一套 原位 用于培养环境来源厌氧微生物的知情模拟培养基格式

摘要

本文的重点是详细介绍从环境中获得的难养厌氧微生物培养基制备的最佳实践。这些方法有助于厌氧菌培养的管理，并可用于支持难以培养的未培养微生物——即“微生物暗物质”的生长。

摘要

厌氧微生物的依赖培养研究依赖于方法学上的专业能力。这些方法必须为厌氧微生物创造并维持适宜的生长条件（如pH值和碳源），同时允许在不破坏人工环境的前提下提取样品。为此，需采用基于并模拟自然环境的 原位 环境对于培养来自该环境的微生物具有重要帮助。在此，我们概述了一种 原位 一种改进的模拟厌氧方法，用于培养陆地表层及地下微生物，强调以最小扰动方式进行厌氧样品采集。本方案详细介绍了可定制厌氧液体培养基的制备方法以及环境条件的控制 获取与 体外 厌氧微生物的生长。该方案还涵盖了用于模拟沉积物环境和获取环境来源的厌氧液体培养物的厌氧生物反应器的关键组成部分。我们提供了在生物反应器运行周期内维持的微生物组的初步高通量测序数据，其中活性培养物会动态调整以响应实验性碳源。

引言

大多数微生物尚未被培养成功，这一点可通过显微镜下观察到的细胞数量与使用琼脂平板成功培养的微生物数量之间存在的巨大差异得到证实。斯塔利（Staley）和科诺普卡（Konopka）将这一差异称为“"大平板计数异常"¹”。宏基因组学和宏转录组学数据显示，在来自多种不同环境的等级丰度曲线中存在大量新颖的属，进一步支持了尚未被计入的微生物多样性。² 那些已被观测到（通常通过对微生物群落进行随机鸟枪法测序）但尚未被培养的微生物，被称为“"微生物暗物质"^3,4”。

在组学时代，培养微生物对于全面评估基因组数据以及验证所含基因的功能/表型仍然至关重要。在宏基因组鸟枪法测序和环境样本中宏基因组组装基因组等技术尚未达到足够可靠的准确性之前，对培养获得的微生物进行测序仍是获得完整基因组的唯一可靠途径。⁵基因组评估与培养的微生物相结合，为理解提供了有力推断 "微生物暗物质" 许多属于该家族的成员 "微生物暗物质" 发挥关键功能，影响营养物质及其他元素的循环以及有价值天然产物的生成，支持生态系统并提供生态服务。从医学角度来看，目前上市药物中约有一半是细菌产生的化合物及其衍生物，而对未培养物种进行特征分析有望揭示未来的抗生素。为了获取这些尚未培养的微生物类群，必须改进多种培养方法⁶. 在该成员中 "微生物暗物质，" 厌氧寡营养微生物在很大程度上未被充分报道，可能具有生态学和工业上重要的生物化学途径⁷，使其成为培养的重要目标。然而，厌氧寡营养微生物比需氧和富营养微生物更难培养，通常需要更长的培养时间以及苛刻的培养条件（例如，特殊的非标准条件） 体外 温度）以及专用培养基配方的使用。

目前正在发展的培养拟杆菌门成员的技术 "微生物暗物质，" 包括新型厌氧寡营养微生物在内的研究极大地增进了我们对这些微生物的理解，并提高了它们在系统发育树中的代表性。目前利用理性设计培养基培养新型微生物的技术（即基于目标微生物相关知识设计的培养基）可分为三种 distinct 方法。第一种方法涉及直接从环境中移除一个独立的区段并转移至培养体系中 体外 已包含目标微生物的膜内生长室。离散区域（例如海水）的作用是为目标微生物提供其所需的地球化学生境 原位，而 膜可阻止细胞的穿膜移动（目标细胞将保留在膜内，随组织片段带入的无关细胞则被阻隔在膜外）。通过添加目标微生物在自然生境中可获取的化合物，可实现对这类微生物的培养。⁸第二种方法利用宏转录组学或宏基因组学来阐明代谢潜能，为优化培养条件以设计靶向培养基提供线索。该方法可提供生态生理学特征，用于针对性地富集特定类型的微生物。培养基的成分根据已鉴定出的、被认为可支持靶向微生物生长的基因进行定制，从而降低富集过程中的多样性。^9,10一个需要注意的问题是，基因组信息无法直接推断基因的表达情况，而转录组信息则可以。

