本方案描述了利用Arabidopsis主花序茎和Brassica napus下胚轴诱导毛状根的方法。这些毛状根可进行培养，并作为外植体用于再生转基因植株。
本文内容
摘要
摘要
毛状根转化是多种植物生物技术中一种多用途的工具。携带根诱导（Ri）质粒的农杆菌（Agrobacterium）菌株侵染植物后，Ri 质粒中的T-DNA转移至植物基因组，从而在伤口部位诱导毛状根的形成。本实验方案详细描述了基于注射法在甘蓝型油菜DH12075（Brassica napus DH12075）和拟南芥Col-0（Arabidopsis thaliana Col-0）中诱导毛状根的过程。所获得的毛状根可用于目的外源基因的分析，或进一步用于转基因植株的培育。添加细胞分裂素6-苄氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，5 mg/L）和生长素1-萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，8 mg/L）的再生培养基可成功诱导两种植物的不定芽形成。本方案涵盖了再生植株及T1代植株的基因型鉴定与筛选，以获得携带目的外源基因且不含Ri质粒T-DNA的植株。此外，还介绍了一种可形成嵌合植株的替代方法：在此方法中，毛状根保留在植株地上部分（取代天然根系），从而可在整株植物背景下研究外源基因在毛状根中的功能。
引言
植物转化是植物生物学任何遗传学研究中的瓶颈。一种土壤传播的细菌， 根癌农杆菌，广泛用于通过花序浸润法或组织培养进行基因递送，以获得转化子。 A. tumefaciens 在伤口处感染植物，并因来自肿瘤诱导型（Tumor-inducing,Ti) 质粒导入宿主植物基因组。经改造的 A. tumefaciens 经修饰的菌株 Ti 不含野生型T-DNA的质粒和含有人工T-DNA及用于插入目的基因的克隆位点的双元载体，通常被用作高效的植物转化系统1然而，许多模式物种和作物对花序浸润法具有抗性或 体外 植物再生能力差或生长期较长，会影响该转化系统的效率。
Agrobacterium rhizogenes 在感染寄主植物后，会在伤口部位诱导产生不定根，即毛状根。与 A. tumefaciens 类似，A. rhizogenes 会将来自根诱导（Ri）质粒的T-DNA转移至寄主植物基因组中，从而引发转基因毛状根的发育。该过程主要由根癌致瘤位点（rol）基因调控2,3。通过使用携带 Ri 质粒以及编码目的基因的人工双元载体的农杆菌菌株，毛状根培养体系已被用于重组蛋白的生产、启动子或基因功能的分析，以及利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）进行基因组编辑4,5,6。
我们的方案使用接合子菌株 钛无 A. tumefaciens 携带C58C1的 Ri 质粒 pRiA4b7. T-DNA 的 Ri 质粒包含两个区域，即左右两侧的T-DNA（分别为TR-DNA和TL-DNA），可独立整合到植物基因组中8利用该系统，可缩短外植体转化过程中耗时较长的步骤 Brassica napus DH12075 品种经过优化9. 下述方案可实现特定毛状根品系的再生，并获得携带目标转基因且不含根癌农杆菌的T1代植株 rol 基因大约需要1年时间。基于注射的毛根转化方法也可用于其他十字花科物种，已有转化实例证明 拟南芥 Col-0. 尽管下胚轴被用于转化 B. napus, A. thaliana 注入主花序茎中。
方案
1. 培养基与溶液的配制
- 配制激素母液。
- 配制50 mL浓度为5 mg/mL的萘乙酸（NAA）、6-苄氨基嘌呤（BAP）和吲哚-3-丁酸（IBA）母液时，将250 mg粉末状激素溶于2 mL 1 M氢氧化钠（NaOH）中，再用超纯水定容至50 mL。
- 配制50 mL浓度为1 mg/mL的赤霉酸（GA3）母液时，将50 mg粉末状激素溶于2 mL乙醇中，再用超纯水定容至50 mL。
- 使用孔径为0.22 µm的无菌注射器滤器过滤溶液，并分装至无菌的2 mL离心管中储存。根据生产商建议，在-20 °C或4 °C条件下保存。
