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方法文章

从Aplysia中获取神经元细胞培养物用于生长锥的高分辨率成像

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DOI：

10.3791/662

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2008年2月20日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University

本文内容

摘要

加州海兔（Aplysia californica）神经元在培养中会形成较大的生长锥，非常适合对生长锥运动性和导向性进行高分辨率成像。本文介绍了一种用于分离和培养加州海兔囊状细胞神经元，以及建立活细胞成像腔室的实验方案。

摘要

神经元生长锥是轴突末端高度可移动的结构，能够感知环境中的导向信号，并将这些信息转化为定向运动，从而导向适当的目标细胞。为了深入理解导向信息如何从细胞表面传递至下方动态的细胞骨架网络，需要一个适用于高时空分辨率下活细胞成像的蛋白质动态研究模型系统。典型的脊椎动物生长锥体积过小，难以对F-actin和微管动力学进行定量分析。加州海兔（Aplysia californica）的神经元大小是脊椎动物神经元的5-10倍，可在室温下轻松培养，且细胞极为坚固，适合显微操作和生物物理测量。其生长锥具有明确划分的胞质区域以及结构特征清晰的细胞骨架系统。可通过显微注射将多种探针导入神经元胞体，用于研究生长锥的运动性与导向机制。本实验方案中，我们演示了腹神经节的解剖、袋状细胞神经元的培养以及用于生长锥活细胞成像的成像腔室的建立方法。 关键词：生长锥，神经元，Aplysia californica，活细胞成像，微管动力学，F-actin，袋状细胞，腹神经节，细胞骨架，显微注射

方案

溶液

  • L15-ASW 细胞培养基（1 L）
    • 1 袋 L15 粉末
    • 加入 800 mL 超纯 H2O
    • NaCl 400 mM
    • MgSO4         27 mM
    • MgCl2          28 mM
    • L-谷氨酰胺   4 mM
    • 庆大霉素    50 µg/mL
    • HEPES         5 mM
    • 调节 pH 至 7.9
    • 逐滴加入 CaCl2 9.3 mM（若出现沉淀则停止）
    • 用超纯 H2O 定容至 1 L
    • 使用渗透压仪（蒸气压法，Wescor # 5520）检测渗透压（950–1000 mmol/kg）
    • 使用正压过滤装置经 0.22 µm 滤膜过滤（滤器：Millipore SVGV010RS）
    • 4°C 保存，最长一个月
  • 聚-L-赖氨酸（70–150 kD）200 µg/mL 储存液，溶于无菌超纯 H2O，-20oC 保存
  • 0.5 M MgCl2 溶液

第1天：Aplysia 腹神经节的解剖

酶解离溶液的制备

  1. 称取 9-10 mg Dispase 酶（Worthington，货号：LS02111）至一个 Eppendorf 管中
  2. 加入 900 µl L15-ASW 培养基和 100 µl 无菌超纯水（H2O）
  3. 混匀后置于室温（RT）下

腹部神经节的解剖

  1. 用50 ml注射器吸取0.5 M MgCl2溶液。
  2. 从水箱中取出一只动物，操作时动作轻柔，避免引发动物的墨汁防御反应。
  3. 将Aplysia侧置于解剖板（泡沫板）上，头端朝右，尾端朝左。
  4. 将针头插入动物头部后方，将全部MgCl2溶液注入体腔内。
  5. 轻轻揉搓动物，使MgCl2溶液在体腔内均匀分布，静置数分钟，直至动物完全麻醉。
  6. 用两根针将动物的头部和尾部固定在解剖板上。
  7. 用镊子提起皮肤，用大剪刀沿头尾方向剪开皮肤和肌肉层，形成一个较大的侧向开口。
  8. 在刷状卵巢下方找到腹神经节。用镊子夹住腹神经节前方约1 cm处的连接神经，用解剖剪在镊子夹持位置前方以及腹神经节后方将神经剪断。
  9. 将神经节放入Dispase溶液中，在22°C条件下于温控水浴中孵育15–16小时。

