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方法文章

诱导小鼠角膜神经营养性角膜炎及神经再生的三种策略

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DOI：

10.3791/66182

⸱

2023年12月8日

 ,  ,  , 
1Institute for Neurosciences of Montpellier, University of Montpellier, INSERM, 2Department of Ophthalmology, Gui de Chauliac Hospital

本文内容

摘要

本文提出了三种不同的方法来损伤支配角膜的感觉神经纤维。这些方法有助于在小鼠中研究轴突再生。这三种方法可适用于其他动物模型，是研究角膜神经支配生理学及再生的理想选择。

摘要

角膜是覆盖眼球并对于清晰视力至关重要的透明组织。它是人体中神经支配最密集的组织。这种神经支配为眼球提供感觉和营养功能，并有助于维持角膜的完整性。当这种神经支配发生病理性破坏时，称为神经营养性角膜炎。这种情况可由眼部损伤、手术或疾病引发。在本研究中，我们提出了三种不同的方法，以模拟临床上常见的三类病例，对神经支配造成损伤。

第一种方法是使用眼科钻头对上皮层进行机械刮除。该方法可去除上皮层、游离神经末梢以及基底下神经丛，其操作方式类似于临床中进行的准分子激光上皮下角膜磨镶术（photorefractive keratectomy）。第二种方法 仅通过皮肤活检钻在周围区域切断神经支配，从而靶向作用于神经支配，同时保持上皮的完整性。该方法类似于板层角膜移植术的初始步骤，可导致神经支配退化，随后轴突在中央角膜再生。最后一种方法利用多光子显微镜对转基因小鼠模型的神经支配造成损伤，该技术可精确定位荧光神经纤维的烧灼部位。该方法造成的损伤与光毒性角膜炎（紫外线过度暴露）相同。

本研究描述了探究角膜神经支配生理病理学的多种方法，特别是轴突的变性与再生。促进神经再生对于避免上皮缺损甚至角膜穿孔等并发症至关重要。所提出的模型可用于测试能够增强神经再生并延缓疾病进展的新型药理学分子或基因治疗手段。

引言

角膜是眼睛的透明表面，由三个不同的层次组成：上皮层、基质层和内皮层。该器官是人体中神经支配密度最高的组织，主要由来自三叉神经节眼支的感觉纤维（Aδ型和C型）构成。感觉纤维以粗大束状结构从周边进入角膜中基质层，并分支覆盖整个角膜表面。随后，这些纤维分叉穿透鲍曼膜，形成基底下神经丛，该神经丛在角膜中央形成漩涡状结构，易于识别。这些纤维最终终止于上皮层外表面的游离神经末梢。它们能够转导热、机械和化学刺激，并释放对上皮层稳态至关重要的神经营养因子1,2。神经营养性角膜炎（NK）是一种影响角膜感觉神经支配的退行性疾病。这种罕见疾病源于角膜敏感性下降或丧失，导致泪液分泌减少以及角膜修复能力受损3。NK的进展可分为三个明确的阶段，从第1阶段患者出现上皮缺损，发展到第3阶段出现基质溶解和/或角膜穿孔4。

临床上，该疾病的病因可能多种多样。患者可能因眼部物理损伤、手术或慢性疾病（如糖尿病）而丧失角膜神经支配5,6。迄今为止，神经性角膜病变（NK）的发病机制仍不甚清楚，针对这种威胁视力的疾病的治疗选择也非常有限。因此，有必要更深入地了解上皮缺损的特征，以更好地理解神经纤维再生的机制，并可能促进其修复。本文提出了几种可在小鼠中诱导神经性角膜病变的角膜损伤模型。

第一种模型是使用眼科钻头刮除角膜上皮层。该模型主要被用于研究不同动物（如啮齿类动物和鱼类）角膜上皮的再生过程7,8,9，以及测试促进角膜愈合的分子10,11。从生理学角度来看，上皮细胞闭合伤口通常需要2至3天。然而，神经支配的正常模式恢复则需要超过四周的时间12,13。在手术过程中，眼科钻头会去除包含基底下神经丛及神经纤维游离末梢的角膜上皮层。该操作在临床上可类比于接受准分子激光角膜切削术（PRK）以矫正屈光不正的患者。该手术包括去除角膜上皮，随后使用激光重塑基质层14。患者在术后可能会出现多种副作用，例如角膜神经密度在术后两年内下降，以及术后3个月至1年内角膜敏感性降低15。鉴于此类手术会导致角膜微环境变得脆弱，该模型有助于深入研究这些副作用，并开发促进角膜更快再神经化的治疗策略，从而减轻上述不良反应。

