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方法文章

新型碱木质素微/亚微米颗粒的绿色合成、表征、包封及其释放潜力测定

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DOI：

10.3791/66216

⸱

2024年3月1日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Animal Physiology, Biochemistry and Chemistry, Faculty of Veterinary Medicine, Trakia University

本文内容

摘要

我们描述了生物相容性木质素微米及亚微米颗粒合成与表征的新型简便方法。这些制剂为这种杂聚物的利用提供了便捷途径，同时也为设计具有生物医学、制药技术和食品工业潜在应用价值的多功能载体基质提供了替代方案。

摘要

生物聚合物微/纳米技术在人类医学、兽医学、制药及食品技术领域的应用正迅速扩展，这得益于基于生物聚合物的颗粒作为高效载体系统的巨大潜力。利用木质素作为设计创新性微米/亚微米制剂的基础杂聚物生物基质，可提高制剂的生物相容性，并提供多种活性功能基团，从而为调控制剂的理化性质和生物活性以适应不同应用需求创造了条件。本研究旨在建立一种简便且环境友好的木质素微米及亚微米颗粒合成方法；评估其理化、光谱及结构特性；并考察其对生物活性分子的包封能力及其应用潜力。 体外 在模拟胃肠道介质中生物类黄酮的释放。所提出的方法采用廉价且环保的溶剂，操作简便、直接、快速且灵敏，所需设备少，使用无毒物质，并通过简单的方法进行表征，测定对难溶于水的生物活性化合物杨梅素和槲皮素的包封能力，以及 体外 木质素基质的释放潜力

引言

如今，由于纤维素、壳聚糖、胶原蛋白、葡聚糖、明胶和木质素等生物聚合物在组织工程、3D生物打印以及生物医药、制药和食品技术领域的广泛应用，这些生物聚合物作为可定制尺寸、理化性质和生物功能的微米/亚微米载体设计前体的研究日益受到关注。 体外 疾病建模平台、包装工业、乳液制备、营养递送等1,2,3.

最新研究强调了木质素基水凝胶以及微米和纳米制剂4作为有利载体的应用前景，可用于食品包装材料5、能量储存6、化妆品7、热/光稳定剂、增强材料以及疏水性分子递送的药物载体基质8，在提升紫外线阻隔性能9、作为纳米复合材料中的增强剂，以及因近期一些安全性问题而作为无机纳米颗粒的替代品等方面展现出潜力10,11,12。 这一趋势的背后原因在于这种天然杂合生物聚合物具有良好的生物相容性、可生物降解性和无毒性，同时木质素已被证实具有抗氧化潜能和自由基清除能力、抗增殖作用以及抗菌活性等生物功能13,14,15,16,17。

科学文献报道了多种木质素基微/纳米制剂的合成方法（如自组装、反溶剂沉淀、酸沉淀和溶剂转移法）18及其表征手段，其中包括使用价格昂贵或有害的溶剂，如四氢呋喃（THF）、二甲基亚砜（DMSO）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和丙酮，以及需要大量仪器和有毒物质的复杂、间接且繁琐的工艺过程12,19,20。

为克服上述缺点，以下方案提出了一种利用廉价且环境友好的溶剂合成木质素基微米/亚微米颗粒的新方法；该方法操作简便、直接、快速且灵敏，所需设备少，使用无毒物质，并具备简单的表征手段，可用于测定其对难溶于水的生物活性化合物的包封能力。 体外 木质素基质的释放潜力。所介绍的实验室规模制备方法有利于制备具有可调粒径、高包封容量和可持续性的功能化木质素载体 体外 利用简单的表征方法和环保型化学品研究释放行为，可在生物医学科学和食品技术等多个领域中应用。两种黄酮类化合物被用作目标分子，分别包封于木质素颗粒中：柚皮素包封于微米颗粒，槲皮素包封于亚微米颗粒。这两种黄酮类化合物的结构差异仅在于B芳香环上第二个-OH基团的位置不同：柚皮素的-OH基团位于2'位，而槲皮素位于3'位，因此这两种有机化合物为位置异构体。这一特性提示，这两种生物活性天然化合物在包封和/或释放过程中可能表现出相似的行为。