第三种方法包括基于环境信息设计的模拟培养基，这与第一种方法不同，第一种方法不进行培养基的模拟，而是直接将环境本身作为培养基来源。第三种方法需要对含有目标微生物的野外地点的地球化学环境进行前期勘察。基于这些信息，确定主要成分和物理参数，以构建基于环境信息的模拟培养基。随后，将含有微生物的环境沉积物或液体直接注入该培养基中。当培养微生物的研究人员无法获得足量的原始环境样本（如第一种方法所需）或缺乏适当的宏转录组学或基因组学数据（如第二种方法所需）时，该方法尤为有价值。

以下方案是第三种方法的示例；该方法基于特定环境并旨在模拟感兴趣的环境条件。本方案中并列展示了三种针对从野外获得的不同厌氧微生物培养物的无菌培养基配方。所代表的三种培养物分别为来源于土壤的混合培养物（下文简称土壤混合培养物）、来源于钻孔内部的混合培养物（下文简称钻孔混合培养物），以及来源于钻孔内部的一种分离产甲烷菌（下文简称钻孔分离产甲烷菌）。此处提供的培养基配方中的化合物种类及用量仅作为初步参考指南；读者可根据自身研究的环境和目标微生物对其进行调整和优化。

方案

1. 可定制厌氧液体培养基的制备

1. 培养瓶培养基（配制500 mL）
   1. 量取并加入化合物至1 L瓶中，根据读者所培养的菌种，参照表1中的对应列调节pH值（表1中的用量为配制1,000 mL的量，需相应调整）。通过轻轻旋转瓶子使化合物充分混匀。
   2. 将瓶子放入微波炉加热至沸腾，约5–6分钟。加热过程中需频繁打开微波炉，使用耐热手套轻轻旋转液体。若液体在冒泡后突然静止，应立即打开微波炉；否则液体可能迅速膨胀并溢出瓶外。
   3. 将一支无菌的10 mL玻璃移液管连接至N₂气体歧管装置（参考Balch等人的设计¹¹，但无需为高纯度N₂气体配备加热铜柱；更多气体歧管信息见补充文件1）。打开歧管以排出O₂，使N₂气体持续流出。
   4. 将移液管尖端插入液体中，调节气体流速，使气泡产生适中。用N₂气体冲洗液体，直至瓶壁不再烫手。
      注：所需时间取决于培养基成分，通常约需20分钟。
   5. 在等待瓶子冷却期间，准备好10个无菌的100 mL培养瓶；若用于制备土壤混合培养物的培养基，则准备两个无菌的500 mL培养瓶。
   6. 当培养基瓶冷却至可触碰时，将移液管尖端移至瓶内顶空处。加入0.125 g NaHCO₃和0.300 g Na₂S∙9 H₂O，等待刃天青变为无色。
      警告：Na₂S∙9 H₂O具有腐蚀性、毒性并可引起刺激。操作时应佩戴个人防护装备，接触后需彻底冲洗金属工具。
   7. 在等待刃天青变色期间，将金属套管连接至气体歧管装置，并将套管尖端插入各培养瓶中。调节通入培养瓶的N₂气体流速至中等水平，以避免下一步加入液体时因气体流动导致液体晃动。
