4. 将PTFE管路的自由端连接至该注射器，并注入水，直至管路约一半长度充满水。
    5. 将管路从注射器上断开，并将管路的自由端插入对应控制通道的打孔位置（图1A-C1-8）。重复此操作，直至每个控制通道均连接至对应的电磁阀。
      注：本文中，电磁阀9–16分别连接至对应C1至C8的控制通道。尽管连接方式可任意设定，但在操作主界面程序时，必须牢记连接的顺序和对应关系。
    6. 使用主界面程序（图3）打开所有电磁阀（对所有控制通道加压）。这将推动管路中的液体进入微流控装置的控制通道，从而充满整个通道。加压与减压状态下的阀门示例如图图4所示。
  2. 连接试剂并启动装置，具体步骤如下。
    1. 确保通过主界面程序中的对所有控制通道加压按钮（图3）使所有控制通道处于加压状态。
    2. 针对每种水相试剂，截取一段足够长的PTFE管路（外径：0.042 英寸，内径：0.022 英寸），以连接泵与微流控装置的入口。将其中一段管路连接至步骤2.2.6中的鲁尔短管。
    3. 用所需试剂填充注射器，并在末端连接一个23 G、0.5 英寸鲁尔短管。
    4. 将试剂注入对应的PTFE管路中，直至管路完全充满。注意避免试剂进入泵组的出口端。
    5. 将管路的自由端插入微流控芯片的相应入口。
    6. 使用配套软件，对每种入口水相试剂施加400 mbar的压力。
    7. 使用主界面程序（图3）依次单独对各控制通道进行减压，以确保所有试剂均已到达装置的T型交汇点。如有需要，可通过程序中控制通道手动加压区域的对应按钮单独操作各个阀门。
    8. 对油相试剂重复步骤3.2.3至3.2.5。对每种入口油相试剂施加400 mbar的压力。
    9. 按下对所有控制通道减压按钮（图3），同时对所有控制通道进行减压，直至装置内的空气完全排出。此过程可通过肉眼或显微镜观察确认。
    10. 按下对所有控制通道加压按钮（图3）使所有控制通道重新加压。此时，所有试剂均已连接完毕，装置已启动并准备就绪，可开始使用。
  3. 按以下说明编程并执行实验。
    1. 将每种液滴群的组成、顺序和重复次数编码为一个.csv文件（如补充文件7所示），作为主界面程序中自动实验功能（图3）的输入文件。若对应入口需要打开，则在相应控制通道标记为0；若需要关闭，则标记为1。.csv文件中的每一行对应一种独立的液滴群。
    2. 点击实验文件选项卡中的文件夹按钮，将该.csv文件加载至主界面程序。
    3. 在程序中填写相关参数，例如实验迭代次数（决定给定液滴序列的生成次数）、减压时间（决定入口通道开启及对应控制通道减压的持续时间，单位为毫秒）、加压时间（决定在不同液滴群序列之间入口关闭的持续时间，单位为毫秒）。
    4. 在条形码入口部分选择用于生成条形码的入口通道（最多3个），并设定其开启持续时间（条形码时间（ms））。或者，这些条形码信息也可直接硬编码至输入的.csv文件中，如补充文件7所示。
    5. 将入口油相试剂的压力降低至200 mbar。
    6. 在出口端连接一段所需长度的PTFE管路（外径：0.042 英寸，内径：0.022 英寸）以收集液滴。为确保液滴生成的均匀性，建议使用约100 cm长且预先充满液滴的收集管路。此举可抵消因管路中液滴积累而在出口端产生的压力差异。
    7. 点击运行实验按钮以启动程序并开始生成液滴。
  4. 按以下说明进行数据记录与分析（见图5）。
    注：本节专门描述了荧光液滴的分析方法。根据所生成液滴的性质，本节内容可按需调整。
    1. 用油（矿物油或氟化油）填充注射器，并在末端连接一个23 G、0.5 英寸鲁尔短管。将注射器固定在泵上。
    2. 将已填充的收集管路一端连接至注射器上的鲁尔短管，另一端固定在显微镜物镜上方。
    3. 在管路末端靠近物镜处放置一个废液收集容器。
    4. 将显微镜聚焦于管路的某一区域，并设置为在所需通道中记录荧光信号。
    5. 将泵的流速设定为50 µL/min。
    6. 以.avi格式记录荧光通道的视频。
    7. 使用提供的Python脚本（补充文件8）分析.avi文件，提取每帧中预定义感兴趣区域（ROI）的平均荧光强度（示例见补充文件9）。
    8. 使用提供的定制R脚本（补充文件10）提取实验条件，并绘制原始数据及峰高图。
      注：本文分析所用的R脚本来自补充文件10。该脚本中用于数据截取、通过条形码识别实验条件、分析单个液滴的峰高并绘图的自定义R函数，详见补充文件11。

