实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。
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摘要
摘要
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种在组织病理学和分子水平上模拟自身免疫性疾病多发性硬化症（MS）的疾病模型。EAE通过免疫实验动物诱导产生 通过 皮下注射短髓鞘肽并联合特定佐剂以增强免疫反应。与人类疾病相似，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠会出现脱髓鞘病变、免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）、胶质细胞活化以及神经元损伤。大量证据亦支持B细胞功能障碍在多发性硬化（MS）和EAE发病机制中的重要作用。B细胞可作为抗原呈递细胞，同时也是促炎性细胞因子和自身抗体的主要来源。在EAE模型中，机体可产生针对诱导疾病所用髓鞘肽的抗体。这些自身抗体已被证实可介导髓鞘丢失或致病性T细胞向中枢神经系统的再激活。本文介绍一种基于ELISA的高效方法，用于定量检测经髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55（MOG35-55）肽免疫的C57BL/6J小鼠血清中的自身抗体。该方法可作为研究自身免疫性脱髓鞘背景下异常体液免疫反应特异性与强度的有力工具。
引言
多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性疾病，其特征是免疫细胞局灶性浸润脑实质、包裹轴突的髓鞘破坏、胶质细胞活化以及神经元丢失1。除了致病性T细胞的明确作用外，大量证据还表明B细胞参与了针对中枢神经系统的自身免疫反应。B细胞在多发性硬化症患者脑内发生克隆扩增，且已在脱髓鞘病灶中检测到针对髓鞘成分的抗体2,3。近期研究记录了疾病起始阶段外周B细胞的选择性活化，提示该免疫细胞亚群在疾病启动中也可能发挥作用4。B细胞耗竭疗法（如抗CD20单克隆抗体）的临床成功进一步证实了B细胞功能异常与自身免疫性脱髓鞘之间的机制性关联5,6。从分子层面来看，B细胞可通过自身抗原呈递、促炎性细胞因子分泌以及自身反应性抗体的产生等方式促进疾病发展。
已开发出多种动物模型，以重现复杂多发性硬化症（MS）表型的特定特征。其中，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是最广泛使用的体内研究范式，该模型依赖于使用源自髓鞘蛋白（如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）和髓鞘碱性蛋白（MBP））的短肽对实验动物进行免疫7。经EAE免疫的动物会产生脱髓鞘病理变化，该变化在多个方面与MS相似，包括对致脑炎肽产生强烈的体液免疫反应8。因此，EAE研究在解析B细胞和自身抗体在疾病背景下的功能方面发挥了关键作用。例如，已有研究表明，从MS患者体内分离出的MOG特异性抗体可在EAE模型中加重临床病程9。值得注意的是，人MOG第42位的脯氨酸残基被证实对决定自身抗体致病性具有关键作用10。最近的研究进一步发现，MOG特异性自身抗体不仅可通过介导髓鞘丢失促进疾病进展，还可通过增强中枢神经系统（CNS）内自身反应性T细胞的再活化而发挥作用11。
考虑到抗体反应在中枢神经系统自身免疫中的重要性，本文介绍了一种基于ELISA的实验方案，用于高效检测经MOG35-55肽免疫的C57BL/6J小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中血清内自身反应性抗体的水平。在该方案的第一部分，介绍了血清采集的方法 通过 将描述心脏内穿刺操作。随后，详细说明建立ELISA检测方法及获取数据的步骤。最后，讨论数据分析与结果解读。
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方案
所有涉及小鼠的操作均遵循东卡罗来纳大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的实验指南进行。本研究使用8至10周龄的野生型C57BL/6J雌性小鼠。实验动物购自商业来源（见 材料表）。EAE的诱导参照既往已发表的文献报道进行12,13,14.
