本方案提供了利用套管技术在小鼠原位肝移植中进行血管重建的技术信息。
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摘要
摘要
小鼠原位肝移植是研究肝脏缺血再灌注损伤机制的有效方法。然而，该技术操作难度较高，限制了这一重要实验模型的应用及其技术向新一代研究人员的传承。该手术最具挑战性的环节是血管重建，包括门静脉（PV）、肝下下腔静脉（IHIVC）和肝上下腔静脉。采用塑料套管代替缝线，可使PV和IHIVC的重建过程更为顺畅。血管重建通过将由静脉留置针制成的套管连接至移植物血管断端，并将套管插入受体血管内完成。其中最关键的两个要点是：充分显露血管内腔以及避免施加过大外力。本研究旨在提供受体手术中使用套管技术进行血管重建的技术概述。这些关于套管技术的操作要点有望帮助显微外科医生更顺利地完成血管重建，推动相关研究的进展。
引言
小鼠原位肝移植（MOLT）是一种有效的实验方法，最早于1991年报道1。该实验模型利用基因修饰小鼠和多种研究试剂，在研究肝脏缺血再灌注损伤（包括热缺血和冷缺血）方面发挥了关键作用。然而，由于该模型技术复杂度高，限制了肝移植基础医学的发展2。MOLT主要包括三个步骤：（1）从供体小鼠中获取肝脏，（2）修肝手术，（3）将肝脏植入受体小鼠体内。在这些受体操作中，血管吻合是最具挑战性的环节。通常，肝上段下腔静脉吻合采用手工缝合完成2，而肝下段下腔静脉（IHIVC）和门静脉（PV）则可使用塑料套管替代手工缝合，从而更高效地完成重建。
无肝期是指受体自身肝脏被切除至移植肝植入之间的间隔时间。为确保实验结果的一致性，必须将无肝期控制在20分钟以内。因此，采用此模型的研究仅限于少数特定机构3,4,5,6,7,8,9。在小动物异位肝移植（MOLT）的各个步骤中，顺利实现门静脉（PV）和下腔静脉（IHIVC）的重建对于缩短无肝期并保证移植成功至关重要。
门静脉（PV）和下腔静脉（IVC）重建通常采用血管套管技术，因为与手工缝合相比，套管技术可简化血管吻合过程2,5,8。血管套管的制备及其牢固固定的技术对受体血管重建的复杂程度具有重要影响。我们的目标是提供与套管技术相关的多种操作要点的详细可视化指导，从而降低学习曲线。这些视频片段将清晰展示如何在受体手术中将套管连接至血管，并完成门静脉和下腔静脉（IHIVC）的重建。
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方案
实验方案经京都大学动物实验委员会批准。研究使用了来自商业来源的C57BL/6小鼠（参见材料表），年龄超过10周，体重在25 g至30 g之间。所有动物均采用2.5%异氟烷进行麻醉（遵循机构批准的方案），饲养于特定病原体-free环境中，所有实验操作均符合京都大学《动物实验条例》。本研究使用的关键仪器列于材料表中，并在图1和图2中展示。
1. 动物选择
- 使用体重为25-30 g的小鼠。
注意：尽管小鼠肝脏同种异体移植2通常可跨越主要组织相容性复合体屏障被接受，但本研究选择使用同基因型MOLT模型，以专注于冷缺血再灌注损伤机制的详细研究10。不建议使用体重低于25 g的小鼠，因为无法将内支架插入较细的胆管。同样，也不建议使用体重超过30 g的小鼠，因其血管周围存在大量腹腔脂肪。
2. 套管制作
- 准备用于门静脉（PV）和经肝内静脉肝内静脉通路（IHIVC）的20 G和16 G静脉导管。
- 使用手术刀切割导管以制作套管。套管主体长度应为2 mm，并带有一个1 mm长的延伸手柄（图3A）。
注意：如果手柄过大，可能难以插入套管。 - 在套管表面，使用手术刀背侧切出浅槽，用于固定缝线。
注意：使用手术刀背侧加工套管时，应确保刀尖与套管表面呈约60度角（如 图3B 所示）。完成第一条槽后，固定刀片并旋转套管。理想情况下建议制作两条槽，但单条槽亦可满足要求且不影响使用。
3. 套管固定
- 在塑料制的长方形容器中放入小块冰块，并将一个小金属杯（直径6 cm）置于其上。向杯内加入器官保存液（参见材料表），并将同基因型移植物放入其中。
- 使用棉签轻轻滚动同基因型肝脏移植物（来自另一只供体小鼠），确保肝门面向上方。用器官保存液彻底清除下腔静脉（IVC）管腔内储存的血液。
- 将门静脉（PV）通过套管，利用连接的缝线（例如，连接至脾静脉）进行穿引（参见图4A）。
- 将套管手柄置于12点钟位置，使用血管夹（bulldog clamp）固定手柄和套管（参见材料表），位置应距离门静脉边缘2至3 mm。
- 使用大型血管钳和固定模具进一步固定血管夹，以建立手术操作区域（参见图4B）。
- 在约15至20倍放大下仔细检查门静脉管腔。如有必要，滴加水可增强管腔的可见度。
- 轻柔地夹住门静脉管腔，并通过套管将其外翻。
- 完全外翻后，使用8-0丝线在套管凹槽处进行双重结扎固定（图4C、D）。
注意：确保结扎线不松动。同时注意结扎点不宜过大，以免影响套管插入。结扎点可位于任意方向。 - 采用与门静脉类似的操作方法，将套管连接至肝下下腔静脉（IHIVC）（图4E）。
注意：使用套管夹持IHIVC时，避免夹入肝实质组织。由于IHIVC颈部较门静脉更短，需谨慎确定夹持位置。 - 将缝线绕过IHIVC基底部打一个活结，暂时结扎IHIVC（图5）。该缝线将在再灌注后移除。
4. 门静脉重建
- 通过诱导使受体小鼠麻醉 使用2.5%异氟烷进行麻醉，并在取出天然肝脏前将其浓度降至0.6%，具体操作参见已发表文献2用碘伏和70%乙醇交替对术区消毒至少三次，然后进行剖腹手术。
- 确保肝叶位置正确，套管门静脉无扭曲和扭转。
- 使用佩恩钳轻轻夹住受体的门静脉边缘，并用夹具固定。
注意：本文中，“vise”指用于将佩恩止血钳固定在桌面上的机械装置。有关vise的更多信息，请参见 材料表. - 在受体的门静脉（PV）上应用血管夹，并在其周围穿过一根8-0丝线。