结果

微流控芯片的一个关键特征是PDMS阀门及其调控流体流动的能力，这种能力会影响器件的操作模式，因此需要对其进行表征。为此，在周期性加压（3.5 bar，持续2000 ms）和减压（1000 ms）PDMS阀门的同时，记录了去离子水通过入口通道的流速（使用商用流量传感器测量）随不同输入压力的变化情况图6A）。观察发现，当输入压力约为800 mbar时，阀门仍能调节流体流动，表现为阀门启动时流速降至零图6 B-D）。这验证了使用此类基于PDMS的阀门来调控通道内试剂流动的可行性。此外，在1200 mbar时，输入压力过高，导致阀门无法有效调控流动，表现为流速未能降至零。图6E）。尽管可以调整PDMS阀门加压和减压的持续时间，但在当前的加压（2000 ms）和减压（1000 ms）条件下，计算了流体流动变化的速率。当输入压力为400 mbar时，流体的开启和关闭频率分别为1.26 Hz和1.44 Hz（图6C).

此前类似组合式高通量微流控装置的版本也集成了与每条流道相连的废液通道46,47。这些装置在恒定流速模式下运行（即试剂以恒定流速而非恒定压力注入装置），当对应的入口通道关闭时，废液通道被编程打开以释放可能产生的压力积聚。尽管此类通道具有一定作用，但会导致试剂浪费，因为废液通道中的内容物不参与液滴形成。此外，还需要额外的控制通道——从而需要额外的泵——来调节废液通道的开启与关闭。在本研究所呈现的原型中，去除了废液通道，并建立了一种新的操作范式，可减少试剂浪费，并降低设计与操作的复杂性。该范式涉及以恒定压力模式而非恒定流速模式注入水相试剂。为了更好地理解这两种模式，分别评估了在阀控过程中两种模式下通道内压力与流速之间的关系（使用与图6A所示相同的装置），结果如图7所示。在图7A中，在恒定压力（300 mbar）下注入去离子水时，测得其流速在阀控期间下降至零，而在阀门卸压后，流速恢复至阀控前水平。然而，在恒定流速模式下，当以恒定流速（2.5 µL/min；图7B）注入去离子水并记录通道内压力时，阀控并未实现入口的完全关闭——表现为流速未降至零——并观察到通道内出现压力积聚。这种压力正是通过废液通道的开启得以释放。由于恒定输入压力模式可在阀控期间避免背压的产生，从而无需设置废液通道，因此本研究采用该模式运行微流控芯片。