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方案

1. 木质素微粒的合成

  1. 在磁力搅拌器上将 2.5 g 碱木质素溶解于 50 mL 超纯水中，配制 50 mg/mL 的碱木质素水溶液。
  2. 将 1 mL Tween 80 溶解于 100 mL 超纯水中，配制 1% 的 Tween 80 溶液。
  3. 取 6.65 mL 的 67% HNO3（密度 = 1.413 g/mL），用超纯水稀释至终体积为 50 mL，配制 2 M 的 HNO3 溶液。
  4. 将 15 mL 的 1% Tween 80 溶液缓慢加入 50 mL 的 50 mg/mL 碱木质素溶液中。
  5. 在磁力搅拌器上以 500 rpm 的转速搅拌混合物 10 分钟，使表面活性剂充分分散。
  6. 用注射器以约 150 µL/s 的流速将 20 mL 的 2 M HNO3 逐滴加入上述混合物中。
  7. 继续搅拌混合物 30 分钟，直至深棕色溶液转变为浅棕色的微粒悬浮液。
  8. 将悬浮液转移至 1.5–2 mL 的离心管中，在 10 °C 条件下，以 15,000 × g 的离心力进行超速离心 30 分钟。
  9. 收集上清液用于后续分析，并用超纯水洗涤沉淀的微粒。
  10. 重复洗涤与超速离心操作 3 次。
  11. 在进行超声均质前，将盛有微粒的容器浸入冰浴中冷却。
  12. 在超声波均质器上以 93% 的强度对微粒进行 4 分钟的均质处理。
  13. 将微粒在冻干机中于 -64 °C 下进行冷冻干燥，并储存于干燥器中以备后续使用。

2. 木质素亚微米颗粒的合成

  1. 通过在磁力搅拌器上将125 mg碱木质素溶解于25 mL超纯水中，制备5 mg/mL的碱木质素水溶液。
  2. 缓慢向碱木质素溶液中加入1 mL 96%的乙醇（EtOH）。
  3. 在磁力搅拌器上以500 rpm的速度搅拌混合物3分钟。
  4. 通过将0.5 g柠檬酸溶于超纯水并定容至50 mL，制备50 mL的1%柠檬酸溶液。
  5. 使用注射器以约4 mL/min的流速向混合物中逐滴加入7 mL 1%柠檬酸溶液。
  6. 继续搅拌混合物10分钟，此时棕黄色澄清溶液将转变为浑浊的浅棕色亚微米颗粒悬浮液。
  7. 将悬浮液转移至离心管中，在超速离心机中于10 °C条件下以15,000 × g离心30分钟。
  8. 收集上清液用于进一步分析，并用超纯水冲洗微粒。
  9. 重复冲洗/超速离心步骤3次。
  10. 在进行超声均质前，将盛有微粒的容器浸入冰浴中冷却。
  11. 在超声均质器中以96%的强度进行两次超声处理，每次4分钟。
  12. 第一次处理后冷却容器1分钟。
  13. 在冷冻干燥机中于-64 °C条件下对微粒进行冻干，并将其储存于干燥器中以备后续使用。

3. 天然黄酮类化合物包封木质素微/亚微米颗粒的合成

  1. 对微粒重复执行步骤 1.1–1.5。
  2. 称取 0.08 g 槲皮素（morin），溶于 1 mL 乙醇（EtOH）中，并将该乙醇溶液加入混合物中。
  3. 将混合物置于磁力搅拌器上，以 500 rpm 转速搅拌 20 分钟。
  4. 用注射器以约 150 µL/s 的流速逐滴向混合物中加入 20 mL 2 N HNO3。
  5. 继续搅拌混合物 60 分钟。
  6. 重复步骤 1.8–1.13。
  7. 对亚微米颗粒重复执行步骤 2.1。
  8. 称取 0.04 g 槲皮素（quercetin），溶于 1 mL 乙醇（EtOH）中，并将该乙醇溶液加入碱木质素水溶液中。
  9. 将混合物置于磁力搅拌器上，以 500 rpm 转速搅拌 10 分钟。
  10. 重复步骤 2.4–2.13。

