实验性自身免疫性脑脊髓炎后小鼠自身反应性抗体的定量

多发性硬化症 （MS） 是一种中枢神经系统 （CNS） 的慢性自身免疫性疾病，其特征是免疫细胞局灶性浸润到脑实质、包裹轴突的髓鞘破裂、神经胶质细胞活化和神经元丢失¹。除了致病性 T 细胞的公认作用外，多条证据还强调了 B 细胞参与介导针对中枢神经系统的自身免疫反应。B 细胞在 MS 脑中发生克隆扩增，并且在脱髓鞘病变中检测到针对髓鞘成分的抗体 ^2,3。最近有记录表明，外周 B 细胞在疾病发作时的选择性激活，表明该免疫细胞区室在疾病起始中也具有假定的作用⁴。B 细胞耗竭疗法（如抗 CD20 单克隆抗体）的成功进一步证实了异常 B 细胞功能与自身免疫性脱髓鞘之间的机制联系 ^5,6。从分子的角度来看，B 细胞可以通过自身抗原呈递、促炎细胞因子分泌和自身反应性抗体产生来导致疾病。

已经开发了多种动物模型来概括复杂 MS 表型的特定特征。其中，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是 体内 应用最广泛的范式，依赖于实验动物使用源自髓鞘蛋白的短肽进行免疫，如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）和髓鞘碱性蛋白（MBP）⁷。EAE 免疫动物发展出脱髓鞘病理学，在许多方面类似于 MS，包括对脑炎肽⁸ 的强大体液反应。出于这个原因，EAE 研究在解剖 B 细胞和自身抗体在疾病背景下的功能方面发挥了重要作用。例如，研究表明，从 MS 患者中分离出的 MOG 特异性抗体可以加重 EAE 模型⁹ 的临床病程。 值得注意的是，人 MOG 中 42 位的脯氨酸残基被证明对于确定自身抗体致病性至关重要¹⁰。最近，已发现 MOG 特异性自身抗体不仅通过介导髓鞘丢失来促进疾病，而且还通过促进中枢神经系统¹¹ 内自身反应性 T 细胞的再激活。

考虑到抗体反应在中枢神经系统自身免疫中的重要性，本文提出了一种基于 ELISA 的方案，以有效测量用 MOG35-55 肽免疫的 C57BL/6J 小鼠 EAE 中自身反应性抗体的血清水平。在方案的第一部分，将描述 通过 心内穿刺收集血清的方法。随后，将详细说明设置 ELISA 测定和获取数据的程序。最后，将讨论数据分析和解释。

所有涉及小鼠的程序均按照东卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的实验指南进行。本研究使用8-10周龄的野生型C57BL/6J雌性小鼠。这些动物是从商业来源获得的（见材料表）。EAE 是在先前发表的报告 12,13,14 之后诱导的。

1. 血清采集

1. 在通过MOG35-55免疫诱导EAE后，在所需的时间点（遵循机构批准的方案）通过CO₂窒息或异氟烷过量对实验小鼠实施安乐死。
   注:小鼠总数和血清收集的时间点可以根据具体实验而变化。
2. 在通过脚趾或尾巴捏确认没有生命体征后，将小鼠置于解剖托盘的背部卧位，并用别针或胶带将四肢固定到位。将鼠标身体对准 LED 光源（参见 材料表）以照亮动物的胸部。
3. 用70%乙醇喷洒小鼠皮毛，并使用解剖剪刀从骨盆到剑突沿腹部切开3-4厘米的中线切口，注意避免任何器官和主要血管（图1A-C）。为了方便该过程，请使用镊子抓住剑突上方的皮肤。
4. 横向切开横膈膜，然后使用弹簧剪刀在两个侧缘前切肋骨，在到达中线的胸骨之前停下来（图1D）。折叠在小鼠头上创建的肋骨瓣，露出心脏（图1E）。
   注意:应避免切割胸骨，因为这会损害靠近骨骼的主要胸动脉并减少可以收集的血液量。
5. 将连接到1mL注射器的25G针插入左心室，并通过轻轻拉回柱塞来收集血液（图1F）。为了便于穿刺针刺穿，轻轻地将心脏支撑在一副镊子上。
   注意:如果血液没有立即进入注射器，则应缓慢旋转针头，并应测试不同的角度。但是，在第一次尝试时应努力正确放置针头，以避免在心脏上产生不必要的孔，使血液渗出。
6. 将血液转移到无菌 1.5 mL 管中，并在室温下凝结 30 分钟。通过在4°C下以2000×g离心20分钟除去凝块。 收集代表血清分数的上清液，并将一次性等分试样储存到-80°C的低温管中，以备将来检测。