- 配制抗生素母液。配制50 mL浓度为100 mg/mL的头孢噻肟和羧苄青霉素二钠母液时，将0.5 g粉末状抗生素溶于40 mL超纯水中，再定容至50 mL。使用孔径为0.22 µm的无菌注射器滤器过滤溶液，并分装至无菌的2 mL离心管中储存。在-20 °C条件下保存。
注意：抗生素和激素均需在培养基冷却后加入。 - 配制1 L LB（Luria Broth）培养基：在1 L量筒中加入10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化钠（NaCl），用双蒸水定容至1 L。使用pH计和KOH将pH调节至7.0（遵循生产商说明书）。将溶液转移至1 L瓶中，若需制备固体培养基，则加入15 g细菌琼脂（1.5%），并进行高压灭菌。必要时，在培养基冷却后加入适当的抗生素（细菌抗性由双元载体携带）。
注意：使用高压灭菌器对溶液进行灭菌。将瓶子放入灭菌篮中，盖紧盖子，在121 °C、98.9 kPa条件下灭菌20分钟。此程序在后续步骤中均用于溶液的高压灭菌。 - 配制1 L YEB（酵母提取物牛肉）培养基：将5 g牛肉提取物、1 g酵母提取物、5 g蛋白胨、5 g蔗糖和0.5 g氯化镁（MgCl2）溶于双蒸水中，定容至1 L。将溶液转移至1 L瓶中，进行高压灭菌。
- 配制1 L种子萌发培养基：将2.2 g MS（Murashige和Skoog）粉末、10 g蔗糖（1%）和0.5 g 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）钠盐溶于双蒸水中，定容至1 L，混匀后用KOH调节pH至5.8。将溶液转移至1 L瓶中，加入8 g植物琼脂（0.8%），进行高压灭菌。
- 配制1 L植物生长培养基：将2.2 g MS粉末、5 g蔗糖（0.5%）和0.5 g MES盐溶于双蒸水中，定容至1 L，混匀后用KOH调节pH至5.8。将溶液转移至1 L瓶中，加入8 g植物琼脂（0.8%），进行高压灭菌。
- 配制1 L毛状根生长培养基：将4.4 g MS + B5维生素粉末、30 g蔗糖（3%）和0.5 g MES盐溶于双蒸水中，定容至1 L，混匀后用KOH调节pH至5.8，转移至1 L瓶中。加入3 g凝胶剂（0.3%），进行高压灭菌。灭菌后加入头孢噻肟和羧苄青霉素二钠，使其终浓度分别为100–200 mg/L和100–500 mg/L。必要时加入适当的抗生素（抗性由双元载体的T-DNA提供）。
- 配制1 L复合植株生长培养基：将2.2 g MS + B5维生素粉末、10 g蔗糖（1%）和0.5 g MES盐溶于双蒸水中，定容至1 L，混匀后用KOH调节pH至5.8，转移至1 L瓶中。加入6 g凝胶剂（0.6%），进行高压灭菌。灭菌后加入头孢噻肟和羧苄青霉素二钠，使其终浓度分别为200 mg/L和500 mg/L。必要时加入适当的抗生素（抗性由双元载体的T-DNA提供）。
- 配制1 L再生培养基：将4.4 g MS + B5维生素粉末、30 g蔗糖（3%）和0.5 g MES盐溶于双蒸水中，定容至1 L，混匀后用KOH调节pH至5.8。将溶液转移至1 L瓶中，加入3 g凝胶剂（0.3%），进行高压灭菌。灭菌后加入NAA和BAP，使其终浓度分别为8 mg/L和5 mg/L，同时加入羧苄青霉素二钠至终浓度100 mg/L。
- 配制1 L芽伸长培养基：将4.4 g MS + B5维生素粉末、20 g蔗糖（2%）和0.5 g MES盐溶于双蒸水中，定容至1 L，混匀后用KOH调节pH至5.8。将溶液转移至1 L瓶中，加入3 g植物琼脂（0.3%），进行高压灭菌。灭菌后加入BAP和GA3，使其终浓度分别为0.5 mg/L和0.03 mg/L，同时加入头孢噻肟至终浓度100 mg/L。
- 配制1 L根诱导培养基：将2.2 g MS + B5维生素粉末、10 g蔗糖（1%）和0.5 g MES盐溶于双蒸水中，定容至1 L，混匀后用KOH调节pH至5.8。将溶液转移至1 L瓶中，加入3 g凝胶剂（0.3%），进行高压灭菌。灭菌后加入IBA和头孢噻肟，使其终浓度分别为0.5 mg/L和100 mg/L。