第二种模型是使用活检打孔器在角膜周边部切断轴突，从而诱导中央神经支配发生瓦勒变性16。在临床上，该方法可类比于前板层角膜移植术，即外科医生对角膜进行部分环钻切除，去除角膜前部一定厚度的组织，并以供体移植物替代17。在板层角膜移植术后，患者可能出现多种症状，包括干眼、角膜神经支配丧失以及移植物排斥反应18。这种在角膜神经上实施的轴突切断模型，有助于深入了解移植后发生的神经纤维变性机制，以及随后的轴突再生过程。

第三种方法是使用激光损伤角膜神经。通过在麻醉动物的角膜上使用多光子显微镜，可诱导位于光学视野内的神经发生变性，这是由于活性氧（ROS）的形成导致DNA损伤和细胞空泡化19。该方法重现了因过度暴露于自然紫外线（日光灼伤）所引发的角膜光损伤，后者同样会触发活性氧的产生，进而导致DNA损伤20。患有角膜日光灼伤的患者会感到剧烈疼痛，因为上皮细胞的退化使角膜纤维末端完全失去保护。

本文所述的三种方法旨在用于研究自然杀伤细胞（NK）致病过程及轴突再生。这些方法易于重复且精确可靠，此外还能实现动物的快速恢复和便于监测。

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方案

所有实验均经国家动物实验委员会批准。

1. 准备工作

  1. 配制用于麻醉的氯胺酮-赛拉嗪麻醉溶液。通过将 200 µL 氯胺酮（100 mg/mL）和 125 µL 赛拉嗪（20 mg/mL）溶于 2,175 mL 无菌 0.9% NaCl 中，配制成每千克体重给予 80 mg 氯胺酮和 10 mg 赛拉嗪的剂量。
  2. 通过将 100 µL 的 0.3 mg/mL 布托啡诺溶液加入 1,400 mL 无菌 0.9% NaCl 中，配制浓度为 0.02 mg/mL 的布托啡诺溶液作为镇痛剂。
  3. 配制荧光染色液。
    1. 使用精密天平称取 10 mg 荧光素盐，并将其溶于 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，得到 0.1% 的荧光素溶液。
    2. 避光并振荡 5 分钟。使用 10 mL 注射器和 0.2 µm 滤膜过滤该溶液。
      注意：荧光溶液需避光保存，可在 +4 °C 下保存 5 天。
  4. 小鼠术前准备
    1. 称量小鼠体重，并按每克体重 10 µL 的麻醉液剂量进行腹腔注射以诱导麻醉。当小鼠停止活动后，将其置于加热板（37 °C）上，并通过轻捏脚趾确认其已完全麻醉。
    2. 在手术眼滴加一滴人工泪液，在对侧眼滴加一滴眼用凝胶。
    3. 当小鼠对夹趾刺激无反应时，按每克体重 5 µL 的剂量皮下注射镇痛药（0.02 mg/mL 布托啡诺），使布托啡诺终剂量达到 0.1 mg/kg。

