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方法文章

监测小鼠子代经胞浆内精子注射后的血糖水平

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DOI：

10.3791/66212

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2024年5月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

本文内容

摘要

本文介绍了一种建立卵胞浆内单精子注射（ICSI）-胚胎移植（ET）小鼠模型的方案，可用于观察与年龄相关的葡萄糖代谢变化，这些变化可能归因于ICSI技术，从而为该技术对人类发育潜在的长期影响提供见解。

摘要

人类寿命相对较长，而小鼠模型能够在相对较短的时间内模拟整个人类寿命，小鼠一年寿命大约相当于人类40年。胞浆内单精子注射（ICSI）是临床实践中常用的一种辅助生殖技术。然而，由于该技术大约30年前才出现，其对人类发育的长期影响尚不明确。在本研究中，我们利用小鼠模型建立了ICSI联合胚胎移植（ET）的方法。结果表明，正常小鼠精子在经历 体外 培养后进行ICSI操作，受精率达到89.57%，双细胞率为87.38%。经胚胎移植（ET）后，子代出生率约为42.50%。此外，随着小鼠年龄增长，观察到葡萄糖代谢水平出现波动，这可能与ICSI技术的应用有关。这些结果表明，小鼠ICSI-ET技术为评估精子异常对胚胎发育的影响及其对子代健康的长期效应（特别是葡萄糖代谢方面）提供了一个有价值的平台。本研究为深入探讨ICSI技术对人类发育潜在影响的研究提供了重要启示，强调了进一步研究该技术长期影响的必要性。

引言

生育问题已成为医学和社会学关注的主要焦点，尤其是在现代社会，生育率下降以及不孕症的流行程度和严重性日益加剧。辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology, ART）为应对这些挑战提供了多种可能，其中卵胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI）常被用作一种治疗干预手段。

自Palermo于1992年报道通过卵胞质内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI）实现首例成功妊娠以来，ICSI已成为辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technologies, ART）中的关键性技术1。然而，考虑到ICSI在临床应用中仅有约30年历史，相较于人类寿命而言时间较短，因此ICSI的长期影响，尤其是对子代发育的影响，尚未得到充分研究和阐明。目前，小鼠因其遗传背景均一且寿命较短，已成为医学研究中广泛使用的替代模型。此外，小鼠模型可在较短时间内重现人类的整个生命周期，其中小鼠的1年大约相当于人类的40年2。

在过去十年中，多项小规模研究报道，通过卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术受孕的个体在日后生活中可能出现血糖水平异常等代谢综合征的风险增加3,4。尽管现有证据尚不充分，但这一发现已在科学界引发了对ICSI技术长期健康影响的严重关切。这种情况凸显了对辅助生殖技术（ART）及其长期健康后果进行更严格评估的迫切需求。特别是在人类研究存在局限性和伦理考量的背景下，建立能够精确模拟ICSI后人类子代发育过程的动物模型变得愈发重要。在此背景下，小鼠ICSI-ET（卵胞浆内单精子注射-胚胎移植）模型因其能够模拟人类ICSI过程，并便于对子代健康结局进行长期监测，已成为评估ICSI技术对子代潜在健康风险的有效工具5。

本研究旨在通过随机血糖监测、空腹血糖检测和葡萄糖耐量试验评估小鼠的葡萄糖代谢状态，探讨ICSI-ET技术对一种常见代谢表型——子代葡萄糖代谢健康的影响。随机血糖监测用于捕捉正常生理活动过程中葡萄糖代谢的自然波动，而空腹血糖和葡萄糖耐量试验则用于评估潜在的糖尿病前期状态。

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方案

下述ICSI-ET方案遵循上海计划生育科学研究所动物伦理审查委员会的指导原则，并已获得批准。安全操作规程：在处理化学品或生物材料时，务必穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用通风橱：所有涉及挥发性化学品或气溶胶产生的操作均须在经认证的通风橱或生物安全柜内进行。超数排卵实验使用6至8周龄的B6D2F1品系雌性小鼠。