第2天：Aplysia囊泡细胞的铺板

制备多聚赖氨酸包被的盖玻片

  1. 在流动实验台中，准备三个35 mm的培养皿作为解剖神经节的工作皿，每个培养皿中加入4 ml L15-ASW培养基。消化15.5小时后，将腹神经节从dispase溶液转移至其中一个工作皿中。
  2. 使用镊子取出保存在乙醇中的酸清洗#1.5盖玻片（22×22 mm），去除乙醇后，将盖玻片在本生灯火焰上短暂灼烧以灭菌（仅短暂接触火焰，避免塑料熔化！）。待其短暂冷却后，放入培养皿中。
  3. 通过在本生灯火焰上弯曲黄色移液枪头（仅短暂加热，避免塑料熔化！）制备弯曲的铺板枪头。
  4. 用无菌超纯H2O稀释200 µg/ml的母液，配制适量的20 µg/ml多聚赖氨酸溶液。
  5. 每张盖玻片上加入500 µl 20 µg/ml多聚赖氨酸溶液，在室温下孵育20分钟。
  6. 每张盖玻片用500 µl无菌超纯H2O洗涤3–5次，每次更换液体。
  7. 吸除盖玻片上的水分；每个培养皿中加入4 ml L15-ASW培养基。

解离囊状细胞

  1. 在解剖显微镜下，使用先前用95%乙醇清洗过的解剖剪刀和镊子将腹神经节切成两半（图1第1行）。
  2. 在神经节的一半上，于囊细胞簇与半侧神经节细胞之间进行切割（图1第2行），并在囊细胞簇的另一侧去除残留的神经突起（图1第3行）。每次操作仅处理一半神经节；当第一个囊细胞簇的细胞正在铺板时，将另一半保留在培养皿中。
  3. 使用两把镊子（或一把镊子和解剖剪刀），通过推开包裹囊细胞簇的结缔组织鞘来释放囊细胞簇。如有需要，可用解剖剪刀剪除结缔组织。操作过程中注意避免过度挤压或频繁触碰囊细胞簇。
  4. 当大部分结缔组织被去除后，用预先准备好的弯头黄色移液吸头将囊细胞簇转移至新的操作培养皿中。注意避免囊细胞簇被卡在黄色吸头内部，或滞留在液面与空气交界处。
  5. 用黄色吸头反复吹打细胞簇，以分离单个囊细胞。操作时将细胞簇在吸头中反复吸入和推出。起始时使用较低的剪切力，并根据需要逐渐增加力度。始终采用能够分离神经元但又不至于杀死过多细胞的最小作用力。
  6. 收集3–5个健康的囊细胞，并将其转移至含有聚赖氨酸包被盖玻片的培养皿中。避免挑取死亡细胞（中心呈黑色或透明状）以及结缔组织碎片。
  7. 重复步骤6，将约15–25个活神经元放置在每张盖玻片的中央区域。若同时转移了死亡细胞或碎片，可通过挑取或吹打方式将其从健康细胞周围移除。整个过程对两个细胞簇的操作大约需要2–3小时。
  8. 操作完成后，将培养皿置于超净工作台上，室温下静置至少2小时，以使细胞充分贴壁（关闭超净台吹风装置，避免产生不必要的振动）。
  9. 将培养皿放入14°C培养箱中过夜，或保存至后续实验使用。生长锥可在4–10小时内形成。

