本文介绍了在小体积实验室规模系统以及可在野外部署的常温海水模拟生态系统中培养腹足类动物Crepidula fornicata幼虫的方法。
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本文内容
摘要
摘要
帽贝科腹足类软体动物Crepidula fornicata已被广泛用于幼虫发育生物学、生理学和生态学的研究。该物种的孵化期面盘幼虫通过成体自然释放后，用虹吸法收集到筛网上，以200/L的密度分配至培养体系中，并以等鞭金藻（T-ISO品系，Isochrysis galbana）为饵料，投喂浓度为1 × 105 个细胞/mL。通过在通风的800 mL培养体系中培育同胞幼虫，记录其壳体生长情况以及变态能力的获得过程，该培养体系设计用于与环境空气或特定大气气体混合物达到平衡。与上述实验室培养条件相对照，还在野外繁殖成体种群附近设置了一个15 L的流水式自然海水中型模拟生态系统（mesocosm），用于收集在该环境中培育幼虫的生长和变态能力数据。实验室培养条件下的幼虫生长速率和获得变态能力的时间与以往发表的研究结果相似；而在野外中型模拟生态系统中培育的幼虫生长显著更快，且比所有已报道的实验室研究中的幼虫更早达到变态阶段。综上，这些方法适用于在实验室预设的受控条件下以及在野外自然条件下开展幼虫发育的研究。
引言
由于可作为发育生物学研究的模式生物，以及作为入侵物种对生态环境造成广泛影响，笠螺 Crepidula fornicata（腹足纲：Calyptraeidae）在当前及历史研究文献中均有充分记载。在实验胚胎学的经典时代，它曾是研究螺旋卵裂发育模式的基础性范例1，并随着现代成像技术和基因组学工具的应用，重新成为研究担轮动物（lophotrochozoan）早期发育机制的重要对象2,3。在其生活史的另一阶段，其他研究则聚焦于这种生态系统工程师在远离其原生分布区——北美东部的温带沿海海洋环境中，成体种群所造成的生态影响4,5。介于胚胎与成体之间，该物种的面盘幼虫（veliger larvae）已成为幼虫发育与生态学研究的常见对象，尤其涉及影响幼虫生长及变态能力获得的因素、调控幼虫附着的内外部信号，以及幼虫期经历对稚贝阶段表现的影响等课题6,7,8,9,
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方案
1. 建立和维持C. fornicata幼体培养的常规操作
注意：本方法起始于一个装有海水的加仑（3.8 L）广口瓶，海水中含有刚释放出孵育的面盘幼虫的成体C. fornicata。成体可从野外采集，或从材料表中列出的供应商处获得。材料表中给出了相关供应商信息。这些成体为雄性先熟的雌雄同体，以交配堆叠的方式生活，堆叠底部为固着生活的孵育雌性个体。请勿打散成体的堆叠结构。繁殖的季节性特征以及非繁殖季节诱导成体产卵的预处理方法此前已有描述17。幼虫在释放后2–3小时内收集最佳，此时幼虫具有强烈的负趋地性，会聚集在广口瓶的水面附近。
- 通过剪掉一个400 mL一次性塑料三角烧杯的底部，并在其上粘贴一块236 µm的尼龙筛网，制作一个筛子。为此目的，尤其是用于中型生态系统（mesocosm）的构建（见下文），应使用专为聚乙烯材料具有良好粘附性的热熔胶。
- 停止成体培养罐中的通气，静置15–20分钟，使碎屑沉降，幼虫可轻松游至水面。
- 将幼虫通过一段短玻璃管（直径5 mm，长15–20 cm）虹吸，该玻璃管固定在一段60–80 cm长的软质塑料水族管末端，导入上述制备好的筛子中，筛子悬置于一个600 mL玻璃烧杯内，使过量海水从烧杯溢出，而幼虫被截留在筛网上。保持筛子底....
