诱导小鼠角膜神经营养性角膜炎及神经再生的三种策略

摘要

本文提出了三种不同的方法来损伤支配角膜的感觉神经纤维。这些方法有助于在小鼠中研究轴突再生。这三种方法可适用于其他动物模型，是研究角膜神经支配生理学及再生的理想选择。

摘要

角膜是覆盖眼球并对于清晰视力至关重要的透明组织。它是人体中神经支配最密集的组织。这种神经支配为眼球提供感觉和营养功能，并有助于维持角膜的完整性。当这种神经支配发生病理性破坏时，称为神经营养性角膜炎。这种情况可由眼部损伤、手术或疾病引发。在本研究中，我们提出了三种不同的方法，以模拟临床上常见的三类病例，对神经支配造成损伤。

第一种方法是使用眼科钻头对上皮层进行机械刮除。该方法可去除上皮层、游离神经末梢以及基底下神经丛，其操作方式类似于临床中进行的准分子激光上皮下角膜磨镶术（photorefractive keratectomy）。第二种方法 仅通过皮肤活检钻在周围区域切断神经支配，从而靶向作用于神经支配，同时保持上皮的完整性。该方法类似于板层角膜移植术的初始步骤，可导致神经支配退化，随后轴突在中央角膜再生。最后一种方法利用多光子显微镜对转基因小鼠模型的神经支配造成损伤，该技术可精确定位荧光神经纤维的烧灼部位。该方法造成的损伤与光毒性角膜炎（紫外线过度暴露）相同。

本研究描述了探究角膜神经支配生理病理学的多种方法，特别是轴突的变性与再生。促进神经再生对于避免上皮缺损甚至角膜穿孔等并发症至关重要。所提出的模型可用于测试能够增强神经再生并延缓疾病进展的新型药理学分子或基因治疗手段。

引言

角膜是眼睛的透明表面，由三个不同的层次组成：上皮层、基质层和内皮层。该器官是人体中神经支配密度最高的组织，主要由来自三叉神经节眼支的感觉纤维（Aδ型和C型）构成。感觉纤维以粗大束状结构从周边进入角膜中基质层，并分支覆盖整个角膜表面。随后，这些纤维分叉穿透鲍曼膜，形成基底下神经丛，该神经丛在角膜中央形成漩涡状结构，易于识别。这些纤维最终终止于上皮层外表面的游离神经末梢。它们能够转导热、机械和化学刺激，并释放对上皮层稳态至关重要的神经营养因子^1,2。神经营养性角膜炎（NK）是一种影响角膜感觉神经支配的退行性疾病。这种罕见疾病源于角膜敏感性下降或丧失，导致泪液分泌减少以及角膜修复能力受损³。NK的进展可分为三个明确的阶段，从第1阶段患者出现上皮缺损，发展到第3阶段出现基质溶解和/或角膜穿孔⁴。

临床上，该疾病的病因可能多种多样。患者可能因眼部物理损伤、手术或慢性疾病（如糖尿病）而丧失角膜神经支配^5,6。迄今为止，神经性角膜病变（NK）的发病机制仍不甚清楚，针对这种威胁视力的疾病的治疗选择也非常有限。因此，有必要更深入地了解上皮缺损的特征，以更好地理解神经纤....

方案

所有实验均经国家动物实验委员会批准。

1. 准备工作

1. 配制用于麻醉的氯胺酮-赛拉嗪麻醉溶液。通过将 200 µL 氯胺酮（100 mg/mL）和 125 µL 赛拉嗪（20 mg/mL）溶于 2,175 mL 无菌 0.9% NaCl 中，配制成每千克体重给予 80 mg 氯胺酮和 10 mg 赛拉嗪的剂量。
2. 通过将 100 µL 的 0.3 mg/mL 布托啡诺溶液加入 1,400 mL 无菌 0.9% NaCl 中，配制浓度为 0.02 mg/mL 的布托啡诺溶液作为镇痛剂。
3. 配制荧光染色液。
   1. 使用精密天平称取 10 mg 荧光素盐，并将其溶于 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，得到 0.1% 的荧光素溶液。
   2. 避光并振荡 5 分钟。使用 10 mL 注射器和 0.2 µm 滤膜过滤该溶液。
      注意：荧光溶液需避光保存，可在 +4 °C 下保存 5 天。
4. 小鼠术前准备
   1. 称量小鼠体重，并按每克体重 10 µL 的麻醉液剂量进行腹腔注射以诱导麻醉。当小鼠停止活动后，将其置于加热板（37 °C）上，并通过轻捏脚趾确认其已完全麻醉。
   2. 在手术眼滴加一滴人工泪液，在对侧眼滴加一滴眼用凝胶。
   3. 当小....