4. 木质素微/亚微颗粒包封效率的测定

  1. 在合成两种类型的黄酮类化合物包埋木质素颗粒的过程中，计算所添加的生物活性物质的含量。
    1. 将步骤1.9和2.8中获得的上清液用96% EtOH稀释后，通过分光光度法测定黄酮类化合物在上清液中的吸光度。
    2. 利用黄酮类化合物的标准曲线，计算未包埋的杨梅素/槲皮素的浓度。
    3. 通过公式（1）计算木质素微粒对天然黄酮类化合物的包封效率（EE, %）：
      包封效率公式；科研、教学工具，EE计算方法     (1)
      其中 wo 为添加的生物活性物质总量（mg），wf 为未包埋的游离黄酮类化合物量（mg）。
    4. 使用公式（2）计算载药量（DLC, %）——表示单位重量载体系统中颗粒所载药物量的重要参数：
      载药量公式，药物分析中DLC的计算方程。     (2)
      其中 wp 为冻干后获得的木质素微/亚微米颗粒的总产量（mg）。

5. 木质素微米和亚微米颗粒的表征

  1. 颗粒数量、粒径及粒径分布的测定
    1. 使用带有微珠计数功能的自动细胞计数器评估样品的粒径及粒径分布。用移液器吸取1 µL木质素/黄酮类微米/亚微米颗粒在超纯水中的悬浮液，加入计数板检测所需的小孔中。
    2. 等待自动细胞计数器显示屏上显示每1 mL悬浮液中的颗粒数量及其按粒径分布的数据。
      注意：仪器支持将数据存储至U盘。自动细胞计数器专用软件可用于对保存的数字文件和图像文件进行进一步处理。
  2. 通过电位滴定法测定木质素颗粒表面酸性/碱性官能团含量
    1. 称取0.04 g未负载/黄酮类包埋的木质素颗粒。
    2. 转移至锥形瓶中，加入10 mL 0.1 M HCl，并将锥形瓶置于磁力搅拌器上，以250 rpm搅拌。
    3. 用0.1 M NaOH标准滴定液填充50 mL滴定管。
    4. 滴定开始前，使用台式pH计测量锥形瓶中溶液的初始pH值。
    5. 开始滴定，每加入0.5 mL滴定液后，测量一次被测溶液的pH值。
    6. 将实验数据记录于表格中，表格内容包括所用滴定液体积及对应的pH值。
    7. 当继续增加滴定液体积而pH值趋于恒定时，停止滴定。
    8. 将实验数据绘制成零阶、一阶和二阶导数微分滴定曲线。
    9. 确定滴定过程中的等当点及对应的等当体积。
    10. 利用公式（3）和（4）计算未负载及负载黄酮类的木质素颗粒表面酸性Aa和Ab官能团的含量：
      静态平衡公式 Aa=Vequi×NT/m。物理计算用方程符号。 ，mgeq/g     (3)
      滴定方程，用于化学反应分析中计算A_b的公式。 mgeq/g     (4)
      其中Veqi为等当体积（mL）；NT为滴定液的当量浓度（mgeq/mL）；VT为测定过程中所用滴定液的体积（mL）；m为被测样品的质量（g）。
  3. 通过固体添加法测定木质素基颗粒的零电荷点pH（pHPZC）
    1. 配制60 mL 0.1 M NaCl水溶液。
    2. 在五个带塞锥形瓶中各加入9 mL 0.1 M NaCl溶液，并分别通过加入0.1 M HCl或0.1 M NaOH将pH调节至pHi = 2、4、7、10和12（其中i = 1–5表示相应溶液的编号）。通过加入同浓度的NaCl溶液，将每个锥形瓶中溶液的总体积精确调整至10 mL。
    3. 向每个锥形瓶中加入40 mg干燥的木质素颗粒（未负载、负载黄酮类的微米/亚微米颗粒），并严密封口。
    4. 将锥形瓶垂直固定于轨道摇床上，持续振荡24 h。
    5. 静置平衡30 min后，分别测定各锥形瓶中上清液的最终pH值（pHf）。
    6. 以最终pH值（pHf）为纵坐标，初始pH值（pHi）为横坐标作图。
    7. 零电荷点（pHPZC）定义为ΔpH与pHi关系曲线与坐标为（pHi; pHi）的直线相交时所对应的pH值。
  4. 木质素颗粒总酚含量（TPC）的测定
    注意：微米/亚微米木质素颗粒的总酚含量（TPC）采用改进的福林-酚比色法进行测定。
    1. 将200 µL浓度为500 µg/mL的颗粒水悬浮液与600 µL超纯水及200 µL福林-酚试剂（1:1, v/v）混合。
    2. 5 min后，向混合液中加入1.0 mL 8% Na2CO3和1.0 mL Milli-Q水，在40 °C水浴中避光孵育30 min，期间间歇振荡。
    3. 将悬浮液在5,300 × g条件下离心2 min。
    4. 制备不含颗粒的空白对照样。
    5. 取3.5 mL上清液转移至10 mm石英比色皿中，以空白为参比，在可见光区760 nm波长下用紫外/可见分光光度计测定吸光度。
    6. 按照步骤5.3.1–5.3.5制备标准没食子酸的校准曲线；仅将200 µL木质素颗粒悬浮液替换为初始浓度分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150和200 µg/mL的没食子酸乙醇溶液。
    7. 将微粒的实验数据表示为每克干样品中含有的没食子酸当量毫克数（mg GAE/g）。
    8. 使用公式（5）计算TPC：
      总酚含量公式，TPC = CGA/CS×1000，化学分析方程。 mg GAE/g     (5)
      其中CGA为根据标准没食子酸校准曲线所得的样品浓度（µg GA/mL）；Cs为样品浓度，等于干样品质量除以溶剂体积（µg/mL）。

