本文的重点是详细介绍从环境中获得的难养厌氧微生物培养基制备的最佳实践。这些方法有助于厌氧菌培养的管理，并可用于支持难以培养的未培养微生物——即“微生物暗物质”的生长。
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本文内容
摘要
摘要
厌氧微生物的依赖培养研究依赖于方法学上的专业能力。这些方法必须为厌氧微生物创造并维持适宜的生长条件（如pH值和碳源），同时允许在不破坏人工环境的前提下提取样品。为此，需采用基于并模拟自然环境的 原位 环境对于培养来自该环境的微生物具有重要帮助。在此，我们概述了一种 原位 一种改进的模拟厌氧方法，用于培养陆地表层及地下微生物，强调以最小扰动方式进行厌氧样品采集。本方案详细介绍了可定制厌氧液体培养基的制备方法以及环境条件的控制 获取与 体外 厌氧微生物的生长。该方案还涵盖了用于模拟沉积物环境和获取环境来源的厌氧液体培养物的厌氧生物反应器的关键组成部分。我们提供了在生物反应器运行周期内维持的微生物组的初步高通量测序数据，其中活性培养物会动态调整以响应实验性碳源。
引言
大多数微生物尚未被培养成功，这一点可通过显微镜下观察到的细胞数量与使用琼脂平板成功培养的微生物数量之间存在的巨大差异得到证实。斯塔利（Staley）和科诺普卡（Konopka）将这一差异称为“"大平板计数异常"1”。宏基因组学和宏转录组学数据显示，在来自多种不同环境的等级丰度曲线中存在大量新颖的属，进一步支持了尚未被计入的微生物多样性。2 那些已被观测到（通常通过对微生物群落进行随机鸟枪法测序）但尚未被培养的微生物，被称为“"微生物暗物质"3,4”。
在组学时代，培养微生物对于全面评估基因组数据以及验证所含基因的功能/表型仍然至关重要。在宏基因组鸟枪法测序和环境样本中宏基因组组装基因组等技术尚未达到足够可靠的准确性之前，对培养获得的微生物进行测序仍是获得完整基因组的唯一可靠途径。5基因组评估与培养的微生物相结合，为理解提供了有力推断 "微生物暗物质" 许多属于该家族的成员 "微生物暗物质" 发挥关键功能，影响营养物质及其他元素的循环以及有价值天然产物的生成，支持生态系统并提供生态服务。从医学角度来看，目前上市药物....
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方案
1. 可定制厌氧液体培养基的制备
- 培养瓶培养基（配制500 mL）
- 量取并加入化合物至1 L瓶中，根据读者所培养的菌种，参照表1中的对应列调节pH值（表1中的用量为配制1,000 mL的量，需相应调整）。通过轻轻旋转瓶子使化合物充分混匀。
- 将瓶子放入微波炉加热至沸腾，约5–6分钟。加热过程中需频繁打开微波炉，使用耐热手套轻轻旋转液体。若液体在冒泡后突然静止，应立即打开微波炉；否则液体可能迅速膨胀并溢出瓶外。
- 将一支无菌的10 mL玻璃移液管连接至N2气体歧管装置（参考Balch等人的设计11，但无需为高纯度N2气体配备加热铜柱；更多气体歧管信息见补充文件1）。打开歧管以排出O2，使N2气体持续流出。
- 将移液管尖端插入液体中，调节气体流速，使气泡产生适中。用N2气体冲洗液体，直至瓶壁不再烫手。
注：所需时间取决于培养基成分，通常约需20分钟。 - 在等待瓶子冷却期间，准备好10个无菌的100 mL培养瓶；若用于制备土壤混合培养物的培养基，则准备两个无菌的500 mL培养瓶。
- 当....
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结果
本文展示了利用钻孔混合培养基制备方法和所述生物反应器装置进行生物反应器研究的结果。钻孔混合培养基经改良后，以经氧化水热溶解（Oxidative Hydrothermal Dissolution, OHD）处理的玉米芯浆液作为碳源13,14。改良后的钻孔混合培养基以0.4 mL/min的流速持续泵入生物反应器，共运行44天。在第23天，接种物来自美国内华达州死亡谷地区的钻孔BLM-115。分别在第1、8、15、22、23（接种后）、30、37和44天从生物反应器中采集液体样品，收集至取样收集瓶中。
为了监测接种物培养物的总体状态（以及生物反应器沉积物中经高压灭菌后仍存活的微生物），通过直接细胞计数法观察生物反应器液体样品。样品液体的直接细胞计数使用Petroff-Hauser血细胞计数板完成。为了确定生物反应器中微生物成员的种类，从生物反应器液体样品中提取DNA，并通过高通量测序（NGS）分析16S rRNA基因。NGS.......