2. 角膜擦伤

  1. 按照步骤 1.3 配制荧光染色液。
  2. 按照步骤 1.4 准备小鼠。
  3. 在进行角膜擦伤前，先将眼科钻头浸入 70% EtOH 中，再浸入 PBS 中以清洁钻头。
  4. 将小鼠侧卧放置在加热板（37 °C）上，以便于接触手术眼。
    1. 使用棉签吸除人工泪液，并将眼睫毛轻轻刷开，避免触碰眼球。
    2. 启动眼科钻头，用两根手指打开小鼠眼睑，同时固定触须以防止其卷入钻头中。
  5. 定位瞳孔或眼球中心，将眼科钻头接触眼球表面并进行环形运动。仔细观察可看到上皮被去除的区域；若无法观察，可在角膜上进行约 20 次环形运动。
  6. 将小鼠翻回腹卧位，检查对侧眼是否仍有眼用凝胶存在。
  7. 在擦伤的眼部滴加一滴荧光染色液，静置 20 秒。用纸巾吸除染色液，避免接触眼球，然后用一滴人工泪液冲洗。再用纸巾吸除人工泪液，并用钴蓝灯照射眼部进行观察。
    注：擦伤区域应呈圆形。获得标准圆形需经过一定训练。
  8. 在擦伤的眼部滴加一滴眼用凝胶，将小鼠留在加热垫上使其苏醒。当小鼠能够自主活动时，将其放回笼中。
  9. 在接下来的 2 天内监测动物的健康状况。
  10. 使用眼科钻头后，用软纸巾清除钻头头部粘附的上皮细胞，然后将其浸入 70% EtOH 中，再浸入 PBS 中。
    ​注：用软纸巾清除上皮细胞后，务必确保钻头头部无纸巾碎屑残留。

3. 角膜神经的轴突切断术

  1. 按照步骤 1.4 准备小鼠。
  2. 将小鼠置于双目放大镜下，侧放以便接触接受手术的眼睛。将培养皿底部置于小鼠头部下方，使眼睛保持水平。
    注意：以下步骤需通过双目放大镜进行观察。
  3. 用棉签擦除人工泪液，并去除睫毛，注意不要触碰眼睛。
  4. 将光滑的弯头镊子置于动物眼球下方，以将眼球推出眼眶。确保镊子闭合程度适中，使施加压力后眼球无法退回眼眶，但又不至于过度闭合而损伤视神经。
  5. 将 2.5 mm 的活检打孔器垂直放置于眼球表面，不施加压力，以确保打孔器与角膜表面完全接触。
    注意：当打孔器接触角膜时，操作者的手可能会遮挡视野。
  6. 然后开始施加压力，并多次旋转打孔器。
    注意：根据施加压力的大小，旋转次数可能有所不同，通常约为 5 次。需要经过训练才能掌握合适的压力和动作。若压力过大，眼球可能发生破裂，此时可见液体从损伤处流出，眼球变软，该动物需被处死。
  7. 移除活检打孔器。在角膜上应可见一个圆形印记，即为打孔位置。
    注意：后续步骤无需使用双目放大镜。
  8. 检查对侧眼是否仍有眼用凝胶，如有需要，向轴突切断眼滴加适量凝胶。
  9. 将小鼠置于加热垫（37 °C）上使其苏醒，待其能够自主活动后放回笼中。
  10. 在接下来的 2 天内观察动物的健康状况。