6. 测定 体外 木质素颗粒的释放能力

  1. 通过使用 0.1 M HCl 将标准 PBS 溶液的 pH 调节至 pH = 1.2，制备 250 mL 模拟无酶胃液介质。
  2. 分别用 0.1 M NaOH/0.1 M HCl 调节标准 PBS 溶液的 pH 至 6.8 和 7.4，制备各 250 mL 的两种模拟肠液溶液。
  3. 将25 mg黄酮类包埋的微/亚微米颗粒加入至装有机械搅拌器的玻璃间歇反应器中的50 mL模拟无酶胃液介质中，并将反应器置于恒温为T = 37 ± 0.2 ℃的恒温水浴中 oC.
  4. 将搅拌器浸入液面下至液体体积的2/3深度，以确保固相和液相充分混合，并在无死区的情况下实现最大传质。
  5. 每10分钟从反应器中取出1 mL样品，直至90分钟th 立即加入1 mL新鲜模拟体液溶液至反应器中，以防止总体积变化并确保汇条件。
  6. 分别使用 pH = 6.8 和 pH = 7.4 的模拟肠液溶液，重复相同的实验步骤（包括步骤 6.3–6.6），持续 200 分钟。
  7. 在三种模拟介质中使用未负载的木质素颗粒进行类似的实验，并将这些样品作为空白对照用于分光光度计的调零。
  8. 过滤样品后，用96% EtOH稀释，并以第6.7步的空白样品为对照，通过分光光度法测定样品的吸光度；然后分别利用在pH = 1.2、6.8和7.4条件下获得的杨梅素标准曲线，计算相应的黄酮浓度。
  9. 使用公式（计算生物类黄酮的累积释放量（CR）6在 µg/mL 累积释放百分比（CRP）通过公式（7):
    色谱法中化学浓度比的计算公式，CR=Ci+1+(Vs/V)·Ci。    (6)
    其中 Ci 和 Ci+1 i 中的桑色素/槲皮素浓度th 以及 (i+1)th 样本（µg/mL)；Vs 取自批式反应器的样品体积（mL）；V 为模拟培养基的总体积（mL）。
    科学背景下的CRP计算公式；百分比，浓度，方程。    (7)
    其中 C最大值 是载体中生物活性化合物的最大浓度（µg/mL).