半侧神经节细胞和袋细胞簇在神经通路中的解剖图示。
图1. 加州海兔（Aplysia californica）腹神经节示意图。彩色线条指示获取袋细胞簇的切割位置。

第3天：设置培养室以进行Aplysia囊细胞的活体成像

成像室的组装

  1. 在进行活细胞成像实验之前，先用低倍显微镜检查囊泡细胞。如果细胞未形成健康的生长锥，需更换新鲜培养基，并在室温下静置1-2小时。
  2. 为培养皿提供新鲜的L15-ASW培养基时，使用真空泵吸除约一半（~2 ml）旧培养基，然后每皿加入2 ml新的L15-ASW培养基。注意切勿一次性完全移除所有培养基，以免将细胞从盖玻片上剥离。
  3. 进行囊泡细胞成像时，我们将两片盖玻片和两个塑料垫片组装成类似三明治结构的成像室。三明治结构中的上层盖玻片被裁短，以便于更换培养基和试剂。组装过程中，附着囊泡细胞的盖玻片必须始终浸没在L15-ASW培养基中，以防止细胞脱落。
  4. 准备成像室时，使用金刚石笔（玻璃切割刀）和直尺，从22×22 mm的#1盖玻片右侧切下约2 mm。
  5. 使用1 ml注射器，在较短的盖玻片两侧涂抹高真空脂，然后在每侧贴上塑料垫片。再在两个垫片的顶部涂抹真空脂。
  6. 将盖玻片与垫片的组装体翻转，放入含有附着于盖玻片上的囊泡细胞的培养皿中。使用两根棉签的反向末端对齐并轻轻按压，使上层盖玻片牢固粘附在下层盖玻片上。
  7. 用镊子轻轻将三明治结构整体从培养皿中取出，确保培养基不泄漏。如有需要，调整两片盖玻片的位置，并用无尘纸（Kimwipe）擦去多余的培养基。将组装好的三明治结构放置在显微镜载物片底座上，并小心使用夹具固定盖子。
  8. 用蘸有玻璃清洁剂（使用Sparkle作为玻璃清洁剂）的棉签清洁三明治结构上表面的中心区域。随后用第二根干燥的棉签迅速擦干清洁剂，避免留下条纹。对下层盖玻片进行相同操作。无条纹残留的洁净盖玻片对于高质量成像至关重要。

将细胞袋放入显微镜下

由于 Aplysia 袋细胞神经元培养的密度较低，建议使用具备载物台定位功能的显微镜系统，以便于在不同细胞之间切换。在成像实验期间，袋细胞可在室温下长时间置于显微镜载物台上数小时。需定期更换培养基，以防止蒸发。

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讨论

无脊椎动物Aplysia的袋细胞神经元提供了一种无血清的神经元细胞培养体系，其中非神经元细胞极少。这些神经元可形成体积较大的生长锥，适用于研究多个重要的细胞生物学问题。袋细胞神经元可在室温下长时间（数小时）进行操作和成像。利用荧光斑点显微技术（FSM），可对F-肌动蛋白和微管的聚合及转运动态的各种参数进行定量分析。结合近期发布的Aplysia基因组信息以及不断优化的表达技术，这些神经元已成为研究神经元生长锥运动与导向的分子和细胞机制的有力模型系统。

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致谢

我们感谢Ryan Maneri（Oystercatcher Productions, LLC）对本实验操作的拍摄，以及Rodney McPhail（普渡大学生物科学系）在剪辑解剖视频过程中提供的帮助。Suter实验室的研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号R01 NS049233）和普渡大学Bindley生物科学中心向D.M.S.提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#1 玻璃盖玻片 22x22 mm工具VWR international48366067
#1.5 玻璃盖玻片 22x22 mm工具Corning2870-22
35 mm 培养皿工具Falcon BD353001
用于培养基过滤的滤器工具EMD MilliporeSVGV010RS
高真空润滑脂工具Dow Corning1597418
渗透压计工具Wescor5520
塑料垫片工具Small Parts, Inc.SHSP-200
氯化钙试剂Fisher ScientificC79-500
庆大霉素试剂Invitrogen15750-060
HEPES试剂Sigma-AldrichH4030
L15 培养基试剂Invitrogen41300-039
L-谷氨酰胺试剂Sigma-AldrichG8540
氯化镁试剂Mallinckrodt Baker Inc.5958-04
硫酸镁试剂Mallinckrodt Baker Inc.6070-12
聚-L-赖氨酸（70-150 kD）试剂Sigma-AldrichP6282
氯化钠试剂Mallinckrodt Baker Inc.7581
中性蛋白酶（Dispase）试剂Worthington BiochemicalLS02111

参考文献

  1. Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
  2. Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
  3. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
  4. Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).

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