1. 小鼠的卵胞浆内单精子注射（ICSI）

  1. 小鼠超数排卵
    1. 在第一天约20:00，按每只小鼠7.5 IU的剂量，进行孕马血清促性腺激素（PMSG）腹腔注射。
    2. 在第三天约20:00（PMSG注射后48小时），按每只小鼠7.5 IU的剂量，进行人绒毛膜促性腺激素（HCG）腹腔注射。
  2. 在雌鼠注射HCG的同一天，将HTF培养基分装为每份1 mL，敞口置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜平衡。
  3. ICSI受精液滴的制备
    1. 在雌鼠注射HCG的同一天，将一个50 × 9 mm细胞培养皿盖分为上下两部分。上半部分用10%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）制备4–6个、每个5 µL的液滴，用于放置精子；下半部分用M2培养基制备8–10个、每个5 µL的液滴，用于ICSI操作。
    2. 用约3 mL矿物油覆盖PVP和M2培养基液滴（图1）。
  4. 培养皿的制备
    1. 在雌鼠注射HCG的同一天，将KSOM培养基（MR-020P-D）均匀分装12滴，每滴20 µL，置于35 × 10 mm细胞培养皿中，并用约3 mL矿物油覆盖液滴。
  5. 精子采集：
    1. 在第四天约上午9:00（HCG注射后13小时），通过颈椎脱臼法处死雄性小鼠。
    2. 分离附睾尾部，并用无菌纱布轻轻擦拭，去除脂肪组织和血液残留，再用预热的HTF培养基冲洗干净。
    3. 剪开附睾尾部，使精子自由游出至HTF培养基中。用镊子轻轻挤压附睾尾部以释放精子，收集至预先平衡的HTF试管中，敞口置于37 °C、5% CO2培养箱中进行精子获能，以备后续使用。
  6. 卵母细胞采集
    1. 在第四天约上午9:30，对用于卵母细胞采集的雌鼠实施颈椎脱臼法处死。沿腹部皮肤和肌肉层中线小心切开，暴露腹腔。
    2. 用精细镊子轻轻分离两侧输卵管组织，特别是膨大的壶腹部，将其转移至无菌培养皿中的M2培养基内。重复此操作，直至收集完所有指定小鼠的输卵管。
    3. 在解剖显微镜下，使用1 mL注射器针头轻轻穿刺输卵管膨大壶腹部的透明区域，促使卵丘-卵母细胞复合体（COCs）释放至培养基中。
    4. 使用同一注射器小心吸取并转移COCs至含有100 µL新鲜M2培养基的新培养皿中。重复此步骤，直至所有COCs均从原始输卵管段中成功转移。
    5. 擦除血液和组织液，在解剖显微镜下使用25 G针头撕开输卵管壶腹部，使大量COCs释放出来。
    6. 移除输卵管及组织碎片，将COCs转移至含透明质酸酶（HY）的M2培养基液滴中，并预热至37 °C。