- 配制1 L CTAB缓冲液：加入20 g CTAB（终浓度2% w/v）、100 mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0，终浓度100 mM）、40 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0，终浓度20 mM）、81.8 g NaCl（终浓度1.4 M）和5 g PVP40（终浓度0.5% w/v），用双蒸水定容至1 L。对溶液进行高压灭菌，室温下可保存长达1年。
2. 用双元载体转化 Agrobacterium
- 准备含有待整合到植物基因组中的T-DNA盒的已验证双元质粒的DNA。确保质粒DNA含有低盐浓度，以避免因使用电穿孔而产生电火花。建议使用任意一种质粒DNA提取试剂盒。
- 通过将8 mL新鲜过夜培养物接种至200 mL预热（28 °C）的YEB液体培养基中，制备含有毛根诱导质粒pRiA4b的电转化感受态Agrobacterium tumefaciens C58C1细胞。在28 °C下振荡培养，直至600 nm处的光密度（OD600）约为0.5，即达到对数中期，大约需要4–5小时。
- 将Agrobacterium培养物分装至四个预先冰冻的无菌50 mL离心管中。在4 °C下以3,200 × g离心15分钟。
注意：从该步骤起应始终保持细胞处于低温状态。 - 弃去上清液，将沉淀物轻轻重悬于（4×）2.5 mL冷（4 °C）10%甘油中。再加入47.5 mL冷10%甘油并轻轻混匀。
- 在4 °C下以3,200 × g离心15分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于（4×）10 mL冷10%甘油中。
- 再次离心收集细胞，并将其重悬于（4×）0.75 mL冷10%甘油中。将四个离心管中的所有内容合并至一个管中（总体积 = 3 mL）。
- 将农杆菌溶液分装至预冷的无菌1.5 mL微量离心管中，每管50 μL。在干冰或液氮上速冻，并于-80 °C保存以备后续使用。
- 取一管感受态细胞（50 μL）置于冰上，加入5 μL质粒DNA（总量1 μg，来自步骤2.1），混匀后转移至电穿孔杯（0.2 cm间隙），并在冰上孵育5分钟。
- 将电穿孔杯放入电穿孔仪中，采用以下参数进行电穿孔：电容25 µFD，电阻400 Ω，电压2.5 kV，脉冲持续时间9.7 ms。
- 向细胞中加入950 µL LB液体培养基，随后在恒温混匀仪中于28 °C、300 rpm条件下培养2小时。取50 µL菌液涂布于含适当选择性抗生素的固体LB培养基上，在28 °C下培养2天。
注意：建议每块平板涂布不同体积的菌液（10 µL–100 µL），以确定合适的接种量并防止细菌过度生长。 - 从若干挑选出的单菌落制备5 mL含抗生素的LB液体培养物，于28 °C振荡过夜培养。取0.5 mL菌液与0.5 mL 40%甘油混合，制备甘油保存菌种。
注意：通过菌落PCR验证这些菌落是否含有目的转基因。具体操作为：取少量平板上的菌落加入PCR预混液（包含缓冲液、dNTP和所选Taq DNA聚合酶）中，并使用可扩增双元载体中T-DNA部分片段的引物进行扩增。后续植物转化实验中所用的接种物即来自上述甘油保存菌种。
3. 毛状根转化 Brassica napus DH12075
- 将甘蓝型油菜（Brassica napus）DH12075 的种子放入微量离心管中，在超净工作台内进行表面灭菌。首先加入水和0.1%洗涤剂，振荡60秒以去除种子表面油脂。随后分别用清水和70%乙醇各冲洗60秒。
- 使用含次氯酸钠的商用漂白剂配制成10%的溶液对种子进行灭菌，将种子在此溶液中振荡处理20分钟。
- 用无菌水清洗种子4次，每次60秒。将种子置于含有种子萌发培养基的培养皿中。于4 °C条件下低温春化过夜，然后将培养皿转移至培养室（21 °C，16小时光照/8小时黑暗）。
- 将5日龄的幼苗转移至含有植物生长培养基的植物培养盒中。