   8. 当刃天青完全褪色后，将50 mL液体分装至每个培养瓶中，或将250 mL液体分装至每个500 mL瓶中。
   9. 移除套管后，立即用相应尺寸的橡胶塞密封各瓶。使用铝制封盖（用于培养瓶）或GL45开口螺口盖（用于500 mL瓶）固定橡胶塞。
   10. 将瓶子放入可高压灭菌的容器中，并向容器内加入自来水，使水位与瓶内液面齐平。
       注：此举可防止灭菌过程中因玻璃受热不均产生应力而导致瓶子破裂。
   11. 在121 °C条件下高压灭菌30分钟。
2. 生物反应器培养基（配制8 L）
   1. 大瓶的准备
      1. 打开一个1/4"（6.4 mm）软管接头球阀的阀门。将两段长6 cm、内径1/4"（6.4 mm）、外径1/2"（12.7 mm）的硅胶管分别连接至该球阀的两端。
      2. 在组件一端连接一个5/16"-1/4"（7.9 mm-6.4 mm）软管接头转换接头，另一端连接至8 L大瓶的软管接头。
      3. 使用扎带固定大瓶软管接头与硅胶管之间的连接，以及转换接头与硅胶管之间的连接。
      4. 将带组件的大瓶在121 °C条件下高压灭菌30分钟。
   2. 培养基配制
      1. 关闭8 L大瓶组件上软管接头球阀的阀门。
      2. 量取并加入化合物至8 L大瓶中，根据读者所培养的菌种，参照表1中的对应列调节pH值（表1中的用量为配制1,000 mL的量，需相应调整）。加入搅拌子，使用加热磁力搅拌器将化合物充分混匀。
      3. 使用加热磁力搅拌器将液体加热至沸腾，并保持沸腾30分钟。
         注：加热至沸腾所需时间取决于培养基成分，通常需要2–3小时。
      4. 将一支无菌的10 mL玻璃移液管连接至N₂气体歧管装置（参考Balch等人的设计¹¹，但无需为高纯度N₂气体配备加热铜柱；更多气体歧管信息见补充文件1）。打开歧管以排出O₂，使N₂气体持续流出。
      5. 关闭加热，将移液管尖端插入液体中，调节气体流速，使气泡产生适中但不溢出。用N₂气体冲洗液体30分钟。
      6. 将移液管尖端移至大瓶顶空处。加入2.0 g NaHCO₃和4.8 g Na₂S∙9 H₂O，等待刃天青变为无色。
         警告：Na₂S∙9 H₂O具有腐蚀性、毒性并可引起刺激。操作时应佩戴个人防护装备，接触后需彻底冲洗金属工具。
      7. 当刃天青完全褪色后，移除玻璃移液管，并立即用#10橡胶塞密封大瓶。用金属丝缠绕橡胶塞并固定在大瓶瓶口，以确保密封牢固。