    7. 孵育约5分钟后，进行轻柔吹打，以促进卵丘细胞与卵母细胞的分离。将处于第二次减数分裂中期（MII）的卵母细胞从含HY的溶液转移至新鲜M2培养基中，随后依次转移至多个M2培养基液滴中。
    8. 经过2–3轮洗涤后，将卵母细胞转移至KSOM培养基液滴中，并置于37 °C、5% CO2培养箱中备用。
  7. 在第四天约上午10:00，对100 µL已获能的精子（见步骤1.5.2）进行超声处理5秒，频率为46 kHz，功率设为50瓦，以分离精子头与尾部。
    注意：超声处理以截断精子尾部时，需严格控制时间，不得超过5秒。超声数秒后可在倒置显微镜下观察精子状态，当约一半精子出现尾部截断时即停止超声。
  8. ICSI操作
    1. 使用市售的平头显微操作针，内径为6 µm，安装角度为25°，用于注射。将操作液注入针内，使液柱在针内长度达0.5 cm，确保液面高度约为0.5 cm。
      注意：注射过程中应保持室温在19 °C，避免高温降低受精卵的存活率。精确控制液面高度至0.5 cm，对维持注射过程的完整性及卵母细胞的存活至关重要。
    2. 将注射针安装在显微操作仪的右臂上，并通过拧紧固定帽牢固固定。在显微操作仪左臂安装市售的平头显微操作固定吸管（专用于小鼠卵母细胞），并将注射针与固定吸管置于显微镜视野中。
    3. 用移液器将1 µL超声处理后的精子加入PVP溶液液滴中。
    4. 将20个MII期卵母细胞置于M2培养基液滴中。
    5. 用注射针在PVP溶液中吸取10–20个精子头，然后将注射针移入含有卵母细胞的液滴中。
    6. 在偏振显微镜下直接确定卵母细胞内中期纺锤体的位置，确保纺锤体不在注射侧，极体通常位于卵母细胞方向的12点或6点位置。
    7. 使卵母细胞与培养皿底部接触。调节焦平面，使卵母细胞的透明带与注射针处于同一平面。
    8. 当注射针接触透明带时，对注射针施加轻微负压，吸入部分透明带。
    9. 同时启动压电脉冲，强度设为5，频率为1，有效在透明带上打孔，使注射针得以穿过。
    10. 将注射针推进至卵周隙，将精子头推至针尖端，继续插入卵母细胞，直至抵达透明带对侧。
    11. 使用压电脉冲（强度设为1，频率为1）在质膜上制造微小孔洞，确保将精子头注入卵细胞质中，同时尽量减少PVP进入，并最大程度保持卵母细胞的完整性。
    12. 重复步骤1.8.11，直至完成全部20个卵母细胞的注射，随后在19 °C孵育15分钟。
    13. 将存活的卵母细胞转移至KSOM培养基中并放入培养箱。观察2细胞期、4细胞期、桑葚胚及囊胚的形成率。
      注意：胞浆内单精子注射（ICSI）的时间应严格控制，目标是在HCG注射后14–18小时内完成操作。