为展示微流控装置的功能，生成了一个定量组合荧光液滴库。向该装置的八个入口分别注入三种水相试剂：在四个入口（I1、I3、I5、I7）中注入含荧光素（50 µM）的溶液，在三个入口（I4、I6、I8）中注入去离子水，在一个入口（I2）中注入蓝色染料（作为条形码）；以及两种油相试剂：氟化油（FC-40）和矿物油（MO），分别注入入口 O1 和 O2（图1A，图8A）。氟化油作为分散水相液滴的连续相，矿物油则有助于稳定液滴并减少液滴内容物在通道壁上的黏附，从而最大限度降低液滴间的交叉污染46。由于每个液滴群体的组成由三个入口共同决定，该配置可生成三种不同的荧光液滴群体：FFF——由三个通道提供的荧光素组成；FFW——由两个通道提供的荧光素和一个通道提供的水组成；FWW——由一个通道提供的荧光素和两个通道提供的水组成。在此设置下，共有12种不同条件可生成FWW液滴，18种不同条件可生成FFW液滴，4种不同条件可生成FFF液滴。因此，芯片被编程以生成这34种不同的条件，每种条件包含五个重复液滴，同时在不同条件之间插入五个重复的条形码液滴。建议在荧光液滴群体之间插入条形码液滴群体，即一组可见的有色（理想情况下无荧光）液滴（本例中通过打开对应蓝色染料和两路去离子水的入口通道形成），肉眼即可观察。这有助于用户监测液滴生成过程中是否出现液滴断裂或融合等问题，并辅助后续的液滴分析。因此，共生成并收集了340个液滴——包括170个实验液滴和170个用于分隔不同条件的条形码液滴——收集于PTFE管中，样本如图8B所示。减压时间和加压时间分别设定为1000 ms和2000 ms。对液滴的荧光强度及其在不同实验条件内部和之间的变异性进行了分析，结果如图8C、D所示。图8C展示了步骤3.4.6中生成的.avi文件每一帧的荧光强度，图中突出显示了所涉及的34个实验条件（以蓝线标示）。各条件内峰的平均荧光值以红色表示，虚线表示该条件内的标准误差。通过从每个峰检测到的最大荧光值中减去基线荧光值，得到各群体中所有液滴峰的高度，并在图8D中绘出。在计算中忽略了每个条件的最后一个峰，因其为受污染液滴，由T型 junction处试剂混合所致（由于液滴荧光记录顺序与生成顺序相反，因此在生成过程中每个群体的第一个液滴在分析时为该群体的最后一个液滴）。结果显示，FWW液滴的峰高约为FFF液滴的三分之一（均值 = 40.9，标准差 = 3.1），FFW液滴的峰高约为FFF液滴的三分之二（均值 = 78.4，标准差 = 5），而FFF液滴的峰高为（均值 = 117，标准差 = 10）。这些结果与FFF/FFW/FWW液滴群体中预期的荧光比例相符，表明该装置具有良好的稳健性和功能可靠性。

微流控芯片示意图，包含控制层和流体层、通道管路及阀门工作机理。
图 1：装置设计与微流控系统的示意图。（A）芯片的流体层以蓝色表示，控制层以红色表示。总共八种不同的水相试剂可通过入口（I1-8）流向T型 junction，在此处与油相入口（O1-2）提供的油相接触，形成液滴，并从出口收集。每个入口流道由一个独立的控制通道（C1-8）控制。（B）显示微流控芯片及其与各入口、控制通道和油相试剂之间管路连接的示意图，同时展示出口管路。箭头指示管路中流体的流动方向。插图为PDMS阀门工作原理示意图。虚线表示控制层位于流体层下方。本图经 Dubuc 等人49 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

用于流体控制研究的微流控系统示意图，包含压力泵、电磁阀和芯片。
图 2：液滴生成硬件装置的示意图。 压力泵控制入口通道中试剂（包括水相和油相）的流动，电磁阀控制PDMS阀门的启闭动作。请点击此处查看该图的放大版本。

用于自动实验设置和加压的微流控控制系统接口示意图。
图3：用于控制微流控装置的主界面程序。 该自定义程序可实现对各个气动阀的手动加压（白色面板）。同时，它还支持完整实验的运行（蓝色面板），允许导入包含目标液滴群信息及所需参数（如阀门加压与减压时间）的 .csv 文件，并实时显示实验运行状态，包括各控制通道当前是否处于加压状态。请点击此处查看该图的放大版本。

显示流体流动动力学的微流控通道示意图；用于观察流动的显微镜设置。
图 4：压力驱动的阀门启闭。 透射光显微镜图像显示（A）PDMS 阀门（水平方向）处于减压状态，入口通道（垂直方向）处于开放状态；以及（B）PDMS 阀门处于加压状态，关闭入口通道。请点击此处查看此图的放大版本。