2. 原位 环境厌氧微生物的获取

1. 表面厌氧样品采集（混合土壤培养物）
   1. 将上述制备的混合土壤培养基瓶和土钻带入野外。
      注：作者使用 Giddings 2 5/8" 标准锥形土壤钻头（材料表）。然而，任何可钻取至目标深度的土壤钻头或铲子均可使用。
   2. 将钻头压入（或打入）沉积物中，直至样品采集管的顶部与沉积物表面齐平。
   3. 将钻头旋转90°以松动土芯，并向上拉出，直至将样品从环境中取出。
   4. 在松散的沉积物中（例如在湿地采样时可能遇到的情况），在提取过程中用一只新的丁腈手套覆盖土芯底部，以防止样品在取出时掉落或散入水中。
   5. 快速目测从土芯底部向上约6–7 cm处，用一只新的丁腈手套切入土芯，分离出底部6–7 cm的样品。
   6. 立即将土芯底部转移至培养瓶中。若土壤/沉积物过大，应迅速塑形以更易装入瓶中，并尽可能减少其暴露于有氧大气中的时间。
   7. 样品转移完成后，立即重新塞紧瓶塞，并用螺旋盖固定。
   8. 保持样品低温。返回实验室后立即将采集瓶置于4 °C冷藏。
2. 地下厌氧样品采集（钻孔混合培养物）
   1. 在气体分配装置旁放置一个无菌的1 L瓶。用橡胶塞密封瓶口。滴加100%乙醇至瓶塞上，并用打火机点燃。
   2. 将一根无菌的23 G针头连接至N₂气体分配装置。打开分配装置以排出O₂，并使N₂（或Ar）气体以适中流速流出。
   3. 待瓶塞火焰熄灭后，将针头插入瓶中。再插入第二根未连接气体分配装置的无菌23 G针头。对瓶内冲洗1–2分钟。
   4. 拔出未连接气体分配装置的针头。对瓶加压1分钟，随后拔出剩余的针头。
   5. 将加压后的瓶子和一根灭菌的23 G针头带至钻孔现场，按照Merino等人的方法¹²从钻孔中抽取液体。
      注：根据钻孔的方法、连接方式和流速，获取水样的策略会有所不同。若水流连续，则按步骤2.2.6所述方法采水即可满足要求。若为分批采集或低流量情况，则可采用替代的进/出液方法。在所有情况下，均应尽量减少污染，并确保所采集的样品能代表目标环境的真实状况。此为一项广泛适用的建议，因为作者的经验表明，从政府或私人场地进行的每次采样活动都必须高度适应现场可及条件。
   6. 迅速打开瓶盖，泵入液体使瓶完全充满，然后关闭瓶盖。
   7. 将现场携带的23 G针头插入瓶塞中，以释放瓶内压力。随后拔出针头。
   8. 保持样品低温。返回实验室后立即将采集瓶置于4 °C冷藏。