注：在DH12075中，18日龄幼苗的转化效率最高。可根据本地生长条件或其他品种对幼苗年龄进行优化。 - 用接种环接种携带毛根诱导质粒pRiA4b及用于转化的双元载体（来自步骤2.11）的农杆菌Agrobacterium tumefaciens C58C1液体培养物，使用5 mL LB培养基。在28 °C下过夜培养至OD600 = 0.9 - 1.0。
注：若仅需产生野生型毛根，则使用仅含Ri质粒的农杆菌。 - 使用胰岛素注射器将少量菌液（约50 µL）注入18日龄幼苗（来自步骤3.4）的下胚轴中。用安装在注射器上的26G针头在培养基表面以上约1 cm处刺穿下胚轴，并将菌液注入伤口。也可用注射器刮伤下胚轴表面组织。
注：接种的幼苗数量应根据实验者的需求进行调整。 - 将植株放回21 °C的培养室中培养2至4周，直至伤口部位形成愈伤组织并长出毛根。
- 切下带有新生毛根的愈伤组织，转移至含有毛根生长培养基的培养皿中，该培养基需添加选择性抗生素（由T-DNA携带）以及用于抑制农杆菌生长的头孢噻肟（200 mg/L）和替卡西林（500 mg/L）。用透气封口膜密封培养皿，在24 °C避光条件下培养毛根。
注：用于功能筛选的特定抗生素的合适浓度需通过野生型毛根进行预实验测试。对于携带卡那霉素抗性基因的B. napus DH12075毛根，使用25 mg/L卡那霉素。
注：在此步骤中，可构建嵌合植株，即保留野生型地上部分，同时利用转基因毛根支持植株生长。操作时无需切除毛根，而是去除植株原有的根系，将长出毛根的植株转移至含有复合植株生长培养基的植物培养盒中，该培养基包含头孢噻肟（200 mg/L）、替卡西林（500 mg/L）以抑制农杆菌生长，以及T-DNA携带的选择性抗生素。 - 1至2周后，将培养皿中毛根与愈伤组织分离，并在相同培养基的平板上进行单根培养。每4至5周将培养物转移至新鲜培养基平板。添加0.25 mg/L IBA以促进根系分支。
- 每次传代时逐步降低头孢噻肟和替卡西林的浓度，每次减少100 mg/L（例如，第一次传代使用含100 mg/L头孢噻肟和400 mg/L替卡西林的培养基；第二次传代使用300 mg/L替卡西林，依此类推）。经过3至4个月后，将毛根培养于含100 mg/L替卡西林及选择性抗生素的毛根生长培养基中。
4. 再生 Brassica napus DH12075 毛状根
- 使用使用前经火焰灭菌的镊子，在无菌条件下将独立的毛状根系转移至含有再生培养基的培养皿中。每皿转移 5 - 10 根毛状根，并在 21 °C、长日照光周期（16 小时光照 / 8 小时黑暗）条件下培养。用透气封口膜密封培养皿。
- 每隔 3 至 4 周，将毛状根转移至含新鲜再生培养基的培养皿中。注意愈伤组织约在 2 周后形成，愈伤组织形成后再经 2 周开始出芽，至 8 - 9 周时芽体发育明显。
- 将芽体分离，并转移至含芽伸长培养基的植物培养盒中，培养 2 至 3 周，以促进芽的伸长。
- 将伸长后的芽转移至含根诱导培养基的植物培养盒中。每隔 3 - 4 周更换一次培养基。DH12075 品系在 30 天时生根效率为 87%，60 天后可达 100%。
- 将已生根的植株移栽至土壤前，需彻底去除凝胶剂残留，以防真菌感染。确保植株先在植物生长室（21 °C，长日照光周期，150 µE）中进行驯化，然后转移 至温室中进行开花培养（21 °C / 18 °C，长日照光周期，150 µE）。
5. 再生植株与T1代植株筛选
注意：在进入再生过程之前，可对毛状根系进行筛选。筛选类型取决于转基因所携带的内容。可取毛状根样品进行DNA提取及基因分型或突变检测，或进行RNA提取及后续cDNA合成和目的基因表达水平分析的RT-qPCR，或用于荧光检测的显微观察，或进行GUS染色处理。
- 移栽至土壤后，需再次对 T0 再生植株（以及 T1 幼苗）进行基因型鉴定，以避免筛选过程中出现逃逸个体。T0 植株表现出一种称为 Ri 表型的改变表型：由于 Ri 质粒的 TL 和/或 TR-DNA 插入植物基因组，导致根系过度生长、叶片卷曲以及茎秆矮化。
- 为加快 T1 代筛选，可从 T0 再生植株中选取含有成熟绿色胚的种子（对于 DH12075 品系，授粉后约 21–28 天，获得鱼雷形或更晚期胚）进行胚拯救。
- 在无菌操作台中操作。采集角果并用 70% 乙醇进行表面消毒。