用于显微镜观察的注射泵装置，显示带塞子的收集管；流体输送示意图。
图 5：数据记录装置示意图。 收集管连接至装有油的注射器，注射器固定在泵上。塞子在收集管中流动，通过荧光显微镜采集图像或视频。 请点击此处查看该图的放大版本。

微流控芯片流速分析；压力泵与流量传感器示意图；不同毫巴压力下的流速图。
图6：在给定输入压力下，阀门驱动对流速的影响。 （A）用于监测微流控通道中流速的硬件装置示意图。通道在不同输入压力下流速响应情况：（B）200 mbar、（C）400 mbar、（D）800 mbar 和（E）1200 mbar。阀门驱动持续时间以红色阴影区域表示。所有实验均使用去离子水。绿色阴影区域表示三次独立测量的标准偏差。请点击此处查看该图的放大版本。

压力-流速曲线；动态过程中的时间依赖性分析，两个对比结果。
图7：阀门启动时，入口通道中试剂压力与流速之间的关系。（A）在恒定输入压力条件（300 mbar）下，阀门启动后流速降至零。（B）在恒定流速条件（2.5 µL/min）下，阀门启动导致通道内压力迅速升高，直至阀门卸压。阀门启动的持续时间显示为红色阴影区域。所有实验均使用去离子水。请点击此处查看该图的放大版本。

微流控装置示意图、微珠柱照片、强度图、条件箱线图、流体分析。
图 8：荧光液滴群的生成。（A）实验装置示意图，显示不同试剂与装置的连接方式。缩写：F = 荧光素，W = 蒸馏水，B = 蓝色食用染料，FC-40 = 氟化油，MO = 矿物油。（B）收集管中液滴的样本照片。（C）分析所得原始数据，显示在指定感兴趣区域（ROI）测得的平均荧光强度随视频文件帧数的变化。红线表示每种条件下峰值荧光的平均值（由三个入口特定组合生成的液滴群），虚线表示对应的标准误差。（D）不同条件下峰值高度的箱线图。圆点代表单个峰值，每种条件对应的箱体范围为对应峰值分布的第一至第三四分位数，粗线表示中位数。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1：设备操作的主界面程序。 用于手动加压控制通道以及在八通道进样设备上运行自动实验的控制界面。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：设备操作的备用主界面程序。 用于运行无条形码功能的八通道设备的控制界面。请点击此处下载该文件。

补充文件 3：带全局变量的 LabVIEW 子程序。 主界面程序中的子程序（SubVI），用于列出并显示主界面程序中全局变量的状态，即控制通道的状态。请点击此处下载该文件。

补充文件 4：用于保存全局变量值的 LabVIEW 程序。 主界面程序的一个子程序（SubVI），用于将阀门当前状态以数组形式保存，以便在用户非活动状态超过 30 秒时，维持阀门的相同状态。 请点击此处下载该文件。

补充文件 5：传输控制协议（TCP）LabVIEW 程序。 用于维持主界面程序与 WAGO 控制器之间 TCP 连接的子程序（SubVI）。请点击此处下载该文件。

补充文件 6：TCP 全局变量 LabVIEW 子程序。用于存储 TCP 输出变量的程序。请点击此处下载该文件。

补充文件 7：用于执行自动实验的输入文件。 本 .csv 文件编码了用于生成定量荧光液滴的实验所需的液滴群组成、序列及重复数，具体内容如本文所述。请点击此处下载该文件。

补充文件 8：荧光液滴群体分析用 Python 脚本。 自定义 Python 脚本，用于从液滴记录文件（.avi 文件）中读取荧光值。请点击此处下载该文件。

补充文件 9：凝胶栓荧光分析结果。 来自 Python 脚本的输出，包含记录中凝胶栓 5×5 感兴趣区域（ROI）的荧光值。请点击此处下载该文件。

补充文件 10：读取输出文件的 R 程序。 本研究中用于读取输出的荧光值并绘制原始数据、峰高和标准差的自定义程序。请点击此处下载该文件。

补充文件 11：用于分析和绘制荧光数据的 R 函数。 自定义的 R 函数，用于：1. 截取荧光值的原始数据，2. 定义不同的实验条件，3. 从给定条件中识别峰，4. 绘制原始数据与检测到的条件叠加的图，以及 5. 绘制识别出的峰与原始数据叠加的图。请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一套用于制备和操作基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控装置的方案，该装置可自动在油相中生成用于水包油微滴（称为“液滴”）的组合文库。将微流控技术与液滴技术相结合，提供了一种强大的方法，可将少量试剂封装于大量独立微区中，从而为大规模组合筛选开辟了新途径。