3. 体外 野外采集的厌氧微生物的培养

1. 培养瓶培养
   1. 准备一个带塞的无菌N₂气瓶，以及如上所述准备好的培养瓶和样品收集瓶。将100%乙醇滴在瓶塞上，并用打火机点燃。
   2. 将23 G针头安装到1 mL注射器上。待瓶塞火焰熄灭后，将针头插入N₂气瓶中，抽取约1 mL的N₂。拔出针头。
   3. 缓慢推动活塞释放N₂。一旦注射器排空，立即将针头插入样品收集瓶中，吸取0.5 mL环境样品。拔出针头。
   4. 将针头插入培养瓶中并注入样品。拔出针头。
   5. 轻轻摇动培养瓶，然后将其置于培养箱中，在表1或读者感兴趣的环境所建议的温度下进行培养。
      注：培养进程（无论是培养瓶还是生物反应器）通过使用深度为0.02 mm的Petroff-Hauser血细胞计数板进行监测。厌氧或苛养微生物的富集通常无法达到OD₆₀₀可检测的细胞密度，而其他检测方法在常规重复监测中不切实际。检测限、质量控制及统计计算取决于细胞计数室的类型和使用者的具体需求。
2. 生物反应器培养
   1. 使用改装注射器制备气囊
      1. 从三个10 mL鲁尔锁式注射器中取出活塞（每个最终组件使用一个）。切除每个注射器的法兰边缘，并打磨切断端，以防刺破气球。彻底清除改装注射器内的所有金属碎屑。
      2. 准备一个双层气球，即将一个气球套入另一个气球内。
      3. 将双层气球的末端拉伸覆盖在改装后的10 mL注射器上。
      4. 轻微分开外层气球与内层气球的末端，挤出两层气球之间的所有空气。
      5. 用扎带在气球基部收紧，以将气球牢固固定在注射器上。
   2. 改装瓶塞的制备
      1. 从十个1 mL鲁尔锁式注射器中取出活塞（每个待改装瓶塞使用两个）。切除注射器的法兰边缘。
      2. 准备两个#10号橡胶塞（用于8 L大口瓶）和三个适用于GL45螺纹瓶口（用于接液瓶）的橡胶塞。使用1/4"（6.4 mm）钻头，在每个橡胶塞顶部钻两个孔，孔径需足够容纳改装后的注射器，同时保证密封不漏气。
      3. 将改装后的注射器插入橡胶塞的孔中。
      4. 清洗并高压灭菌改装后的瓶塞，121 °C下处理30分钟。
   3. 生物反应器组件的组装
      1. 使用70%乙醇对所有旋塞阀、雌性鲁尔锁接头连接器及其他不可高压灭菌的生物反应器材料进行消毒，并将所有管路（按所需长度裁剪后）、瓶塞、玻璃棉及其他可高压灭菌的材料在121 °C下高压灭菌30分钟。
      2. 将一个无菌生物反应器（图1 和 图2）放置在铁架台上，并用链条固定。同时准备好水浴槽、蠕动泵、装有培养基的带塞8 L大口瓶（来自步骤1.2）、一个3.5 L接液瓶（非取样用）和一个500 mL接液瓶（取样用）。
      3. 大口瓶的封口
         1. 准备一个带有改装注射器的气囊。将三通旋塞连接至注射器的鲁尔锁接口。
         2. 取气囊组件，将三通旋塞连接至N₂气罐的管路上。旋转三通旋塞，关闭通向大气的一端。
         3. 打开气罐，用N₂充满气囊。充满后，旋转三通旋塞，关闭通向气囊的一端。关闭气罐，并断开气罐管路与三通旋塞的连接。
         4. 依次连接以下部件：带有改装注射器的三通旋塞、双通旋塞、雌性鲁尔锁接头耦合器，以及改装瓶塞上其中一个注射器的鲁尔锁接口。
         5. 在另一个注射器的鲁尔锁接口上连接一个双通旋塞。关闭改装瓶塞组件上两个双通旋塞的阀门。
         6. 解开固定大口瓶原始#10号瓶塞的金属丝。迅速用改装后的瓶塞组件替换原始瓶塞，并如前一样拧紧金属丝，以将改装瓶塞组件固定在大口瓶上。
            注：如有把握且准备充分，可在培养基制备的最后一步（步骤1.2.2.7）直接使用改装瓶塞组件封口大口瓶。
         7. 旋转三通旋塞，关闭通向大气的一端。打开串联的双通旋塞。此时气囊中的气体与8 L大口瓶的顶空已连通。
      4. 非取样和取样接液瓶的封口