- 在距离肺静脉（PV）边缘约0.5 mm处制作一个1/4周长的切口图6A使用一种特制器械（将27 G针头剪去针尖并弯成L形），在通过管腔注入生理盐水的同时扩大孔径。
- 使用直镊夹住套管手柄，并将其插入管腔内。
- 完全插入后，用8-0丝线固定套管。单次结扎即可牢固固定。
- 移除血管夹并重新灌注肝脏。
- 小心松开佩恩钳，完成门静脉重建。整个门静脉重建过程应耗时约5分钟。
5. 肝下腔静脉重建
- 将肝叶适当放置，并将连接受体下腔静脉背侧的血管钳移至移植物右下叶后方，用夹具固定。
- 用棉签轻轻擦拭，清除受体下腔静脉周围残留的肝组织。
- 将一根8-0丝线绕过受体下腔静脉。
- 在距受体下腔静脉边缘约0.5 mm处，做一圈约1/4周长的切口（图6B）。
- 向管腔内注入生理盐水后，将套管插入管腔内。
注意：由于颈段较短，套管插入深度通常比门静脉更浅。 - 用8-0丝线小心固定套管，然后移除血管夹和血管钳。
6. 术后护理
- 使用加热垫和保温灯以促进术后恢复。
- 持续监测血压、心率、呼吸频率、体温以及食物和水的消耗情况。
- 皮下注射卡洛芬（5 mg/kg，每6小时一次 或按需给药）以缓解术后疼痛。 遵循当地 机构的指导原则。
注意：若小鼠状况恶化，将立即终止实验，并通过吸入二氧化碳实施安乐死。 - 为采集组织样本，重新麻醉小鼠，并采用经IACUC批准的方法实施安乐死。
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结果
当门静脉去夹闭后无扭曲且肝脏灌注均匀时，门静脉重建即为成功。无肝期应少于20分钟，因为无肝期超过25分钟会增加小鼠死亡风险。若移植物无血液反流，则下腔静脉重建视为成功。
使用器官保存液在低温条件下保存移植物1小时后，再灌注6小时时血清丙氨酸氨基转移酶水平约为2,000 U/L（图7A）。移植后7天的存活率为100%（图7B）。然而，在我们未进行肝动脉吻合的模型中，受体小鼠可能在移植后约30天因肝内胆汁瘤相关问题而死亡
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讨论
学习血管重建是成功实施MOLT最具挑战性的环节。由于小鼠血管尺寸较小，套管的质量会显著影响重建的难度5。本文提供了一套关于套管制备、安装及重建的详细操作方案。
尽管在套管制备和连接方面与以往的报道相比没有显著差异2,5，但仍需注意一些细微之处。首先，套管手柄的厚度应控制在套管总周长的约1/6左右。若手柄过薄，则容易弯曲且难以抓握；若过厚，则在受体动物腹腔内操作时可能不便。早期明确个人操作偏好至关重要。
其次，背桌操作时对管腔的可视性至关重要。使用一根10-0尼龙线，将其连接至供体脾静脉作为标志，以确认门静脉（PV）管腔的位置。尼龙线应置于8点钟位置，以防止过度扭转。用两把镊子分别夹住血管壁的3点钟和9点钟位置，并将其压向套管壁的6点钟位置，从而将血管壁外翻。使用8-0丝线进行固定时需动作轻柔。通过将血管壁牢固地固定于套管凹槽内，即可实现充分固定。完成连接后，提起套...
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披露
所有作者均无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由2022年日本移植学会基础研究资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16 G 静脉导管 | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC 套管 |
| 20 G 静脉导管 | TERUMO | SR-FF1651 | PV 套管 |
| 8-0 编织丝线 | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 丝线 |
| Belzer UW 冷保存液 | Astellas | 器官保存液 | |
| 血管夹钳（Bulldog钳） | B BRAUN | FB329R | 血管夹钳（Bulldog钳） |
| C57BL/6 小鼠 | Oriental Bio Service | ||
| 异氟烷吸入溶液 | Viatris | 麻醉剂 | |
| 微细钝头镊尖 0.1 mm × 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | 直头显微镊 |
| 带锁微血管夹施夹器 | F.S.T | 18056-14 | 血管夹施夹器 |
| 微血管夹（Micro Serrefines） | F.S.T | 18055-4 | 血管夹 |
| No.11 备用刀片 | FEATHER Safety Razor | 11 | 刀片 |
| 眼科剪，圆柄 | B BRAUN | FD103R | 显微剪 |
| 塑料矩形容器 | Daiso | 长 10 cm，宽 15 cm，高 6 cm | |
| SuperGrip 镊尖 | F.S.T | 00649-11 | 弯头显微镊 |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | 显微镜 |
| 台钳 | Niigataseiki | 00505351 | 用于将 Pean 钳固定在桌面上的机械工具 |
参考文献
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- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
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