2. 小鼠囊胚的子宫移植

  1. 结扎雄性小鼠的制备
    注意：本研究使用6-8周龄的ICR雄性小鼠。
    1. 通过腹腔注射1.25% 2,2,2-三溴乙醇进行麻醉，剂量为每10克体重0.2 mL。无痛反应表明麻醉成功。
      注意：尽管当前方案未包括对麻醉动物眼部使用兽用眼膏，但建议作为最佳实践以防止眼睛干燥，并确保动物在操作过程中的健康与舒适。在整个手术及恢复过程中，所有手术器械在使用前均已灭菌，手术区域使用消毒液处理，以确保无菌的操作环境。
    2. 为防止潜在的应激或损伤，术后初期应将小鼠单独饲养。
    3. 给予布托啡诺，剂量为每千克体重0.05 mg，以确保充分镇痛。
      注意：为保障小鼠福利，需在恢复期间密切监测小鼠状态，在其恢复至能够维持胸卧位意识水平前不得无人看护。
    4. 准备位于睾丸上方的下腹部手术区域。去除毛发并用聚维酮碘消毒。使用无菌剪刀沿腹白线做1 cm纵向切口。用无菌无尘纸轻轻清除血液，沿腹白线钝性分离腹肌，进入腹腔。
    5. 使用弯头镊子轻柔夹取并暴露左侧睾丸及其附带脂肪垫。识别输精管，并用尖头镊子小心分离，形成一段约10 mm的可操作段。
    6. 将弯头镊子置于酒精灯外焰中数秒以灭菌。轻柔夹住输精管，使其因灼烧而变扁平且发白。在第一灼烧点远端3-5 mm处创建第二个灼烧点。使用无菌手术剪刀切除两个灼烧点之间的输精管段。
    7. 仔细检查输精管灼烧后的断端，确保残留一段短小、扁平且发白的组织。用弯头镊子将睾丸及其附带脂肪垫轻柔复位至腹腔内。
    8. 在对侧（右侧）重复步骤2.1.6所述操作。
    9. 使用缝线关闭手术切口，通常在肌肉层缝合一针，皮肤缝合三针。确保手术切口对齐，并用聚维酮碘消毒。将动物转移至加热垫上观察，监测10-15分钟直至其恢复意识。恢复后，将动物放回饲养笼中。
      注意：输精管结扎术后，小鼠需14天恢复期，随后进行为期1周的试交配实验。
    10. 在此期间，持续将结扎雄鼠与雌鼠交配，并观察所有出现交配栓雌鼠的妊娠状态。成功交配的标志是雌性小鼠阴道口出现淡黄色、块状的阴道栓。
      1. 于第一天下午4:00至6:00将小鼠配对，第二天上午7:00至9:00检查阴道栓。将有阴道栓的雌鼠视为0.5天假孕状态，并用于后续胚胎移植实验。无阴道栓的雌鼠返回受体组。
        注意：这些无阴道栓的雌鼠可继续用于交配以制备假孕雌鼠。必须确保所有带栓雌鼠均未真正怀孕，方可将结扎雄鼠用于正式实验。
      2. 虽然结扎雄鼠可每日交配，但每次交配之间应给予1天休息时间。
        注意：根据我们的经验，结扎雄鼠可在一年以上维持较高的阴道栓形成率。然而，若结扎雄鼠连续4-6次交配均未能在雌鼠中产生阴道栓，则应将其淘汰出实验。
  2. 假孕雌鼠的制备
    1. 将7-10周龄、体重超过25 g的ICR雌性小鼠与3-6月龄的结扎雄性小鼠以1:1比例交配，以获得假孕雌性小鼠。
      注意：使用结扎雄鼠刺激雌鼠子宫颈，从而激活黄体。
  3. 囊胚移植用移液管的准备
    1. 从培养箱中取出待移植的胚胎，转移至37 °C的M2培养基液滴中。
    2. 使用移植移液管吸取少量液体，吸入一小段空气，再吸入6-10个胚胎。最后再吸入一小段空气以封闭移液管。
      注意：移液管中液体长度不应超过0.5 cm。
  4. 子宫内移植（囊胚）
    1. 称量假孕雌鼠（交配后2.5天），通过腹腔注射1.25% 2,2,2-三溴乙醇进行麻醉，剂量为每10克体重0.2 mL。用镊子轻压耳部确认麻醉深度。
    2. 对小鼠麻醉并以酒精消毒确保无菌后，在腹中线做纵向切口。利用皮下组织较松的特点，根据移植需要将切口偏向左侧或右侧。使用小剪刀在腰椎旁约0.5 cm处钝性分离腹壁肌层，进入腹膜腔。
    3. 使用无创伤镊子小心将卵巢、输卵管和子宫拉出体外。
    4. 用注射针针尖在子宫输卵管连接处下方的子宫壁上做一个微小的、向上倾斜的切口，避开血管。此切口通向子宫腔；将输卵管轻轻插入小孔内2-3 mm。
    5. 在缓慢注射胚胎的同时，仔细观察移液管，小心排出移液管末端的小气泡。当确认培养基中央部分已被推出后，停止操作并轻柔拔出移液管。
    6. 将卵巢、输卵管和子宫复位至腹腔内。分别缝合肌层和皮肤。将小鼠置于加热垫上直至从麻醉中恢复。为保障小鼠福利，需在恢复期间密切监测，在其恢复至能够维持胸卧位意识水平前不得无人看护。
  5. 妊娠观察
    1. 手术后观察小鼠18-21天，记录出生仔鼠数量。如遇难产（分娩困难），应实施剖宫产。新生小鼠可由同龄哺乳母鼠代养。