         1. 使用适用于GL45螺纹瓶口的改装瓶塞封住3.5 L非取样接液瓶，在瓶塞底部涂抹70%乙醇以助其顺利插入瓶口。用GL45开放式螺帽盖紧瓶口。
         2. 依次连接以下部件：带有改装注射器鲁尔锁接口的气囊、三通旋塞、雌性鲁尔锁接头耦合器，以及改装瓶塞上其中一个注射器的鲁尔锁接口。旋转三通旋塞，关闭直接通向大气的一端。
         3. 在另一个注射器的鲁尔锁接口上连接一个雌性鲁尔锁接头耦合器。
         4. 对500 mL取样接液瓶重复上述三个步骤。
      5. 管路的安装
         1. 测量生物反应器水夹套端口与水浴槽软管接头之间的距离。裁剪两段内径3/16"（4.8 mm）、外径3/8"（9.5 mm）的硅胶管，使其长度适配该距离。
         2. 将两个直型软管接头与GL14开放式螺帽组装。将每根管子的一端连接到一个接头上。
         3. 将螺帽拧紧在生物反应器水夹套的端口上。将管子另一端连接至水浴槽的软管接头，确保水流方向为：从水浴槽流出，进入生物反应器水夹套底部，从顶部流出，再返回水浴槽。用扎带在管子末端收紧，以将其牢固固定在水浴槽软管接头上。
         4. 对于类似VWR超低流量可调微型泵的设备，将配套的外径3/16"（4.8 mm）带槽软管组件穿过泵体。
         5. 测量大口瓶管路组件与蠕动泵管路组件之间的距离。裁剪一段内径3/16"（4.8 mm）、外径3/8"（9.5 mm）的硅胶管，使其长度适配该距离。
         6. 将管子一端连接至大口瓶管路组件的软管接头，另一端连接至蠕动泵管路组件的软管接头，方向应确保培养基从大口瓶流向蠕动泵。
         7. 测量蠕动泵管路组件与生物反应器底部端口之间的距离。裁剪一段内径3/16"（4.8 mm）、外径3/8"（9.5 mm）的硅胶管，使其长度适配该距离。
         8. 将该管子一端连接至蠕动泵管路组件的软管接头，小心地将另一端连接至生物反应器底部端口。注意避免玻璃破裂，同时确保连接牢固，用扎带在管子末端收紧，以将其固定在生物反应器底部端口。
         9. 测量并裁剪约5"（127 mm）长、内径3/16"（4.8 mm）、外径3/8"（9.5 mm）的硅胶管。
         10. 将一个雌性鲁尔锁接头连接器连接至三通旋塞。将三通旋塞任意一端连接至该管子。
         11. 将一个弯角软管接头与GL14开放式螺帽组装。将其连接至管子的另一端。
         12. 将螺帽拧紧在生物反应器最上方垂直端口上。旋转三通旋塞，关闭通向生物反应器的一端。
         13. 测量最上方垂直端口组件与非取样接液瓶组件之间的距离。裁剪一段内径3/16"（4.8 mm）、外径3/8"（9.5 mm）的硅胶管，使其长度适配该距离。切除两个1 mL鲁尔锁式注射器的法兰边缘，并将其插入管子两端。
         14. 将该管路组件一端连接至最上方垂直端口组件的三通旋塞，另一端连接至非取样接液瓶组件上的雌性鲁尔锁接头连接器。
         15. 测量最上方垂直端口组件与取样接液瓶组件之间的距离。裁剪一段内径3/16"（4.8 mm）、外径3/8"（9.5 mm）的硅胶管，使其长度适配该距离。切除两个1 mL鲁尔锁式注射器的法兰边缘，并将其插入管子两端。
         16. 将该管路组件一端连接至最上方垂直端口组件的三通旋塞，另一端连接至取样接液瓶组件上的雌性鲁尔锁接头连接器。
   4. 填充生物反应器
      1. 用白色橡胶隔膜盖住生物反应器的一个GL18端口。用PTFE覆面硅胶隔膜（PTFE面朝向玻璃）和开放式螺帽盖住另一个GL18端口及其余暴露的垂直GL14端口。
      2. 使用一根50 cm长的棒，将0.9 g玻璃棉压入生物反应器底部。
      3. 将1.3 L沙子在121 °C下高压灭菌30分钟。使用漏斗将沙子填入生物反应器。
         注：可根据读者所研究的环境及目标微生物，替换为其他类型的沉积物。
      4. 将连接N₂气罐的管子插入生物反应器顶部，用N₂冲洗生物反应器顶空2分钟。立即用#7号瓶塞和GL45开放式螺帽密封生物反应器。