此前，已有多种技术被用于通过微流控方法生成化学性质不同的微区室，每种技术各有其优势与局限性。Kulesa 等人50描述了一种策略，利用微孔板将带有条形码的细胞封装于液滴中，并通过电场合并这些液滴，从而构建组合文库。尽管该方法可生成大量液滴组合，但其局限性在于工作流程中需要手动操作步骤。Tomasi 等人51开发了一种微流控平台，可将含有类球体（游离的细胞聚集体）的液滴与刺激物液滴合并，从而实现对类球体微环境的调控。该方法可用于研究细胞间相互作用及药物效应等重要现象，但通量相对较低。Eduati 等人46和 Utharala 等人47开发了一种基于微流控阀门的平台，能够以自动化方式生成高通量的组合文库。然而，在这些研究中，阀门通过盲文设备驱动，这需要微阀与微流控芯片之间进行繁琐的对准操作。本文所述系统的一个关键特征是采用了气动 PDMS 阀门来调控输入通道中的流体流动。由于这些阀门基于 PDMS 材料，因此可较为顺畅地整合到微流控芯片的制备步骤中。此外，它们也是控制入口通道中液体流动的相对简便方案，可通过外部气源施加压力来驱动。最后，这些阀门的加压与减压持续时间及顺序均可编程，从而实现以高通量方式自动化生成不同类型的液柱群体。另一重要特征是采用恒定压力模式通过入口注入试剂，这使得无需引入废液通道以释放恒定流速模式下可能产生的压力积聚。该设计简化了装置结构，减少了对额外阀门及控制废液通道阀门的硬件需求，并最大限度地减少了试剂浪费。

尽管使用PDMS制造器件相对简单，但此类器件的实施确实需要使用大量硬件设备，例如气动电磁阀（用于控制PDMS阀门的驱动）、压力泵（用于控制进样口和油相试剂的流动）以及软件程序（用于调控电磁阀）。尽管这些设备需要较大的前期投入，但该配置可确保器件运行的一致性和可靠性。此外，本方案中所述的硬件组件与架构采用模块化设计，因此某些模块可替换为其他替代方案，以降低成本或适应特定需求。例如，可根据实用性、预算、可获得性和便利性选择多种不同的泵52,53,54。对于敏感的进样试剂，还可额外加入流体储液池和温度调节装置23。此外，该设计可根据具体的科学需求进行放大或缩小。例如，本文描述了一种八通道进样原型，可将八种不同的试剂组合生成液滴。该系统可进一步扩展为16通道进样装置，从而实现更多进样通道及更大规模的组合。相应地，这将需要额外的控制通道和电磁阀来管理进样口，但此类原型能够生成更大规模且更多样化的组合文库。最后，在本文中，每种液滴群体均由微流控器件八个水相进样口中其中三个的开启而生成。观察发现，在该配置下，油相试剂压力约为200 mbar、水相试剂压力约为400 mbar时，液滴生成处于仅由阀门驱动所主导的稳定状态。当对油相施加更高压力时，会出现液滴断裂现象；而施加较低压力则会导致液滴融合。液滴生成的最佳压力范围取决于多种因素，包括参与液滴形成的进样口数量、流体的性质与黏度以及通道的尺寸，应根据实际情况进行优化。

在恒定压力条件下操作的一个缺点是，不同黏度的流体在恒定压力下具有不同的流速。因此，必须确保通过入口流动的水相试剂具有相近的黏度。使用不同黏度的流体会不仅影响入口通道中的流体流动，还会影响T型 junction处液滴的形成，从而破坏液滴群体的组成。另一个问题是T型 junction处残留试剂导致的液滴群体污染。当装置在生成不同液滴群体之间切换时，每个群体序列中的第一个或最后一个液滴往往会被前一个或后一个群体污染。这一问题可通过为每个群体生成额外的重复样本，并在分析时排除受污染的液滴来克服。最后，由于制造过程中的不一致性或外部因素（如压力波动），不同装置之间也可能存在差异。这一问题可通过多次重复使用同一微流控芯片，并确保在单个芯片上完成整个组合文库的运行，以最大程度减少这些不一致性的影响。.

