实验室与野外环境下鞋笠螺（Crepidula fornicata）幼虫的培养

摘要

本文介绍了在小体积实验室规模系统以及可在野外部署的常温海水模拟生态系统中培养腹足类动物Crepidula fornicata幼虫的方法。

摘要

帽贝科腹足类软体动物Crepidula fornicata已被广泛用于幼虫发育生物学、生理学和生态学的研究。该物种的孵化期面盘幼虫通过成体自然释放后，用虹吸法收集到筛网上，以200/L的密度分配至培养体系中，并以等鞭金藻（T-ISO品系，Isochrysis galbana）为饵料，投喂浓度为1 × 10⁵ 个细胞/mL。通过在通风的800 mL培养体系中培育同胞幼虫，记录其壳体生长情况以及变态能力的获得过程，该培养体系设计用于与环境空气或特定大气气体混合物达到平衡。与上述实验室培养条件相对照，还在野外繁殖成体种群附近设置了一个15 L的流水式自然海水中型模拟生态系统（mesocosm），用于收集在该环境中培育幼虫的生长和变态能力数据。实验室培养条件下的幼虫生长速率和获得变态能力的时间与以往发表的研究结果相似；而在野外中型模拟生态系统中培育的幼虫生长显著更快，且比所有已报道的实验室研究中的幼虫更早达到变态阶段。综上，这些方法适用于在实验室预设的受控条件下以及在野外自然条件下开展幼虫发育的研究。

引言

由于可作为发育生物学研究的模式生物，以及作为入侵物种对生态环境造成广泛影响，笠螺 Crepidula fornicata（腹足纲：Calyptraeidae）在当前及历史研究文献中均有充分记载。在实验胚胎学的经典时代，它曾是研究螺旋卵裂发育模式的基础性范例¹，并随着现代成像技术和基因组学工具的应用，重新成为研究担轮动物（lophotrochozoan）早期发育机制的重要对象^2,3。在其生活史的另一阶段，其他研究则聚焦于这种生态系统工程师在远离其原生分布区——北美东部的温带沿海海洋环境中，成体种群所造成的生态影响^4,5。介于胚胎与成体之间，该物种的面盘幼虫（veliger larvae）已成为幼虫发育与生态学研究的常见对象，尤其涉及影响幼虫生长及变态能力获得的因素、调控幼虫附着的内外部信号，以及幼虫期经历对稚贝阶段表现的影响等课题^{6,7,8,9,10,11}。近期研究表明，C. fornicata 的幼虫和稚贝对海洋酸化具有较强的耐受能力，这为该动物的进一步研究提供了又一富有前景的方向^{12,13,14,15,16}。

研究海洋幼虫生物学时，C. fornicata 的一个优势在于，其在实验室中使用天然或人工海水，并以定鞭藻 Isochrysis galbana 作为单藻类食物进行培养相对容易。作者曾在早期以方法学为重点的印刷出版物中详细描述过相关培养方法¹⁷。本研究的贡献主要有两点：首先，建立和维护培养体系所涉及的常规操作步骤在概念上非常简单，但若无实际操作或视频演示，很难正确掌握；其次，本文介绍了对先前所述培养方法的两种改进，特别适用于针对海洋酸化、富营养化和缺氧等环境胁迫因素的实验室与野外研究。第一种为小体积（800 mL）培养系统，可通过小体积鼓泡气体精确调控海水的 pH 和溶解氧水平；第二种为较大体积（15 L）的中型模拟生态系统（mesocosm）系统，可置于野外环境中，并允许周围海水自由交换。

方案

1. 建立和维持C. fornicata幼体培养的常规操作

注意：本方法起始于一个装有海水的加仑（3.8 L）广口瓶，海水中含有刚释放出孵育的面盘幼虫的成体C. fornicata。成体可从野外采集，或从材料表中列出的供应商处获得。材料表中给出了相关供应商信息。这些成体为雄性先熟的雌雄同体，以交配堆叠的方式生活，堆叠底部为固着生活的孵育雌性个体。请勿打散成体的堆叠结构。繁殖的季节性特征以及非繁殖季节诱导成体产卵的预处理方法此前已有描述¹⁷。幼虫在释放后2–3小时内收集最佳，此时幼虫具有强烈的负趋地性，会聚集在广口瓶的水面附近。