1. 血清采集
- 通过 CO 处死实验小鼠2 在诱导EAE后，在规定时间点（按照机构批准的方案）通过窒息或异氟烷过量处死动物 通过 MOG35-55 免疫
注意：小鼠总数及血清采集时间点可根据具体实验而调整。 - 在通过脚趾或尾部夹捏确认无生命体征后，将小鼠置于解剖盘上呈仰卧位，并用图钉或胶带固定四肢。调整小鼠身体方向，使其朝向LED光源（参见 材料表用以照射动物的胸部。
- 用70%乙醇喷洒小鼠毛发，使用解剖剪从骨盆至剑突沿腹部中线做一3-4 cm的切口，注意避免损伤任何器官和主要血管（图1A- C）。为便于操作，使用镊子夹住剑突上方的皮肤。
- 用弹簧剪刀横向剪开膈肌，然后沿两侧肋骨外侧缘向前剪开肋骨，至接近胸骨中线处停止，避免剪到胸骨图1D）。将所形成的肋间皮瓣折叠至小鼠头部上方，以暴露心脏（图1E).
注意：应避免切割胸骨，因为这会损伤紧邻骨骼的主要胸动脉，从而减少可采集的血量。 - 将连接1 mL注射器的25 G针头插入左心室，通过轻柔回拉活塞收集血液（图1F）。为便于针头穿刺，可轻轻用镊子固定住心脏。
注意：如果血液未立即进入注射器，应缓慢旋转针头并尝试不同的角度。然而，应尽量在第一次穿刺时就准确定位针头，以避免在心脏上造成不必要的穿孔，防止血液由此渗漏。 - 将血液转移至无菌的1.5 mL离心管中，在室温下静置30分钟使其凝固。在4 °C条件下以2000 × g离心20分钟，去除血凝块。收集上清液（即血清组分），分装成单次使用量于冻存管中，于-80 °C保存，以备后续检测。
2. ELISA 检测
- 将冻干的MOG35-55多肽（参见材料表）用纯水重悬，配制成10 mg/mL的储存液。实验开始前，用包被缓冲液（参见材料表）将储存液稀释至10 μg/mL，并向96孔板中每孔加入100 μL终溶液。用封口膜密封板子以防止蒸发，并在4 °C下孵育过夜。
注意：每个样本至少应设置2个复孔，同时应额外设置2个空白对照孔。 - 同时，用100 μL/孔、浓度为10 μg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶于包被缓冲液中，对相同数量的孔进行包被。这些额外的孔将作为背景对照。
注意：建议使用BSA包被对照孔，因为包被缓冲液和封闭缓冲液的组成不同。请注意，其他脑炎致病性多肽（如PLP139-151或MBP84-104）可替代BSA作为无关抗原使用。 - 次日，用含0.05% Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBS-T）以每孔200 μL洗板3次。随后，每孔加入100 μL由PBS（不含Tween 20）配制的3% BSA封闭液，将板子密封后置于杂交炉中，在37 °C孵育1小时。
- 用PBS-T以每孔200 μL洗板3次。将每份血清样本用封闭液按1:100稀释，分别向MOG35-55包被孔和BSA包被孔中每孔加入100 μL。向设定为空白对照的孔中加入等体积的封闭液。将板子密封后在室温下孵育2小时，并持续震荡（250 rpm）。
- 用PBS-T以每孔200 μL洗板3次。将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1:2000，参见材料表）用含0.2% BSA的PBS-T溶液稀释后，每孔加入100 μL。将板子密封后在室温下孵育1小时，并持续震荡（250 rpm）。
- 用PBS-T以每孔200 μL洗板3次。向所有孔中每孔加入100 µL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液（参见材料表），避光孵育1–5分钟，观察蓝色显色情况。
- 通过每孔加入100 µL终止液（参见材料表）终止反应，并使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的光密度（OD）。
注意：TMB底物在加入孔板前应于室温平衡30–60分钟。
- 通过每孔加入100 µL终止液（参见材料表）终止反应，并使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的光密度（OD）。
3. 数据分析
- 将从酶标板读取的OD值填入Excel电子表格中。对每个样本的复孔（包括MOG35-55包被孔和BSA包被孔）所获得的OD值取平均值。
- 对每个样本，用MOG35-55包被孔的平均OD值减去BSA包被孔的平均OD值。所得背景校正值将与不同血清样本中抗MOG35-55抗体的浓度成正比。
注意：空白孔的校正后数值应接近于0。 - 采用非参数统计检验方法（如Mann-Whitney U检验）比较两种实验条件之间的平均OD值。每种实验条件应至少包含3个独立样本。
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结果