4. 角膜全层铺片处理

  1. 样本采集与固定
    1. 称重 小鼠腹腔注射麻醉液，剂量为每克体重10 µL。
    2. 当小鼠停止活动且脚趾夹捏无反射时，实施颈椎脱位术。
    3. 用两根手指将眼球推出眼眶，然后使用弯剪剪断视神经以摘除眼球。
    4. 将眼球置于含有 PBS 的 2 mL 塑料管中。
    5. 用4%多聚甲醛替换PBS，在室温下以30 rpm振荡20分钟，固定眼球。
    6. 在摇床（30 rpm）上，于室温用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  2. 角膜的解剖分离
    1. 在培养皿内的石蜡膜上滴加一滴 PBS。
    2. 将眼睛置于其中 PBS 滴液
    3. 将培养皿置于双目放大镜下。
    4. 使用显微解剖剪和镊子解剖角膜。在睫状体上方剪切，以保留角膜缘。
    5. 用精细镊子移除晶状体、睫状体和虹膜。
    6. 将角膜放回2 mL塑料管中。
  3. 免疫荧光实验方案
    1. 将角膜置于含有2.5%鱼皮明胶、5%山羊血清和0.5%去垢剂的2 mL PBS溶液中，在室温下振荡孵育1小时（30 rpm）。
    2. 在4 °C下，将角膜置于含有1/1000稀释的一抗（抗βIII微管蛋白抗体）的PBS溶液中，该溶液包含2.5%鱼皮明胶、5%山羊血清和0.1%去垢剂，总体积为150 µL，在摇床（30 rpm）上孵育过夜。
    3. 在摇床（30 rpm）上，用含 0.1% 去垢剂的 PBS 溶液于室温下振荡洗涤 3 次，每次 1 小时。
    4. 将角膜置于与步骤4.3.2相同的溶液中，加入1/500稀释的二抗，于4 °C在摇床（30 rpm）上孵育过夜。
    5. 在摇床（30 rpm）上，于室温用 PBS 洗涤 3 次，每次 1 小时。
    6. 在摇床（30 rpm）上，于室温下用150 µL按1/5000比例稀释的DNA嵌入染料孵育角膜10分钟。
    7. 用 PBS 冲洗 2 次，每次 5 分钟。
  4. 角膜的安装
    1. 将角膜放置在载玻片上，上皮面朝向载玻片，使用手术刀将其切成四个部分，但不要切至中心。
      注意：将相对的部分对齐，形成花朵形状。
    2. 将角膜内皮面向载玻片放置，并用纸巾吸除角膜周围的PBS。
      注意：不要移除角膜下方的PBS，否则可能出现气泡。若产生气泡，需向角膜添加PBS并去除气泡，然后从步骤4.3.2重新开始。
    3. 在矩形盖玻片的四个角上添加模型胶。
      注意：由于角膜是一种较厚的组织，模型胶会抬高盖玻片。
    4. 在角膜上滴加50 µL封片剂，小心地将盖玻片覆盖其上，避免产生气泡。
    5. 用指甲油封固盖玻片。
  5. 成像
    1. 将载玻片置于落射荧光显微镜下。
    2. 定义镶嵌图像的尺寸和图像的深度，然后开始采集。
    3. 对获取的图像应用去模糊和反卷积程序。
      ​注意：步骤 4.6.3 是在采集软件（大体积计算清除 [LVCC]）中选择的一个可选选项

5. 角膜神经的局部激光消融

  1. 开启直立式多光子显微镜及配备光学参量振荡器的激光器。启动显微镜的加热载物台（37 °C），并将激光器波长设定为850 nm和1100 nm，以匹配小鼠模型所需的激发波长。
  2. 使用功率计将两束激光的输出功率同时调节至约20 mW。
  3. 按照步骤1.4准备小鼠，并在双眼表面涂抹眼用凝胶。
    注意：本实验所用动物必须来自一种转基因小鼠品系（MAGIC-Marker转基因小鼠21），该品系可在角膜神经纤维中表达内源性荧光蛋白。
  4. 将小鼠固定于头部固定装置中，将其身体旋转90°，使待观察的眼睛朝向天花板方向。
  5. 将小鼠的胡须固定，以清除眼部区域的遮挡；同时固定其身体，以减少呼吸引起的头部移动。
  6. 在涂有眼用凝胶的眼球表面放置一个圆形盖玻片，确保盖玻片保持水平。如有必要，可轻微调整小鼠头部位置，以确保盖玻片正确放置。
  7. 在盖玻片上方滴加一滴PBS缓冲液。小心地将小鼠放置于显微镜载物台上，并将物镜转盘调整至合适距离。
  8. 使用水浸20倍物镜和落射荧光模式，通过目镜定位眼球及其神经支配区域。
  9. 启动激光器，并设定需要照明的成像深度。
  10. 以最大扫描速度的70%–85%的采集速率，获取1024 × 1024（像素）的图像。
  11. 完成图像采集后，将小鼠从显微镜上取下，移除盖玻片和固定带，再将其从头部固定装置中取出。根据需要补加眼用凝胶，并将小鼠置于加热板上的笼中，使其自行苏醒。
    注意：神经支配的破坏通常在成像后1周内可被观察到。本方案可每周重复一次，持续数周，以增强激光造成的损伤效应。
  12. 当小鼠能够自主活动后，将其放回饲养环境，并在接下来的2天内监测其健康状况。