2. ELISA检测

1. 将冻干的 MOG35-55 肽（参见 材料表）重悬于水中，以获得 10 mg/mL 储备液。在开始实验之前，在包被缓冲液中将储备液稀释至 10 μg/mL（参见 材料表），并将 100 μL/孔的最终溶液移液到 96 孔板中。用粘性薄膜密封板以避免蒸发，并将板在4°C下孵育过夜。
   注意:每个样品至少应计算 2 个孔，空白对照也应包括 2 个额外的孔。
2. 同时，用溶解在包被缓冲液中的100μL/孔牛血清白蛋白（BSA）以10μg/ mL浓度包被相同数量的孔包被。这些额外的孔将用作背景控制。
   注意:建议在对照孔中涂覆 BSA，因为涂层和封闭缓冲液具有不同的成分。请注意，其他产脑肽（如PLP139-151或MBP84-104）可用作BSA的无关抗原。
3. 第二天，用 200 μL/孔的磷酸盐缓冲盐水洗涤板 3 次，盐水补充有 0.05% 吐温 20 （PBS-T）。随后，在PBS（不含吐温20）中加入100μL/孔由3%BSA制成的封闭溶液，并将密封的板在37°C下在杂交炉中孵育1小时。
4. 用 200 μL/孔的 PBS-T 洗涤板 3 次。在封闭溶液中以 1:100 稀释每个血清样品，并将 100 μL/孔添加到 MOG35-55 和 BSA 包被孔中。将相同体积的封闭溶液添加到指定为空白的孔中。将密封的板在室温下孵育2小时，并不断摇动（250rpm）。
5. 用 200 μL/孔的 PBS-T 洗涤板 3 次。在由 0.2% BSA 制成的 PBS-T 溶液中稀释 HRP 偶联的二抗（1:2000，参见 材料表），并向所有孔中加入 100 μL/孔。在室温下将密封的板孵育1小时，并不断摇动（250rpm）。
6. 用 200 μL/孔的 PBS-T 洗涤板 3 次。向所有孔中加入 100 μL/孔的 3,3'，5,5' 四甲基联苯胺 （TMB） 底物（参见 材料表），并在黑暗中孵育 1-5 分钟，监测蓝色的发展。
   1. 通过加入 100 μL/孔的终止溶液（参见 材料表）终止反应，并使用设置为 450 nm 波长的读板器测量每个孔中的光密度 （OD）。
      注意:TMB 底物应在室温下平衡 30-60 分钟，然后再将其添加到孔中。

3. 数据分析

1. 使用从板中读取的 OD 值填充 Excel 电子表格。平均每个样品从重复孔（MOG35-55 和 BSA 涂层）获得的 OD 值。
2. 对于每个样品，从 MOG35-55 涂层孔的平均值中减去 BSA 涂层孔的平均值。所得的背景校正值将与不同血清样本中抗 MOG35-55 抗体的浓度成正比。
   注意:空白孔应产生 0 左右的校正值。
3. 应用非参数统计检验（如 Mann-Whitney U 检验）来比较两个实验条件之间的平均 OD 值。每个条件至少包括 3 个独立样本。

为了证明本 ELISA 测定的稳健性，在免疫 （dpi） 后 20 天，在 C57BL/6J 雌性小鼠队列中分离的血清样品中测试了该方法，在经过验证的 EAE 诱导方案 12,13,14 之后，在完全弗氏佐剂 （CFA） 中。动物在第 0 天和第 2 天还接受了 400 ng 百日咳毒素。来自模拟免疫动物的血清样本，含有所有物质，但没有肽，作为阴性对照。所有 EAE 小鼠在 11-14 dpi 之间出现疾病的最初迹象，并在 20 dpi 时达到 0-6 分的平均得分为 2.6 ± 0.6（标准误差，SE）（0，无迹象;1，尾音降低;2，轻度单脑麻痹或截瘫;3，严重截瘫;4，截瘫;5，四肢麻痹;和 6，垂死或死亡）12。正如预期的那样，与对照样品相比，EAE样品的OD值明显更高（图2）。这些数据证实了在疾病高峰期存在针对 MOG 肽的强大 IgG 免疫球蛋白反应。

图 1:心脏穿刺程序。 （A-E） 成年小鼠进入心脏的开胸手术的代表性图像。（F） 将针头插入小鼠心脏左心室的正确程序的代表性图像。每个面板中都标明了相关的解剖结构，以方便解剖。请点击这里查看此图的较大版本.

图2:MOG肽自身抗体ELISA。 使用报告的 ELISA 方案在免疫后 20 天 （dpi） 在 EAE 和模拟免疫小鼠中测试抗 MOG35-55 IgG 免疫球蛋白的血清水平。与对照组相比，在 EAE 样品中检测到的 OD 值始终较高。数据以均值± SE 表示（N = 3 每组）。采用单尾Mann-Whitney U检验评估组间差异，*P ≤ 0.05。 请点击这里查看此图的较大版本.

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