3. 随机血糖、空腹血糖和葡萄糖耐量试验

  1. 在小鼠生长期间监测随机血糖水平
    1. 从小鼠出生开始，每隔4周在上午9点（经过充分的夜间进食和活动后）监测一次随机血糖水平。
      1. 刺破小鼠尾尖以获取尾静脉血。
      2. 由于组织液混入，第一滴血的血糖测量值较高，因此应用干净的吸水纸轻轻擦去第一滴血。
      3. 使用便携式血糖仪测量尾静脉第二滴血（约4 µL）的血糖值。
  2. 在小鼠发育过程中监测空腹血糖及葡萄糖耐量的变化
    注意：考虑到首次采血时间点为15分钟，所有小鼠必须在15分钟内完成注射。由于每只小鼠注射耗时20-30秒，为确保在规定时间内完成注射，每次实验使用的小鼠数量不得超过30只。
    1. 在出生后每隔4周对经过过夜禁食的小鼠进行空腹血糖和葡萄糖耐量检测。
      1. 第一天，准备新鲜辐照过的垫料、清洁的笼子、笼盖和水瓶。将小鼠转移至无食物的新笼中，并在笼子上贴上“禁止喂食”标签。
      2. 准备好足量的10%葡萄糖注射液（无菌且无热原）和1 mL注射器。
      3. 确保每组小鼠禁食16小时（从第1天下午5:00至第2天上午9:00），但可自由饮水。使用血糖仪按照步骤3.1.1.1–3.1.1.3所述方法测量空腹血糖水平。
    2. 称量小鼠体重并标记其尾部以便快速识别。根据小鼠体重准备每克注射10 µL葡萄糖的注射器。
    3. 以30秒间隔向小鼠腹腔内注射每克体重10 µL的葡萄糖。
      注意：此处需特别注意注射技术，以避免注射液体体积不准确。操作要点如下：
      1. 用一只手固定小鼠并控制其尾部，使其头部略低于臀部，从而使腹腔内器官移向头部，留出足够的注射空间。
      2. 将针头置于中线与髋骨之间，以45度角刺穿皮肤，然后在保持针头与皮肤表面平行的情况下，轻柔地将针头进一步推进腹腔约0.5 cm。
        注意：注射过程中应注意是否有阻力，以判断是否意外刺穿内脏器官。
      3. 将注射器中的液体注入腹腔。
      4. 记录注射开始时间，并使用计时器控制注射速度。对于三只小鼠，将计时器设定为90秒，以避免在操作计时器时浪费时间。
    4. 在预定时间点（葡萄糖给药前0分钟，以及葡萄糖负荷后15、30、60、90和120分钟）从小鼠尾静脉采集血液测量血糖值。
      注意：后续每次血糖检测也应控制在每只小鼠20-30秒内完成。
    5. 实验结束后将小鼠放回配有食物和水的原笼中。

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结果

在本实验室中，使用附睾尾部精子对小鼠进行卵胞浆内单精子注射（ICSI）后，受精率达到89.57%，2细胞期胚胎形成率为87.38%。经胚胎移植（ET）后，子代出生率约为42.50%。值得注意的是，所有受精率、2细胞期率及子代出生率均与人类辅助生殖技术（ART）所达到的水平相当，从而实现了在小鼠模型中对人类ART技术各个阶段的全面模拟。更多详细信息见表1和表2。在生长发育过程中，自然出生小鼠与ICSI小鼠之间的随机血糖水平未见显著波动（图2）。然而，雄性ICSI小鼠在整个实验期间空腹血糖水平持续升高（图3），提示其空腹血糖稳态受损。有趣的是，雌性ICSI小鼠与对照组相比未见明显变化。在葡萄糖耐量试验（GTT）中，雄性ICSI小鼠与对照组之间的血糖水平存在显著差异（图4），而雌性小鼠则未观察到此类差异。这些结果表明，通过ICSI技术获得的子代可能出现糖尿病表型，且该表型具有性别相关性。尽管雌性小鼠...