7. 统计分析

  1. 以三次独立测量的均值 ± 标准差（SD）表示实验数据。
  2. 通过执行方差分析（ANOVA）作为事后检验，确定实验结果的统计学显著性。将 p 值小于 0.05 视为具有统计学意义。 < 0.05 具有统计学显著性。

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结果

采用反溶剂沉淀法制备碱木质素微米/亚微米级颗粒。将稀释的无机酸（硝酸）/有机酸（柠檬酸）水溶液分散至含有环保型表面活性剂/乙醇的碱木质素水溶液中，导致生物聚合物溶质逐步沉淀；经超声处理后，最终形成致密的微米/亚微米级颗粒悬浮液（图1）。

木质素微粒合成装置、分光光度计、颗粒比较试管、实验室实验。
图 1：木质素颗粒的均质化。（A）合成的木质素亚微米颗粒的超声波均质化；（B）均质后的负载槲皮素与未负载槲皮素的木质素微粒。

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讨论

在基于生物聚合物的药物载体配方设计的现代合成方法学中，主要关键问题之一是使用有害的有机试剂——如四氢呋喃、丙酮、甲醇，甚至高浓度的二甲基亚砜（DMSO）等挥发性和易燃性溶剂——由于可能产生毒性效应，限制了其在生物医学、制药工业和食品技术中的应用20,21,22,23,24。另一个关键问题是合成过程中涉及复杂的化学反应（如酯化、聚合）或昂贵的仪器设备。本文所介绍的两种技术通过采用替代性溶剂（水）以及无毒化合物（如表面活性剂Tween 80和交联剂乙醇、柠檬酸），克服了上述局限性，因而被归类为"绿色"合成方法。此外，这些方法满足了迫切需要开发低成本、环境友好且可持续的木质素颗粒制备工艺的需求，为生理活性物质提供了可生物降解、具有生物活性且生物相容性的载体模板25

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由保加利亚科学基金合同 № KΠ-06 H59/3 及特拉基亚大学科学项目 No. 07/2023 FVM 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
自动细胞计数器EVE, NanoEnTek
柠檬酸Sigma251275 ACS 级试剂，≥99.5%
数字水浴锅Memmert
1.5–2 mL 离心管（Eppendorf 管）
乙醇Sigma34852-M无水乙醇，适用于 HPLC，≥99.8%
福林-酚试剂（Folin–Ciocalteu’s 酚试剂）SigmaF9252
 冷冻干燥机Biobase
没食子酸Sigma-BCBW7577一水合物
HClSigma258148ACS 级试剂，37%
HNO3Sigma438073 ACS 级试剂，70%
碱性木质素Sigma370959
桑色素SigmaPHL82601
NaClSigmaS9888ACS 级试剂，≥99.0%
Na2CO3Sigma223530粉末，≥99.5%，ACS 级试剂
NaOHSigma655104试剂级，97%，粉末
轨道摇床IKAKS 130 basic
pH 计Consort
磷酸盐缓冲液（PBS）SigmaRNBH7571
槲皮素水合物SigmaSTBG3815V
Excel 统计分析软件Microsoft CorporationXLSTAT  版本 2022.4.5
吐温 80SigmaP8074BioXtra，黏稠液体
超速离心机HermleZ 326 K
超纯水系统AdronaINTEGRITY+
超声波均质器Bandelin SonopulsHD 2070
紫外-可见分光光度计Hach-LangeDR 5000

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