- 将角果置于固定在培养皿盖或载玻片上的双面胶带上。
- 使用体视显微镜，用 26G 针头沿果瓣边缘切开角果。注意切割时不要损伤种子。为便于操作，可将针头安装在 1 mL 注射器上。
- 打开子房并将之粘附于胶带上。取出未成熟种子并转移至种子萌发培养基平板中。用透气封口膜密封平板。
- 将平板置于培养室（21 °C，16 小时光照 / 8 小时黑暗）中，直至种子萌发。
- 对 T1 幼苗进行目标转基因以及 Ri TR/TL 缺失的基因型鉴定（图 1）。采集叶片材料，并选用合适方法提取 DNA。此处描述 CTAB 法：
- 将叶片材料放入含有两个陶瓷珠的 2 mL 微量离心管中。将管子在液氮中冷冻。
- 使用球磨仪研磨样品。也可使用研钵和研杵替代。
- 短暂离心后，向粉末中加入 400 µL CTAB 缓冲液。短暂涡旋混匀，离心，然后在 60 °C 下孵育至少 50 分钟。
- 将溶液冷却至室温 15 分钟。加入等体积氯仿，轻轻混匀。
注意：使用氯仿时应在通风橱内操作，并佩戴手套进行防护。含氯仿的溶液应弃置于指定废液容器中。 - 使用台式离心机在 18,400 x g 下离心 5 分钟。吸取 250–350 µL 上层水相转移至新的微量离心管中，避免吸取中间相。
- 加入等体积异丙醇，充分混匀，室温孵育 5 分钟。在 18,400 x g 下离心 40 分钟。
- 弃去上清液，加入 200 µL 70% 乙醇。洗涤沉淀物后在 18,400 x g 下离心 15 分钟。
- 弃去上清液。将沉淀物空气干燥后加入 50–100 µL 超纯水。将 DNA 在冰箱中溶解 1 小时至过夜。
- 通过 PCR 对 rolA 基因（TL）、aux1 基因（TR）以及 virC 位点（Agrobacterium）进行基因型分析。根据制造商说明书，使用上述提取的 DNA（步骤 5.3 所得）、引物、缓冲液、dNTP 和 Taq 聚合酶配制 PCR 反应体系。扩增片段长度为 200–500 bp。
rolA 特异性引物：
正向引物：GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG
反向引物：TGCGTATTAATCCCGTAGGTC
aux1 特异性引物：
正向引物：CATAGGATCGCCTCACAGGT
反向引物：CGTTGCTTGATGTCAGGAGA
virC 特异性引物：
正向引物：AATGCGTCTCTCTCGTGCAT
反向引物：AAACCGACCACTAACGCGAT
注意：T-DNA 的转移与整合可能是不完整的，仅部分 TL 和/或 TR 序列可能整合进基因组。因此，建议在 T1 幼苗中进一步检测 TL 的其他开放阅读框（如 rolB 和 rolC）以及 TR 区域（aux2、mas1、ags1）的存在情况。这些位点的特异性引物序列见 Jedličková 等人9。 - 通过凝胶电泳分析 PCR 反应结果。
注意：建议在此分析中设置阳性对照，以确保所提取 DNA 符合 PCR 级别要求。 - 根据该转基因的具体内容及相关实验方案，筛选出含有（或不含有）目标转基因的个体。
- 将筛选后的幼苗移栽至土壤中。
6. 毛状根转化与再生 拟南芥 Col-0
- 使用选择的方法（次氯酸钠、乙醇或氯气）对A. thaliana种子进行表面灭菌。
- 将无菌种子接种于种子萌发培养基上。经过2天的低温层积处理后，将培养皿转移至培养室（21 °C，长日照光周期，50%湿度）。
- 将1周龄的幼苗转移至含有植物生长培养基的植物培养 盒中。
- 按照步骤3.5所述方法制备Agrobacterium菌液。
- 使用安装在胰岛素注射器上的针头，将少量菌液（约50 µL）注射到1个月大的Arabidopsis植株主花序茎基部（距莲座叶约1 - 2 cm处）。也可用注射器针头轻轻刮擦主茎表面组织。
- 注射后2-4周，切下长出的毛状根，并将其接种于添加选择性抗生素（由T-DNA携带）、头孢噻肟（200 mg/L）和替卡西林（500 mg/L）的毛状根生长培养基的培养皿中，以抑制农杆菌生长。将培养皿置于24 °C黑暗条件下培养。