结果

本研究提出了一系列在小鼠角膜神经支配上造成损伤的实验方案。尽管类似的方案已被用于研究上皮愈合的生理病理学过程，但我们选择改进并开发新的方法以研究角膜神经支配的再生。为了观察神经支配情况，我们采用了两种技术：首先，使用免疫荧光技术，通过泛神经元抗体（BIII 微管蛋白）标记神经纤维，并用嵌入剂标记细胞核；其次，利用一种在神经纤维中表达荧光蛋白的转基因小鼠品系。角膜样本通过落射荧光显微镜进行成像。

第一种方法使用眼科钻头配合0.5 mm的锈环去除器来去除角膜上皮层（图1A）。本研究重点关注上皮层内神经支配所受到的损伤，以期理解参与其再生过程的细胞与分子成分。手术前，基底上皮层保持完整，基底下神经丛中的神经纤维呈现出一种典型的漩涡状结构（图1B）。该技术所用钻头的尖端仅去除角膜的最表层，而保留了含有大量纤维束的基质层以及内皮层。钻头去除的上皮区域清晰可见，表现为基底上皮层和基底下神经丛的明显断裂（图1B）。角膜.......

讨论

神经营养性角膜炎被认为是一种罕见疾病，每10,000人中有5人受其影响。然而，因物理损伤（如化学烧伤）或某些综合征（如糖尿病或多发性硬化症）导致的神经营养性角膜炎患者并未被纳入这些统计数据中³。此外，该疾病存在显著的漏诊情况²²，因此其实际患病率被低估。目前迫切需要开发新的治疗方法和疗法，以促进轴突再生，从而保护患者的视力。现阶段，对于处于神经营养性角膜炎早期阶段的患者，唯一可用的治疗手段是使用支持角膜神经再生的药理学滴眼液^23,24,25。然而，这些药物仅在一定程度上有效。对于角膜出现更严重病变（如溃疡）的情况，羊膜移植或角膜移植^3,4可提供暂时性的解决方案，以闭合伤口并防止感染。但这些移植物必须在有限时间内更换，且每次额外手术都会增加排斥.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm 注射器滤器	CLEARLINE	51733
0.5 mm 除锈环去除剂	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL 塑料管	Eppendorf	30120094
Algerbrush 去骨钻，完整器械	Alger Equipment Company	BR2-5
抗 βIII 微管蛋白抗体	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
人工泪液	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
棉签	任意供应商	N/A
解剖工具	Fine Science Tools	N/A
荧光素	Merck	103887
冷水鱼皮明胶	Sigma	G7765
山羊血清	Merck	S26
头部固定器	Narishige	SGM 4
加热板	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	法国上市许可编号：FR/V/0167433 4/1992
LAS X 软件	Leica	N/A	大体积计算清除（LVCC）过程
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
激光功率计	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue 显微镜	Leica	N/A
多光子 Zeiss LSM 7MP 直立显微镜	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
参量振荡器	Coherent	N/A
带蓝色钴蓝滤光帽的便携式检眼镜	Bernell	ALPEN
培养皿	Thermo Scientific	150318	轴突切断术方案
培养皿	Thermo Scientific	150288	角膜全层铺片处理
Rompun 2%	Elanco	N/A	法国上市许可编号：FR/V/8146715 2/1980
无菌活检打孔器 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	封片介质