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讨论

本研究结合小鼠胞质内单精子注射（ICSI）和胚胎移植（ET）技术，全面模拟人类辅助生殖技术（ART），并考察ICSI联合ET对子代发育的影响。使用正常小鼠精子进行ICSI操作，获得了较高的受精率（86.76%）和2细胞胚胎率（88.48%）。经胚胎移植后，子代小鼠的出生率约为42.50%，表明该技术平台具有良好的稳定性。本研究最值得关注的发现是ICSI子代葡萄糖代谢水平呈现与年龄相关的波动，这可能与ICSI技术的应用有关6。

观察到的葡萄糖代谢水平波动是本研究中的一个显著发现。该发现暗示了ICSI技术对子代健康可能存在的长期影响，特别是在葡萄糖代谢方面。7为阐明这一现象背后的原因，我们对ICSI操作中包含的关键技术步骤进行了全面考察。我们发现，控制微注射温度（19 °C）、超声切割持续时间（不超过5 s）以及转移液体体积（<0.5 cm）对于维持较高的胚胎存活率和着床率至关重要。控制移植移液管的虹吸效应已成为实现精确胚胎移植的关键步骤。在准备移植移液管时，确保管径均匀是减轻虹吸效...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由上海张江国家自主创新示范区专项发展资金重大项目计划（ZJ2022-ZD-006）、上海市科学技术委员会定向资助项目（22DX1900400）、上海市卫生健康委员会青年项目（20204Y0276）以及国家自然科学基金（32070849）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.25% 戊巴比妥钠（2,2,2-三溴乙醇）Nanjing AibeiM2960用于麻醉
细菌培养皿，35 × 10 mm，带紧密盖，晶体级 virgin 聚苯乙烯，无菌BD353001
细菌培养皿，50 × 9 mm，带紧密盖，晶体级 virgin 聚苯乙烯，无菌BD351006
生物安全柜ESCOclass figure-materials-1 BSC无菌操作、制备培养皿、试剂分装等
CO2 培养箱Thermo8000DH胚胎培养
解剖显微镜OlympusSZX16用于小鼠胚胎移植
氟化液 Fluorinert Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770 是一种热稳定性良好的全氟化液体，具有高介电强度和电阻率，用作操作液
手持式血糖仪RocheAccuChek performa血糖测量
HTFMerckMR-070-DEmbryoMax 人输卵管液（HTF）（1x），液体，专为小鼠体外受精设计，以 50 mL 规格提供，已优化并验证适用于胚胎培养
液压显微注射仪EppendorfCellTram 4r Oil, 5196000030用于精子注射
倒置显微镜NikonTI2-U显微操作观察平台
KSOMMerckMR-020P-D（1x），粉末，不含酚红，5 × 10 mL
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 培养基（1x），液体，含酚红
显微操作仪NARISHIGENTX-N4显微操作臂
矿物油 SIGMAM8410矿物油适用于作为覆盖层，以控制各种分子生物学应用中的蒸发和交叉污染
玻璃针切割器Nanjing AibeiSutter MF-800用于制备显微操作针
玻璃针拉制仪Nanjing AibeiSutter model p-100用于制作显微操作针
Piezo Drill Trip 小鼠 ICSI 装置Eppendorf5195000.087用于 ICSI 注射针的操作
压电式显微操作仪（膜破裂装置）EppendorfEppendorf PiezoXpert利用微脉冲击破卵母细胞的透明带和卵质膜
气动显微注射仪EppendorfCellTram 4r Air, 5196000013用于固定卵母细胞
即用型人绒毛膜促性腺激素（Hcg）Nanjing AibeiM2520灭菌试剂，腹腔注射，50 IU/mL
即用型孕马血清促性腺激素（PMSG）Nanjing AibeiM2620灭菌试剂，腹腔注射，50 IU/mL
体视显微镜OlympusSZX7卵母细胞采集及胚胎发育观察

参考文献

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