- 1 - 2周后，将毛状根分离并接种至相同培养基的培养皿中。每4 - 5周将筛选出的毛状根系转移至新鲜培养基。
注意：A. thaliana的毛状根比B. napus的更细，在转移至新鲜培养基时需格外小心。 - 将毛状根转移至含有再生培养基的培养皿中，以诱导愈伤组织形成。在21 °C、长日照光周期（16小时光照/8小时黑暗）条件下培养。
- 培养18 - 21天后，愈伤组织上开始出现芽点。切下芽点并转移至芽伸长培养基中培养2 - 3周，以促进生长和伸长。
- 将伸长后的芽转移至生根诱导培养基中。
- 将生根的植株移栽至土壤中。T0代植株也表现出Ri表型。按照B. napus DH12075（步骤5）所述方法进行转基因筛选。
结果
我们先前已优化了三种油菜（Brassica napus）品种（DH12075、Topas DH4079 和 Westar9）的基于注射法的毛根诱导方案。为了将该转化方法应用于模式物种 A. thaliana，我们对1个月大幼苗的主花序茎进行了农杆菌菌液注射。注射部位在2至4周后长出毛根。将毛根切下并接种于固体培养基上进行培养。这两种物种间方法的比较见图1。
选择的毛状根系被转移到再生培养基以诱导芽的形成。在A. thaliana中，所有10个测试的毛状根系均在14天内诱导出黄色愈伤组织。转移至再生培养基后3周内，可见作为深绿色斑点出现的首个芽原基（图2）。培养4周后，10个毛状根系中的9个（90%再生效率）的毛状根表面已覆盖芽体。在某些情况下，愈伤组织上会诱导出不定根（图2H）。有一条毛状根系即使在再生培养基上培养3个月（每4周将毛状根转移至新鲜培养基）也未能再生。因此，A. thaliana毛状根的再生效率与B. napus DH120759的效率相似。
B. napus 和 A. thaliana 的毛状根再生植株表现出矮化表型（图3），这是毛状根来源植株的典型特征2。我们还观察到根系发达、叶片皱缩以及开花时间改变等现象。这种所谓的毛状根（或Ri）表型是由Ri质粒中的rol基因插入植物基因组所引起的。Ri T-DNA与二元载体上编码的外源基因的插入可能是独立的或连锁的。因此，通过自交产生的T1代后代的分离分析有助于鉴定出不含rol基因但表达目标外源基因的植株。对T1植株的基因分型采用特异性扩增TL和TR区开放阅读框（ORF）以及目标外源基因的PCR引物进行。农杆菌污染的存在与否通过检测virC引物是否产生PCR产物来确认（图1）。
图1：该实验步骤的概述 A. thaliana 和 B. napus. 注射 农杆菌 在下胚轴或初生花序茎中接种菌液可诱导毛状根的形成。毛状根可替代植株原有根系，生成嵌合植株，用于基因型鉴定与分析（蓝色箭头）。培养获得的毛状根可再生为T0代植株，在T1代植株中扩繁并进行基因型鉴定（绿色箭头）。毛状根也可进行继代培养，用于功能分析（黑色箭头）。文中展示了基因型鉴定结果的示例。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2：A. thaliana 中毛状根的再生。（A）毛状根培养物转移至培养板后第1天。（B, C）在再生培养基上培养2周内形成的愈伤组织。（D, E）培养3周后出现的茎尖分生组织。（G, H）培养4周后形成的茎。（H）从愈伤组织发育出的不定根。（C, F, I）未发生再生的毛状根系。比例尺为1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：B. napus 和 A. thaliana 野生型植株及发根农杆菌诱导的毛状根来源再生植株（T0代植株）的代表性照片。 注意再生植株表现出的Ri表型。比例尺为2 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
我们建立了一种简单的方法，用于甘蓝型油菜（B. napus）和拟南芥（A. thaliana）的毛状根转化及后续再生。该过程包括通过注射法在下胚轴（B. napus）或主花序茎（A. thaliana）诱导产生毛状根。将携带Ri质粒的农杆菌菌株C58C1注射至下胚轴的方法，在本研究涉及的十字花科植物之外，对豆科（Fabaceae）植物也同样有效10,11。