1. 通过剪掉一个400 mL一次性塑料三角烧杯的底部，并在其上粘贴一块236 µm的尼龙筛网，制作一个筛子。为此目的，尤其是用于中型生态系统（mesocosm）的构建（见下文），应使用专为聚乙烯材料具有良好粘附性的热熔胶。
2. 停止成体培养罐中的通气，静置15–20分钟，使碎屑沉降，幼虫可轻松游至水面。
3. 将幼虫通过一段短玻璃管（直径5 mm，长15–20 cm）虹吸，该玻璃管固定在一段60–80 cm长的软质塑料水族管末端，导入上述制备好的筛子中，筛子悬置于一个600 mL玻璃烧杯内，使过量海水从烧杯溢出，而幼虫被截留在筛网上。保持筛子底部浸没在水中，避免幼虫滞留干涸。
4. 短暂将筛子从烧杯中提起，使用装有滤过海水（FSW）的冲洗瓶，将幼虫冲洗至一个大小适中、便于在低倍解剖显微镜下操作的玻璃培养皿中的滤过海水中。
   注：C. fornicata的幼虫在盐度约为30 ppt的滤过天然海水或配制成32 ppt盐度的Instant Ocean人工海水、温度20–25 °C条件下生长良好^17,18。使用孔径< 1 µm的过滤足以去除可能对实验室培养造成问题的污染性表生原生生物。
5. 使用巴斯德移液管手动将所需数量的幼虫转移至培养罐中，并进行计数。为获得最佳效果，C. fornicata的培养建议按每5 mL培养液体积接种1只幼虫。务必准确计数幼虫，避免估算数量。
6. 在开始培养时给予幼虫所需量的微藻饲料，并每隔一天在更换培养液时同步更换微藻。
   注：以每毫升1 × 10⁵个细胞的Isochrysis galbana（T-ISO品系）作为饲料，是一种良好的标准食谱，可获得接近最大值的实验室生长速率。T-ISO的饲喂量及培养方法详见先前发表的研究¹⁷。
7. 每隔一天更换一次培养液，方法是将培养物倒入置于烧杯中的筛子内，操作同上文步骤1.3 。取出筛子后，用装有滤过海水（FSW）的冲洗瓶将幼虫冲洗至含有新鲜FSW和新饲料的培养罐中。
   ​注：最佳操作是将用于幼虫培养的所有玻璃器皿单独存放，避免其接触固定剂、可溶性重金属盐或洗涤剂。常规清洗建议使用碳酸氢钠（NaHCO₃）糊剂配合尼龙刷垫进行，而矿物沉积物可用白醋或稀盐酸进行轻度酸洗去除。

2. 构建C. fornicata幼虫的通气培养系统

注意：推荐使用的玻璃罐（材料表）配有聚丙烯盖，该材质对海水呈惰性，且厚度适宜，可牢固固定通气气体流的管路接头入口。

1. 在每个培养罐的盖子（包括盖子的内衬）上钻两个直径为5 mm的孔，每个孔距离边缘约1.5 cm，且两孔相对分布。（使用13/64英寸英制或#7 ASME标准机械钻头也可打出合适的通孔）。
2. 在每个孔中安装一个1/8英寸×10-32螺纹尼龙管接头，使用10-32尼龙螺母固定，使管接头的带倒刺端位于盖子外表面。
3. 在其中一个管接头螺纹内端的孔口处涂抹少量硅胶水族密封剂，从罐内侧将一段20 cm长、外径为2 mm的聚乙烯管穿过孔口，使其从管接头倒刺端外侧略微突出几毫米。
4. 此时聚乙烯管末端将带有少量水族密封剂形成的塞状物，但在倒刺端外侧仍可清晰看到透明管体。待密封剂固化后，修剪聚乙烯管的突出部分，使其末端与管接头倒刺端齐平。
5. 向培养罐中加入过滤海水（FSW），液面距罐顶肩部约1 cm，拧紧盖子，并将通气空气或实验气体混合物的供气管连接至装有聚乙烯通气管的管接头倒刺端。修剪通气管长度，使其末端恰好平齐地置于罐底。
6. 调节通气空气或气体混合物的流量，使产生缓慢的气泡流（图1）。可使用普通水族空气泵配合水族多路阀门提供环境空气通气，或使用质量流量控制器提供其他实验所需的气体混合物¹⁴。

