监测小鼠子代经胞浆内精子注射后的血糖水平

摘要

本文介绍了一种建立卵胞浆内单精子注射（ICSI）-胚胎移植（ET）小鼠模型的方案，可用于观察与年龄相关的葡萄糖代谢变化，这些变化可能归因于ICSI技术，从而为该技术对人类发育潜在的长期影响提供见解。

摘要

人类寿命相对较长，而小鼠模型能够在相对较短的时间内模拟整个人类寿命，小鼠一年寿命大约相当于人类40年。胞浆内单精子注射（ICSI）是临床实践中常用的一种辅助生殖技术。然而，由于该技术大约30年前才出现，其对人类发育的长期影响尚不明确。在本研究中，我们利用小鼠模型建立了ICSI联合胚胎移植（ET）的方法。结果表明，正常小鼠精子在经历 体外 培养后进行ICSI操作，受精率达到89.57%，双细胞率为87.38%。经胚胎移植（ET）后，子代出生率约为42.50%。此外，随着小鼠年龄增长，观察到葡萄糖代谢水平出现波动，这可能与ICSI技术的应用有关。这些结果表明，小鼠ICSI-ET技术为评估精子异常对胚胎发育的影响及其对子代健康的长期效应（特别是葡萄糖代谢方面）提供了一个有价值的平台。本研究为深入探讨ICSI技术对人类发育潜在影响的研究提供了重要启示，强调了进一步研究该技术长期影响的必要性。

引言

生育问题已成为医学和社会学关注的主要焦点，尤其是在现代社会，生育率下降以及不孕症的流行程度和严重性日益加剧。辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology, ART）为应对这些挑战提供了多种可能，其中卵胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI）常被用作一种治疗干预手段。

自Palermo于1992年报道通过卵胞质内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI）实现首例成功妊娠以来，ICSI已成为辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technologies, ART）中的关键性技术¹。然而，考虑到ICSI在临床应用中仅有约30年历史，相较于人类寿命而言时间较短，因此ICSI的长期影响，尤其是对子代发育的影响，尚未得到充分研究和阐明。目前，小鼠因其遗传背景均一且寿命较短，已成为医学研究中广泛使用的替代模型。此外，小鼠模型可在较短时间内重现人类的整个生命周期，其中小鼠的1年大约相当于人类的40年²。

在过去十年中，多项小规模研究报道，通过卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术受孕的个体在日后生活中可能出现血糖水平异常等代谢综合征的风险增加

方案

下述ICSI-ET方案遵循上海计划生育科学研究所动物伦理审查委员会的指导原则，并已获得批准。安全操作规程：在处理化学品或生物材料时，务必穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用通风橱：所有涉及挥发性化学品或气溶胶产生的操作均须在经认证的通风橱或生物安全柜内进行。超数排卵实验使用6至8周龄的B6D2F1品系雌性小鼠。

1. 小鼠的卵胞浆内单精子注射（ICSI）

1. 小鼠超数排卵
   1. 在第一天约20:00，按每只小鼠7.5 IU的剂量，进行孕马血清促性腺激素（PMSG）腹腔注射。
   2. 在第三天约20:00（PMSG注射后48小时），按每只小鼠7.5 IU的剂量，进行人绒毛膜促性腺激素（HCG）腹腔注射。
2. 在雌鼠注射HCG的同一天，将HTF培养基分装为每份1 mL，敞口置于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜平衡。
3. ICSI受精液滴的制备
   1. 在雌鼠注射HCG的同一天，将一个50 × 9 mm细胞培养皿盖分为上下两部分。上半部分用10%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）制备4–6个、每个5 µL的液滴，用于放置精子；下半部分用M2培养基制备8–10个、每个5 µL的液滴，用于ICSI操作。
   2. 用约3 mL矿物油覆盖PVP和M2培养基液滴（

结果

在本实验室中，使用附睾尾部精子对小鼠进行卵胞浆内单精子注射（ICSI）后，受精率达到89.57%，2细胞期胚胎形成率为87.38%。经胚胎移植（ET）后，子代出生率约为42.50%。值得注意的是，所有受精率、2细胞期率及子代出生率均与人类辅助生殖技术（ART）所达到的水平相当，从而实现了在小鼠模型中对人类ART技术各个阶段的全面模拟。更多详细信息见表1和表2。在生长发育过程中，自然出生小鼠与ICSI小鼠之间的随机血糖水平未见显著波动（图2）。然而，雄性ICSI小鼠在整个实验期间空腹血糖水平持续升高（图3），提示其空腹血糖稳态受损。有趣的是，雌性ICSI小鼠与对照组相比未见明显变化。在葡萄糖耐量试验（GTT）中，雄性ICSI小鼠与对照组之间的血糖水平存在显著差异（图4），而雌性小鼠则未观察到此类差异。这些结果表明，通过ICSI技术获得的子代可能出现糖尿病表型，且该表型具有性别相关性。尽管雌性小鼠.......