一种替代注射法的方法是浸润法转化，即外植体浸入细菌悬浮液中，随后与农杆菌共培养。与浸润法相比，注射法的优势在于省去了部分实验步骤所需的时间：外植体准备、共培养时间的测试，以及在含激素培养基上诱导毛状根的培养过程。尽管这两种方法均可有效诱导毛状根，但在某些物种中，注射法的转化效率高于外植体浸润法12,13。此外，基于注射的转化方法还可用于生成复合植株（即转基因毛状根与野生型 shoots）。在切除转化植株的原有根系后，毛状根能够支持植株生长，从而可在完整植株背景下研究外源基因的功能。
诱导毛状根的关键步骤是将接种物注入下胚轴或主花序茎中。B. napus 的下胚轴易折断，操作时可能容易切断整个下胚轴。A. thaliana 也存在类似情况，因其花序茎较细。如果需要比较不同物种或品种的转化效率，我们建议由同一个人完成所有实验，以避免因操作手法和注射技术差异带来的误差。
我们建立了一种在 B. napus DH12075 和 A. thaliana Col-0 中高效诱导毛状根再生的实验方案。由于再生过程具有高度变异性，可根据具体物种或品种对方案进行适当调整。例如，在 B. oleracea14 中，可通过不同的生长素/细胞分裂素比例（1:1）诱导毛状根产生不定芽。此外，也可使用细胞分裂素噻二唑苯基脲（thidiazuron）替代BAP，如在 B. campestris 毛状根再生中所应用的那样15。
在毛状根转化与再生系统中，Ri 质粒T-DNA多次插入植物基因组可能构成一个潜在限制。在这种情况下，通过对T1代幼苗进行分离分析，无法获得不含Ri质粒TL/TR序列的植株。因此，我们建议针对每个转基因构建多个独立的毛状根株系。
毛状根培养是基因功能研究中极为强大的工具，主要因其建立迅速且维护成本低廉（培养基中无需添加激素）。本方案涵盖了在 B. napus 和 A. thaliana 中诱导和再生毛状根的方法，可用于在毛状根培养体系中直接研究目的转基因，或利用复合植株在完整植株背景下进行研究，也可在转基因植株再生后开展相关分析。
披露
作者声明，本研究的开展不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系。
致谢
感谢捷克共和国捷克布杰约维采生物学中心 CAS 的 Jiří Macas 提供农杆菌菌株。感谢 CEITEC MU 植物科学核心设施提供的技术支持。本工作由捷克共和国教育、青年和体育部通过欧洲区域发展基金项目"SINGING PLANT"（编号 CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446）以及 INTER-COST 项目 LTC20004 资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.50 mL 离心管 | Eppendorf | 125.215 | |
| 10% 商业漂白剂溶液 | SAVO | ||
| 1-萘乙酸（NAA） | Duchefa | N0903 | 愈伤组织再生培养基 |
| 2.0 mL 离心管 | Eppendorf | 108.132/108.078 | |
| 3M 微孔胶带 | Micropore | ||
| 6-苄氨基嘌呤（BAP） | Duchefa | B0904 | 愈伤组织再生培养基，茎伸长培养基 |
| 70% 乙醇 | |||
| 细菌学琼脂 | HiMedia | RM201 | LB 培养基 |
| 细菌蛋白胨 | Oxoid | LP0037 | LB 和 YEB 培养基 |
| 牛肉浸膏 | Roth | X975.1 | YEB 培养基 |
| 玻璃瓶 | DURAN | L300025 | |
| 头孢噻肟钠 | Duchefa | C0111 | 毛状根生长培养基、愈伤组织再生培养基、茎伸长培养基、生根诱导培养基 |
| 氯仿 | Serva | 3955301 | |
| CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 | Sigma | 52365 | |