3. 用于幼虫的可野外部署的中型生态系统培养装置的构建 C. fornicata

1. 在标准的7加仑聚乙烯桶的侧面切割4个等距分布的矩形开口，每个开口尺寸为25 cm × 14.5 cm。每个开口的底部距离桶内底部约3.5 cm图2A）。手持式电动马刀锯配细齿锯片最适合此用途。保留切下的废料部分，使用台式锯将其纵向切成宽2厘米的条状。
2. 剪下4块236 µm尼龙网片，每块至少30 cm × 20 cm，确保能够完全覆盖桶上切出的开口并留有至少2 cm的重叠余量。使用小型弹簧夹或衣夹将一块网片的一条长边临时固定在对应开口的一条长边上。
3. 使用适用于聚乙烯的热熔胶将网片边缘粘接到桶口。第一条边固定后，在保持张力的同时将其他边缘依次粘接，使网片表面绷紧。
4. 修剪3.1步骤中得到的桶体废料条，制成加固条，以整齐覆盖网格面板与桶口重叠处的粘合区域。使用足量的热熔胶将每条加固条压紧就位，操作需迅速，确保在胶水凝固前完成每条加固条的粘贴。
5. 用尼龙盲铆钉从桶的外侧固定每条加强条的末端。使用美工刀修剪加强条外边缘多余的胶水和网状材料。
   注意：每个铆钉需要一个 15/64 英寸的导孔。铆钉的内部（盲端）部分在完成的中型生态系统装置内侧可见 图2B.
6. 将中宇宙系统部署在浮架上，使桶的顶部高出水面足够高度（图 2C所示的漂浮架由30 cm长的2英寸40号PVC管段构成，使用弯头和三通接头粘合连接，形成一个气密结构，可承载一排4个重复的中型生态系统（mesocosm）。
7. 根据当地条件，网箱面板可能在1至2天内出现污损，从而阻碍围隔内海水的交换。一旦发生此类情况，应将幼体转移至新的清洁围隔中，方法是将已污损的围隔拉出约三分之二^rd 从水中取出，然后用2 L的水壶从其底部反复舀水倒入新的中宇宙装置中。
8. 进行20至25次操作以转移大部分幼体，或直至在污染的中型生态系统中不再观察到幼体为止。使用浸有碳酸氢钠（NaHCO₃）糊状物的软海绵轻轻擦洗网板，清洁污染的中型生态系统。₃）并用自来水冲洗。

结果

在4个同时进行的重复实验中，对800 mL通气培养体系中的幼虫生长及变态能力获得情况进行测定，每个培养体系含有160条幼虫，幼虫来源于同一卵块孵化的同胞批次，并进行投喂 Isochrysis galbana 密度为 1 x 10⁵ 细胞/mL。pH 为 7.9–8.0，温度为 20–21 °C，盐度为30–31 ppt。另取一批同源幼虫，在美国马萨诸塞州布兹德湾（Buzzards Bay, MA, USA）进行一次15 L中型生态系统实验，实验条件与实验室培养相似，pH、温度和盐度相同，但通过中型生态系统的网状面板流入周围海水，以天然浮游植物为饵料，共投放600条幼虫，用于测定其生长与变态情况。实测pH为7.8–8.3，温度为20–24 °C，盐度为26-28 ppt。生长情况通过壳长的变化来确定（图3）。幼虫在中型生态系统（mesocosm）中的生长速度更快（71 µm/day) 而实验室培养物中的含量则较低（54 µm/day孵化后的最初4-5天内（图4）。在 5^th 和 6^th 天后，中型实验系统中的幼虫开始自发变态，第6天仍留在中型实验系统中的幼虫平均为 181 µm 比第5天更大。由于大多数个体在第7天时已完成变态，因此未再对中型实验系统中的幼体进行后续测量。实验室培养中的幼体在第4天至第8天期间生长速度明显较慢41 µm/day）以及从第8天到第13天（31 µm/day）。这些幼虫在第8天开始获得变态能力，到第12天时几乎全部具备变态能力，通过用高浓度[K⁺]，在⁸实验室培养中自发变态的情况很少<在实验终止的第13天，存活率为91%–100%（实验室培养物中）；由于难以检查和回收中型生态系统装置内所有个体，中型生态系统中的存活率未测定。