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结果
在4个同时进行的重复实验中，对800 mL通气培养体系中的幼虫生长及变态能力获得情况进行测定，每个培养体系含有160条幼虫，幼虫来源于同一卵块孵化的同胞批次，并进行投喂 Isochrysis galbana 密度为 1 x 105 细胞/mL。pH 为 7.9–8.0，温度为 20–21 °C，盐度为30–31 ppt。另取一批同源幼虫，在美国马萨诸塞州布兹德湾（Buzzards Bay, MA, USA）进行一次15 L中型生态系统实验，实验条件与实验室培养相似，pH、温度和盐度相同，但通过中型生态系统的网状面板流入周围海水，以天然浮游植物为饵料，共投放600条幼虫，用于测定其生长与变态情况。实测pH为7.8–8.3，温度为20–24 °C，盐度为26-28 ppt。生长情况通过壳长的变化来确定（图3）。幼虫在中型生态系统（mesocosm）中的生长速度更快（71 µm/day) 而实验室培养物中的含量则较低（54 µm/day孵化后的最初4-5天内（图4）。在 5t.......
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讨论
尽管与其它浮游营养型海洋幼虫相比，C. fornicata 的幼虫相对容易培养，但仍必须严格遵守良好的培养操作基本规范17,19。健康的幼虫应在孵化后立即开始摄食。可通过解剖显微镜下透射光观察幼虫肠道是否充满藻类细胞，于孵化后第二天轻松验证其摄食情况。健康幼虫的壳应保持清洁、光亮，无固着纤毛原生动物或舟形硅藻等附着物，后者在高密度培养中会迅速扩散。壳体附着物会阻碍幼虫游动和摄食，导致死亡，通常表明培养物中幼虫密度过高。
在通气的实验室培养条件下记录的幼虫生长速率和获得变态能力的时间，与先前使用该方法早期版本在相似幼虫密度、pH、温度、盐度和食物供给条件下进行的实验室实验所发表的结果相似13,14,16。本文所述方法与上述研究中所用方法之间唯一的实质性差异在于，本实.......
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披露
无任何利益冲突需要报告。
致谢
低体积通气培养系统的初步开发部分得到了美国国家科学基金会（CRI-OA-1416690，资助对象：狄金森学院）的支持。劳伦·穆利尼尔博士慷慨提供了伍兹霍尔海洋研究所的实验室设施，本系统所展示的数据（图4）即在此采集。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚乙烯桶，7加仑 | US Plastic | 16916 | 用于中型生态系统（mesocosm） |
| Crepidula fornicata | 海洋生物实验室，海洋资源中心 | 760 | 成体亲本种群 |
| 热熔胶，Infinity Supertac 500 | Hotmelt.com | INFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB | 适用于聚乙烯材料的粘接 |
| 玻璃罐，32盎司，带聚丙烯盖 | Uline | S-19316P-W | 用于800 mL通气培养 |
| 尼特克斯筛网，236 µm | Dynamic Aqua Supply Ltd. | NTX236-136 | 用于中型生态系统（mesocosm） |
| 六角螺母，尼龙材质，10-32螺纹 | Home Depot | 1004554441 | 用于固定管接头 |
| 铆钉，尼龙材质，盲铆型，直径15/64"，夹持范围5/32"–5/16"，每包8个 | NAPA auto parts | BK 6652844 | 每个中型生态系统需4包 |
| 管接头，1/8" × 10-32螺纹 | US Plastic | 65593 | 每个培养罐需2个 |
| 聚乙烯管，外径2.08 mm | Fisher Scientific | 14-170-11G | 用于培养罐内通气气流 |
| 特龙管（Tygon），1/8"×3/16"×1/32" | US Plastic | 57810 | 适配管接头，用于培养通气 |
参考文献
- Conklin, E. G. The embryology of Crepidula: a contribution to the cell lineage and early development of some marine gastropods. Gasteropods. , (1897).
- Henry, J. J., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula: an emerging lophotrochozoan mod....
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