| dNTP 混合液 | Thermo Fisher Scientific | R0193 | |
| EDTA - 滴定灵 III，乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 | Sigma | ES134-250G | |
| 电穿孔比色皿 | |||
| 电泳琼脂，peqGOLD 通用型 | VWR | 732-2789 | |
| 电泳槽 | BIO-RAD | ||
| 电泳凝胶成像仪 | BIO-RAD | ||
| 电穿孔仪 GenePulser Xcell | BIO-RAD | ||
| 溴化乙锭 | AppliChem | ||
| Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔比色皿，0.2 cm 间隙 | BIO-RAD | 1652082 | |
| Gene Ruler DNA 标准分子量标记混合物 | Thermo Fisher Scientific | SM0331 | |
| 赤霉素（GA3） | Duchefa | G0907 | 茎伸长培养基 |
| 甘油 | Sigma | G5516-1L | |
| HEPES（2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)乙磺酸） | Merck | 1101100250 | |
| 吲哚-3-丁酸（IBA） | Duchefa | I0902 | 生根诱导培养基 |
| 硫酸卡那霉素 | Duchefa | K0126 | |
| Magenta GA-7 植物培养盒（带盖） | Plant Media | V8505-100 | |
| 量筒 | |||
| MES 一水合物 | Duchefa | M1503 | 毛状根生长培养基、愈伤组织再生培养基、茎伸长培养基、生根诱导培养基、萌发培养基、植物生长培养基 |
| MS 培养基（Murashige 和 Skoog 培养基） | Duchefa | M0237 | 萌发培养基、植物生长培养基 |
| MS 培养基（Murashige 和 Skoog 培养基）+ B5 维生素 | Duchefa | M0231 | 毛状根生长培养基、愈伤组织再生培养基、茎伸长培养基、生根诱导培养基 |
| 针头 Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13 mm | Terumo | ||
| pH 计 | |||
| Phytagel | Sigma | P8169 | 愈伤组织再生培养基、生根诱导培养基、萌发培养基 |
| PVP 40（聚乙烯吡咯烷酮，分子量 40000） | Sigma | 9003-39-8 | |
| Redtaq DNA 聚合酶，含惰性染料的常规 PCR 用 Taq 酶，包含 10X 缓冲液 | Sigma | D4309-250UN | |
| Retsch 研磨仪 | Qiagen | ||
| 氯化钠 | Lachner | 30093-APO | LB 培养基 |
| 方形培养皿 | Corning | GOSSBP124-05 | |
| 蔗糖 | Penta | 24970-31000 | 毛状根生长培养基、愈伤组织再生培养基、茎伸长培养基、生根诱导培养基、萌发培养基、植物生长培养基 |
| 注射器滤器 | Carl Roth | P666.1 | Rotylabo 注射器滤器，孔径 0.22 µm |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf | ||
| 羧苄西林二钠 | Duchefa | T0180 | 毛状根生长培养基 |
| 三羟甲基氨基甲烷（Tris） | Serva | 3719003 | |
| 超纯水 | Millipore Milli-Q 纯化水 | ||
| 酵母提取物 | Duchefa | Y1333 | LB 培养基 |
参考文献
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