讨论

本研究结合小鼠胞质内单精子注射（ICSI）和胚胎移植（ET）技术，全面模拟人类辅助生殖技术（ART），并考察ICSI联合ET对子代发育的影响。使用正常小鼠精子进行ICSI操作，获得了较高的受精率（86.76%）和2细胞胚胎率（88.48%）。经胚胎移植后，子代小鼠的出生率约为42.50%，表明该技术平台具有良好的稳定性。本研究最值得关注的发现是ICSI子代葡萄糖代谢水平呈现与年龄相关的波动，这可能与ICSI技术的应用有关⁶。

观察到的葡萄糖代谢水平波动是本研究中的一个显著发现。该发现暗示了ICSI技术对子代健康可能存在的长期影响，特别是在葡萄糖代谢方面。⁷为阐明这一现象背后的原因，我们对ICSI操作中包含的关键技术步骤进行了全面考察。我们发现，控制微注射温度（19 °C）、超声切割持续时间（不超过5 s）以及转移液体体积（<0.5 cm）对于维持较高的胚胎存活率和着床率至关重要。控制移植移液管的虹吸效应已成为实现精确胚胎移植的关键步骤。在准备移植移液管时，确保管径均匀是减轻虹吸效.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.25% 戊巴比妥钠（2,2,2-三溴乙醇）	Nanjing Aibei	M2960	用于麻醉
细菌培养皿，35 × 10 mm，带紧密盖，晶体级 virgin 聚苯乙烯，无菌	BD	353001
细菌培养皿，50 × 9 mm，带紧密盖，晶体级 virgin 聚苯乙烯，无菌	BD	351006
生物安全柜	ESCO	class BSC	无菌操作、制备培养皿、试剂分装等
CO2 培养箱	Thermo	8000DH	胚胎培养
解剖显微镜	Olympus	SZX16	用于小鼠胚胎移植
氟化液 Fluorinert Fc-770	SIGMA	F3556	Fluorinert FC-770 是一种热稳定性良好的全氟化液体，具有高介电强度和电阻率，用作操作液
手持式血糖仪	Roche	AccuChek performa	血糖测量
HTF	Merck	MR-070-D	EmbryoMax 人输卵管液（HTF）（1x），液体，专为小鼠体外受精设计，以 50 mL 规格提供，已优化并验证适用于胚胎培养
液压显微注射仪	Eppendorf	CellTram 4r Oil, 5196000030	用于精子注射
倒置显微镜	Nikon	TI2-U	显微操作观察平台
KSOM	Merck	MR-020P-D	（1x），粉末，不含酚红，5 × 10 mL
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 培养基（1x），液体，含酚红
显微操作仪	NARISHIGE	NTX-N4	显微操作臂
矿物油	SIGMA	M8410	矿物油适用于作为覆盖层，以控制各种分子生物学应用中的蒸发和交叉污染
玻璃针切割器	Nanjing Aibei	Sutter MF-800	用于制备显微操作针
玻璃针拉制仪	Nanjing Aibei	Sutter model p-100	用于制作显微操作针
Piezo Drill Trip 小鼠 ICSI 装置	Eppendorf	5195000.087	用于 ICSI 注射针的操作
压电式显微操作仪（膜破裂装置）	Eppendorf	Eppendorf PiezoXpert	利用微脉冲击破卵母细胞的透明带和卵质膜
气动显微注射仪	Eppendorf	CellTram 4r Air, 5196000013	用于固定卵母细胞
即用型人绒毛膜促性腺激素（Hcg）	Nanjing Aibei	M2520	灭菌试剂，腹腔注射，50 IU/mL
即用型孕马血清促性腺激素（PMSG）	Nanjing Aibei	M2620	灭菌试剂，腹腔注射，50 IU/mL
体视显微镜	Olympus	SZX7	卵母细胞采集及胚胎发育观察