本文介绍的微流控装置及配套的操作流程已用于展示定量组合式液滴库的制备。因此，该平台能够以高通量的方式快速生成不同液滴群体的组合文库。此类技术可用于多种筛选目的，包括但不限于对患者活检样本进行组合药物筛选——通过将活检获取的少量细胞分配至大量液滴中，并用多种抗癌药物组合进行处理，从而为特定患者样本优化个体化治疗方案——进而加速实现个体化癌症治疗46,48,55。

披露

F. E. 是 TheraMe! AG 的自由职业者。作者声明他们不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢埃因霍温理工大学纳米实验室（NanoLab TuE）的 Stacey Martina 在 HMDS 蒸气沉积方面的帮助。本研究由埃因霍温理工大学复杂分子系统研究所（ICMS）以及荷兰科学研究组织（NWO）引力计划 IMAGINE!（项目编号 24.005.009）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,1,3,3-四甲基二硅氧烷Merck Life Science NVMFCD00008256
4通道数字输入/输出模块WAGO Kontakttechnik GmbH750-504
丙酮Boom LabsBOOMSKEUZW3
分析软件埃因霍温理工大学https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE
AZ 40XT 11DMerck Life Science NV 212299 正性光刻胶 
AZ 726 MIF 显影液Merck Life Science NV10055824960正性光刻胶用显影液
活检打孔器，Rapid CoreWorld Precision Instruments Germany, GMBH504529内径 0.75 mm，带推杆
蓝色食用染料PMEFC1036
控制器终端模块 WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
以太网控制器 WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
FC-40Merck MilliporeF9755-100ML
Fluigent 流体控制单元FluigentFLU-S-D
Fluigent 压力控制系统 Fluigent MFCS-EZ 0 - 2 bar
荧光素Merck Life Science NVMFCD00005050
加热板 Torrey Pines Scientific HP61
倒置显微镜 Nikon Instruments Eclipse Ti-E
异丙醇Boom LabsBOOMSKEUZE3
LabVIEW（软件版本 20）埃因霍温理工大学https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_
VERSION_1		所有文件均已保存为 LabVIEW 版本 20 格式。建议使用此版本或更高版本打开文件。
Luer 接头短管 Instech Laboratories, Inc. LS2323 号规格，0.5"
公 Luer 接头转卡套式连接器 Cole Parmer 45505-32 内径 3/32"
MasterFlex PTFE 管Avator/VWR48634
显微镜载玻片VWR470150-480
显微镜载玻片 ，普通型Corning2947-75X50
矿物油Merck Millipore330760-1L
mr DEV 600Micro resist TechnologyR815100负性光刻胶用显影液
烘箱Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
氧气等离子体灰化仪Quorum TechnologiesK1050X
光掩模CAD/Art Services, Inc.
光掩模设计埃因霍温理工大学（改编自 Merten 实验室，EPFL）https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg
气动阀阵列FESTO1 个 8 阀阵列，常闭型阀门
硅晶圆Silicon Materials<1-0-0> 晶向，直径 100 mm，厚度 525 μm
单刃刀片 GEM Scientific
软管Fluigent内径 1 mm，外径 3 mm
旋涂仪 Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
体视显微镜 Olympus Corporation SZ61
SU-8 3050Kayakli Advanced MaterialsY311075 1000L1GL负性光刻胶
Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒（PDMS）Dow1317318
注射器B Braun Injekt - F Fine Dosage Syringe10303002
紫外 LED 曝光系统IdonusUV-EXP150S-SYS
真空泵 Vacuumbrand GmbH MD1C
电子天平 Sartorius M-prove

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