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结果

本研究提出了一系列在小鼠角膜神经支配上造成损伤的实验方案。尽管类似的方案已被用于研究上皮愈合的生理病理学过程，但我们选择改进并开发新的方法以研究角膜神经支配的再生。为了观察神经支配情况，我们采用了两种技术：首先，使用免疫荧光技术，通过泛神经元抗体（BIII 微管蛋白）标记神经纤维，并用嵌入剂标记细胞核；其次，利用一种在神经纤维中表达荧光蛋白的转基因小鼠品系。角膜样本通过落射荧光显微镜进行成像。

第一种方法使用眼科钻头配合0.5 mm的锈环去除器来去除角膜上皮层（图1A）。本研究重点关注上皮层内神经支配所受到的损伤，以期理解参与其再生过程的细胞与分子成分。手术前，基底上皮层保持完整，基底下神经丛中的神经纤维呈现出一种典型的漩涡状结构（图1B）。该技术所用钻头的尖端仅去除角膜的最表层，而保留了含有大量纤维束的基质层以及内皮层。钻头去除的上皮区域清晰可见，表现为基底上皮层和基底下神经丛的明显断裂（图1B）。角膜...

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讨论

神经营养性角膜炎被认为是一种罕见疾病，每10,000人中有5人受其影响。然而，因物理损伤（如化学烧伤）或某些综合征（如糖尿病或多发性硬化症）导致的神经营养性角膜炎患者并未被纳入这些统计数据中3。此外，该疾病存在显著的漏诊情况22，因此其实际患病率被低估。目前迫切需要开发新的治疗方法和疗法，以促进轴突再生，从而保护患者的视力。现阶段，对于处于神经营养性角膜炎早期阶段的患者，唯一可用的治疗手段是使用支持角膜神经再生的药理学滴眼液23,24,25。然而，这些药物仅在一定程度上有效。对于角膜出现更严重病变（如溃疡）的情况，羊膜移植或角膜移植3,4可提供暂时性的解决方案，以闭合伤口并防止感染。但这些移植物必须在有限时间内更换，且每次额外手术都会增加排斥...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Karine Louplier 博士提供转基因小鼠品系 MAGIC-Markers。作者还感谢 RAM-Neuro 动物实验中心以及影像设施 MRI，该设施是法国生物成像国家基础设施（France-BioImaging）的成员，获得法国国家科研署（ANR-10-INBS-04，"投资未来"）的支持。本研究得到 ATIP-Avenir 项目、法国国家健康与医学研究院（Inserm）、奥克西塔尼大区、蒙彼利埃大学、法国国家科研署（ANR-21-CE17-0061）、法国医学研究基金会（FRM 再生医学，REP202110014140）以及顾玛基金会（Groupama Foundation）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 µm 注射器滤器CLEARLINE51733
0.5 mm 除锈环去除剂Alger Equipment CompanyBU-5S
2 mL 塑料管Eppendorf 30120094
Algerbrush 去骨钻，完整器械Alger Equipment CompanyBR2-5
抗 βIII 微管蛋白抗体Abcamab18207
AntigenfixDiapathP0016
人工泪液Larmes artificielles MartinetN/A
BuprecareAnimalcareN/A
棉签任意供应商N/A
解剖工具Fine Science ToolsN/A
荧光素Merck103887
冷水鱼皮明胶SigmaG7765
山羊血清MerckS26
头部固定器NarishigeSGM 4
加热板BIOSEB LAB instrumentsBIO-HE002
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Imalgene 1000BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH FranceN/A法国上市许可编号：FR/V/0167433 4/1992
LAS X 软件LeicaN/A大体积计算清除（LVCC）过程
Laser Chameleon Ultra IICoherentN/A
激光功率计CoherentN/A
Leica Thunder Imager Tissue 显微镜LeicaN/A
多光子 Zeiss LSM 7MP 直立显微镜ZeissN/A
Ocry-gelTVM labN/A
参量振荡器CoherentN/A
带蓝色钴蓝滤光帽的便携式检眼镜BernellALPEN
培养皿Thermo Scientific150318轴突切断术方案
培养皿Thermo Scientific150288角膜全层铺片处理
Rompun 2%ElancoN/A法国上市许可编号：FR/V/8146715 2/1980
无菌活检打孔器 2.5 mmLCH medicalLCH-PUK-25
Triton X-100VWR0694
VectashieldEuroBioSciencesH-1000封片介质

参考文献

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