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讨论
本实验方案的培养基制备部分（第1节）在结构上借鉴了Miller和Wolin改良的Hungate技术17，自发表以来已被广泛使用。该扩展方案的实用性源于其描述性特点以及与之配套的 原位 微生物的获取。已使用含有环境信息指导配制的模拟培养基的培养瓶，成功培养出以下微生物 原位-获得的前任成员 "微生物暗物质"：厌氧地下细菌 Thermoanaerosceptrum fracticalcis 菌株 DRI1318, Caldiatribacterium inferamans 菌株SIUC1（登录号MT023787；论文在准备中），以及 Anaerothermus hephaesti 菌株SIUC3（登录号MK618647；论文在准备中），以及未表征的地下厌氧细菌菌株DRI14（登录号KR708540）。
本方案的一个重点在于其高度可适应于各种地表和地下厌氧环境及微生物。首先，建议调整培养基.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者谨此感谢多年来影响并推动这些技术发展与演进的知识传承与指导。Hamilton-Brehm 博士作为一名前研究生、博士后及现任教授，衷心感谢那些曾花费时间教授厌氧技术的学者：Mike Adams 博士、Gerti Schut 博士、Jim Elkins 博士、Mircea Podar 博士、Duane Moser 博士以及 Brian Hedlund 博士。本研究工作分别获得了大自然保护协会（The Nature Conservancy）和美国河流组织（American Rivers）通过资助项目 G21-026-CON-P 和 AR-CE21GOS373 的支持。本文所表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者个人观点，不一定代表大自然保护协会或美国河流组织的立场。本研究还得到了南伊利诺伊大学先进能源研究所（SIU Advanced Energy Institute）资助项目的支持，该研究所衷心感谢先进能源资源委员会（Advanced Energy Resource Board）提供的资金支持。NGS 测序由 LC Sciences 完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 通用材料 | |||
| 1 L 硼硅酸盐玻璃瓶 | Fisher Scientific | ||
| 1 mL 带滑动接头的注射器 | Fisher Scientific | ||
| 10 mL 玻璃移液管 | Fisher Scientific | ||
| 100 mL 培养瓶 | Fisher Scientific | ||
| 20 mm 手动压接钳 | Fisher Scientific | ||
| 23 G 针头 | Fisher Scientific | ||
| 500 mL 硼硅酸盐玻璃瓶 | Fisher Scientific | ||
| 铝制密封盖 | Fisher Scientific | ||
| 导管，31.5 cm 长度 | Fisher Scientific | ||
| 导管，6 cm 长度 | Fisher Scientific | ||
| 取芯器 | Giddings Machine Company | 由公司部件组装而成 | |
| 气体歧管 | Swagelok | 由多个不同部件组装而成 | |
| 打火机 | Lowe's | ||
| N2 气体 | Airgas | ||
| 腈类手套 | Fisher Scientific | ||
| 橡胶塞（用于 GL45 瓶） | Glasgeratebau OCHS | ||
| 橡胶塞（用于培养瓶） | Ace Glass | ||
| 搅拌加热板 | Corning | ||
| 微量元素 | ATCC | ||
| 维生素 | ATCC | ||
| 生物反应器专用材料 | |||
| #10 橡胶塞 | Ace Glass | ||
| #7 橡胶塞 | Fisher Scientific | ||
| 1 mL 带鲁尔锁接头的注射器 | Fisher Scientific | ||
| 1/4" 软管接头球阀 | Amazon | ||
| 10 mL 带鲁尔锁接头的注射器 | Fisher Scientific | ||
| 3.5 L 硼硅酸盐玻璃瓶 | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" 软管接头转换接头 | Amazon | ||
| 60 mL 带鲁尔锁接头的注射器 | Fisher Scientific | ||
| 8 L 硼硅酸盐玻璃大瓶 | Allen Glass | ||
| GL14 开口顶盖用弯头软管连接器 | Ace Glass | 7623-20 | |
| 气球 | Party City | ||
| 硼硅酸盐玻璃生物反应器 | Allen Scientific Glass | 按需定制 | |
| 电钻 | Lowe's | ||
| 鲁尔锁母接头耦合器 | Amazon | ||
| GL14 开口顶盖 | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 开口顶盖 | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 开口顶盖 | Ace Glass | ||
| GL14 开口顶盖用聚四氟乙烯包覆硅胶隔垫 | Ace Glass | 7625-06 | |
| GL18 开口顶盖用聚四氟乙烯包覆硅胶隔垫 | Ace Glass | 7625-07 | |
| 铁架台 | Fisher Scientific | ||
| 铁架台链条夹 | Amazon | ||
| 铁架台夹 | Fisher Scientific | ||
| 硅胶管；内径 1/4"，外径 1/2" | Grainger | 55YG13 | |
| 硅胶管；内径 3/16"，外径 3/8" | Grainger | ||
| GL14 开口顶盖用直型软管连接器 | Ace Glass | 7623-22 | |
| 三通旋塞阀 | Amazon | ||
| 二通旋塞阀 | Amazon | ||
| 超低流量可调微型泵 | VWR | ||
| 水浴锅 | Fisher Scientific | ||
| 白色橡胶隔垫（适用于外径 13–18 mm 的管） | Ace Glass | 9096-49 | |
| 金属丝 | Lowe's | ||
| 扎带 | Lowe's |
参考文献
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L.
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重印与许可