      5. 从非取样接液瓶断开管路，旋转三通旋塞，关闭通向气囊的一端。将管路连接至N₂气罐的雌性鲁尔锁接头连接器，用N₂冲洗生物反应器顶空2分钟。立即重新连接管路，并将三通旋塞恢复至关闭通向大气的一端。
      6. 对取样接液瓶重复上述步骤。
      7. 旋转生物反应器最上方垂直端口的三通旋塞，关闭通向取样接液瓶的一端。启动泵，将液体从大口瓶泵入生物反应器。暂停泵运行，排空取样瓶的气囊，并根据需要重新填充大口瓶的气囊N₂。
      8. 当生物反应器充满培养基后，将泵流速设置为0.6 mL/min（Mini-Pump上的数字值为40）。
         注：可根据读者需求替换其他流速。
      9. 根据表1或读者感兴趣的环境设定水浴温度。
         注：此时或稍后可根据实验设计加入接种物。若此时接种，请继续执行步骤3.2.4.10；若稍后接种，请继续执行步骤3.2.5。
      10. 准备一个样品收集瓶或已接种的培养瓶，以及一个带塞的无菌N₂气瓶。将100%乙醇滴在瓶塞上，并用打火机点燃。
      11. 将23 G针头安装到60 mL注射器上。待瓶塞火焰熄灭后，将针头插入N₂气瓶中，抽取约50 mL N₂。拔出针头。
      12. 缓慢推动活塞释放N₂。一旦注射器排空，立即将针头插入样品收集瓶中，吸取50 mL环境样品。拔出针头。
      13. 将23 G针头更换为无菌长金属针（套管，长度31.5 cm）。将长金属针穿过生物反应器GL18端口的白色橡胶隔膜。
      14. 将针插入沉积物中并注入接种物。拔出针头。
   5. 生物反应器运行维护
      1. 生物反应器运行期间每日执行以下操作：
         1. 检查水浴槽水位。若水位偏低，添加更多水（建议使用蒸馏水，以减少腐蚀和矿物沉积，延长设备寿命）。
         2. 检查非取样接液瓶的气囊；气囊充满会阻碍培养基流动。当气囊充满时，旋转三通旋塞，关闭通向接液瓶的一端。挤压气囊将其排空，然后将三通旋塞恢复至关闭通向大气的一端；重复操作直至气囊完全排空。
         3. 检查8 L大口瓶的气囊。若气囊气体不足，关闭串联的双通旋塞，并断开三通旋塞与双通旋塞的连接。按照步骤3.2.3.3.2、3.2.3.3.3和3.2.3.3.7重新填充并连接气囊组件。
         4. 检查8 L大口瓶中培养基的液位。若液位偏低，组装另一个8 L大口瓶，并按照步骤1.2和3.2.3.3制备更多培养基。暂停泵运行，关闭软管接头球阀，迅速断开旧大口瓶并连接新大口瓶。
            注：在0.6 mL/min流速下，每9天需更换一次培养基。
         5. 检查非取样接液瓶中培养基的液位。若已满，按照步骤3.2.3.4.1组装另一个非取样接液瓶。用N₂冲洗新瓶，迅速断开旧瓶上的气囊、改装注射器和管路，并连接至新瓶。
         6. 从已满的非取样接液瓶上取下改装瓶塞。将液体在121 °C下高压灭菌30分钟，然后根据所在机构的规定进行处置。清洗并高压灭菌非取样接液瓶组件的所有部件，以备下次使用。
      2. 每隔7天（或根据读者设定的天数）执行取样操作，步骤如下：
         1. 旋转生物反应器最上方垂直端口的三通旋塞，关闭通向非取样接液瓶的一端。收集250 mL液体。
            注：在0.6 mL/min流速下，收集250 mL液体约需7小时。
         2. 将生物反应器最上方垂直端口的三通旋塞恢复至关闭通向取样接液瓶的一端。断开管路和取样接液瓶与生物反应器最上方垂直端口三通旋塞的连接。
         3. 在完成取样液体的检测、储存和/或妥善处置后，清洗取样接液瓶组件的所有部件（气囊和改装注射器除外）。除气囊和改装注射器以及雌性鲁尔锁接头连接器外，其余部件均在121 °C下高压灭菌30分钟。重新组装，以备下次取样使用。
            注：强烈建议对部件、瓶盖、管路和隔膜配备双份或三份冗余，以便在需要时快速维修和更换。