图1：通气培养装置。 该图显示了800 mL的通气培养体系，其中含有Crepidula fornicata的幼虫，培养密度为每5 mL 1条幼虫。注意可见细小的气泡流，尤其在2号和4号广口瓶中更为明显。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：可野外部署的中型生态系统培养装置。 该图显示了15 L的中型生态系统装置，（A）侧视图，（B）俯视图，以及（C）在浮架中部署的装置。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：Crepidula fornicata 孵化后第 4 天的面盘幼虫。 虚线表示壳长测量轴线。缩写：s = 壳；v = 面盘；f = 足；o = 操作器。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4：Crepidula fornicata 幼虫在实验室与野外培养条件下的生长情况。 800 mL 实验室培养（虚线，空心圆）与 15 L 野外中型生态系统（实线，实心方块）中幼虫的生长情况。每个数据点代表来自4个重复实验室培养中每个培养15只幼虫的平均值，或来自单个中型生态系统的25只幼虫的平均值。误差线表示 ± 1 SD。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

尽管与其它浮游营养型海洋幼虫相比，C. fornicata 的幼虫相对容易培养，但仍必须严格遵守良好的培养操作基本规范^17,19。健康的幼虫应在孵化后立即开始摄食。可通过解剖显微镜下透射光观察幼虫肠道是否充满藻类细胞，于孵化后第二天轻松验证其摄食情况。健康幼虫的壳应保持清洁、光亮，无固着纤毛原生动物或舟形硅藻等附着物，后者在高密度培养中会迅速扩散。壳体附着物会阻碍幼虫游动和摄食，导致死亡，通常表明培养物中幼虫密度过高。

在通气的实验室培养条件下记录的幼虫生长速率和获得变态能力的时间，与先前使用该方法早期版本在相似幼虫密度、pH、温度、盐度和食物供给条件下进行的实验室实验所发表的结果相似^13,14,16。本文所述方法与上述研究中所用方法之间唯一的实质性差异在于，本实验中通过一根外径为2 mm的管道将通气气体从培养瓶底部引入，形成气泡流，而不是让气体通过培养瓶液面上方的顶空区域。这种由气泡流产生的水体循环和混合对幼虫生长及获得变态能力并无不利影响，并且可能有利于需要培养海水快速与变化的气体混合物达到平衡的实验，例如研究CO₂和溶解O₂分压昼夜循环效应的实验，这类情况常见于生产力较高的近岸海洋环境^20,21。

中宇宙实验结果得到的幼虫生长速率超过了以往任何实验室研究报道的数值，且变态能力获得时间最短^22,23。尽管本研究结果是在对幼虫生长和发育明显极为有利的野外条件下获得的，但该方法在探索自然环境中存在多种环境胁迫因子组合的野外位点的幼虫表现时应具有最高的信息价值，包括对管理和修复工作具有重要意义的濒危和退化生境²⁴。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙烯桶，7加仑	US Plastic	16916	用于中型生态系统（mesocosm）
Crepidula fornicata	海洋生物实验室，海洋资源中心	760	成体亲本种群
热熔胶，Infinity Supertac 500	Hotmelt.com	INFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB	适用于聚乙烯材料的粘接
玻璃罐，32盎司，带聚丙烯盖	Uline	S-19316P-W	用于800 mL通气培养
尼特克斯筛网，236 µm	Dynamic Aqua Supply Ltd.	NTX236-136	用于中型生态系统（mesocosm）
六角螺母，尼龙材质，10-32螺纹	Home Depot	1004554441	用于固定管接头
铆钉，尼龙材质，盲铆型，直径15/64"，夹持范围5/32"–5/16"，每包8个	NAPA auto parts	BK 6652844	每个中型生态系统需4包
管接头，1/8" × 10-32螺纹	US Plastic	65593	每个培养罐需2个
聚乙烯管，外径2.08 mm	Fisher Scientific	14-170-11G	用于培养罐内通气气流
特龙管（Tygon），1/8"×3/16"×1/32"	US Plastic	57810	适配管接头，用于培养通气