为了验证本ELISA检测方法的稳健性，采用经验证的EAE诱导方案12,13,14，对一组C57BL/6J雌性小鼠在免疫后20天（dpi）采集的血清样本进行了检测，免疫时使用100 μg MOG35-55肽段与完全弗氏佐剂（CFA）联合注射。动物在第0天和第2天还接受了400 ng百日咳毒素。未使用肽段、其余处理相同的模拟免疫动物的血清样本作为阴性对照。所有EAE小鼠在免疫后11–14天出现疾病首发症状，并在20 dpi时达到平均2.6 ± 0.6（标准误差，SE）的临床评分（评分标准为0–6分：0分，无症状；1分，尾张力降低；2分，轻度单侧轻瘫或双侧轻瘫；3分，重度双侧轻瘫；4分，截瘫；5分，四肢轻瘫；6分，濒死或死亡）12。与对照样本相比，EAE样本的吸光度（OD）值显著升高，结果符合预期（图2）。这些数据证实...
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讨论
本文报道了一种简单且高效的基于ELISA的实验方案，用于在多发性硬化症（MS）病理相关的动物模型中准确量化体液免疫反应。该方法最近被用于描述ataxin-1蛋白在MOG35-55/C57BL6J EAE模型中调控血清自身抗体水平的新功能12。为此，为了通过该方法获得一致且具有生物学意义的结果，需考虑多种因素。
首先，必须采集高质量的血清样本并避免溶血。在严重溶血的样本中，红细胞释放的血红蛋白及其他细胞内成分可能干扰ELISA检测中的抗原-抗体反应及相对颜色测定。为防止溶血，在采血过程中应避免使用高负压注射器，因为这可能导致红细胞破裂。
其次，必须稀释血清样本，以获得处于吸光度曲线线性范围内的OD值。我们推荐的稀释倍数（1:100）是根据本实验所用小鼠品系中诱导的EAE病理程度进行校准的。考虑到该模型固有的异质性水平 体内 在使用该模型时，强烈建议进行初步的滴定实验，以确定针对所检测的特定EAE病理的最佳稀释倍数。同样，可根据情况调整TMB底物的孵育时间，以避免显...
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（R03NS131908）以及国防部多发性硬化症研究计划（资助号：W81XWH-22-1-0517）提供资助。观点、解释、结论和建议均为作者个人观点，不一定得到国防部的认可。本研究还得到了东卡罗来纳大学启动资金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G 针头 | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物 | Thermo Fisher | N301 | 在 4 °C 下保存 |
| 粘性封口膜 | Thermo Fisher | AB0558 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A7906 | 在 4 °C 下保存 |
| C57BL/6J 雌性小鼠 | The Jackson Laboratory | 000664 | 用于 EAE 实验的小鼠应为 8–10 周龄 |
| 冻存管 | Fisher | 10-500-25 | |
| 解剖托盘 | Fisher | S111022 | |
| 解剖剪刀 | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA 包被缓冲液 | BioLegend | 421701 | 在 4°C 下保存 |
| Excel 软件 | Microsoft | 分析用电子表格 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| 山羊抗小鼠 IgG，人吸附-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | 在 4 °C 下保存 |
| LED 光源 | Fisher | AMPSILED21 | |
| 酶标仪 | Fisher | 14-377-575 | |
| 分子生物学级水 | Corning | 46-000-Cl | |
| 小鼠 MOG35-55 肽 | EZBiolab | cp7203 | 在 -80 °C 下保存 |
| 多通道移液器 | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96 孔板 | BioLegend | 423501 | |
| 轨道摇床 | Fisher | 88-861-023 | |
| 烘箱 | VWR | 445-0024 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher | 14190144 | |
| 制冷台式离心机 | Thermo Fisher | 75002441 | |
| 终止液 | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
参考文献
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