结果

本文展示了利用钻孔混合培养基制备方法及所述生物反应器装置进行生物反应器研究的结果。钻孔混合培养基经改良后，以经氧化水热溶解法（Oxidative Hydrothermal Dissolution, OHD）处理的玉米芯浆液作为碳源^13,14。改良后的钻孔混合培养基以0.4 mL/min的流速持续泵入生物反应器，共运行44天。在第23天，接种了来源于美国内华达州死亡谷地区钻孔BLM-1的接种物¹⁵。分别在第1、8、15、22、23（接种后）、30、37和44天从生物反应器中采集液体样品，收集至取样收集瓶中。

为了监测接种物培养物的总体状态（以及生物反应器沉积物中经高压灭菌后存活的居民微生物），通过直接细胞计数法观察了生物反应器液体样品。采集的液体样品使用Petroff-Hauser血细胞计数板进行直接细胞计数。为了确定生物反应器中微生物成员的种类，从生物反应器液体样品中提取DNA，并通过高通量测序（NGS）分析16S rRNA基因。NGS数据采用mothur软件按照MiSeq标准操作流程¹⁶在本实验室进行处理。

接种前，直接细胞计数通常低于检测限（b.d.l.），即 1.0 × 10⁶ 个细胞/mL。接种后第 23 天的细胞计数较低，为 2.6 × 10⁶ 个细胞/mL，而随后的第 30、37 和 44 天细胞计数均超过 1.0 × 10⁷ 个细胞/mL（图 3）。尽管在第 1、8 和 22 天细胞计数低于检测限，但仍从每个时间点提取了 DNA 用于高通量测序（NGS），表明即使经过高压灭菌，沉积物中仍存在基础水平的接种前微生物。在第 8、15 和 22 天，优势菌属（根据各操作分类单元（OTU）中的序列读数数量确定）保持稳定，被鉴定为 Geobacillus。在第 23 天接种 BLM-1 菌液后，Geobacillus 不再占主导地位，新的优势菌属出现，同时伴随大量低丰度菌属，这些菌属在研究期间大部分持续存在（图 4）。由此我们得出结论：BLM-1 菌液在生物反应器中是一种具有活性且动态变化的培养体系。

对高通量测序（NGS）数据的进一步分析揭示了“微生物暗物质”类群的存在。研究使用分类名称中包含“未分类”（unclassified）或“未培养”（uncultured）字样的操作分类单元（OTU）作为“微生物暗物质”成员的替代指标。NGS数据取自第44天（即接种钻孔BLM-1来源微生物后的最后一天），并经过筛选，排除在接种前（第1、8、15或22天）已有测序读数的OTU，因为这些OTU不太可能来源于接种物。筛选后的第44天NGS数据共包含1,844个OTU和3,396条测序读数。其中，在门水平上未分类的OTU有366个（占20%），对应925条读数（占27%）；在属水平上未分类或未培养的OTU有1,252个（占68%），对应2,357条读数（占69%）。尽管本研究持续时间较短，但以此为指标，该初步研究支持了基于环境信息设计培养基的生物反应器在培养“微生物暗物质”成员方面具有潜在应用价值。

图1：用于厌氧培养的定制硼硅酸盐生物反应器示意图。（A）生物反应器从一侧的视图。（B）将A绕z轴顺时针旋转90°后的视图。（C）生物反应器的顶部视图。夹套式设计可通过水或油实现温度控制。在B的视图右侧可见两个夹套端口。内腔可填充任意类型的沉积物，也可不加沉积物以进行浮游培养。三个取样口（见A视图右侧）使得可以从生物反应器柱的不同深度取出样品。标准45、18和14 GL开口可使用聚四氟乙烯或丁基隔垫密封，可在1至6个月内保持气密状态。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：活性生物反应器组装。 照片中从左至右的玻璃器皿分别为（A）8 L 范德米尔瓶，（B）生物反应器（见图 1），以及（C）非采样收集瓶。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：生物反应器研究中的直接细胞计数结果。 使用0.02 mm Petroff-Hauser血细胞计数板对生物反应器内的微生物种群进行监测。接种物于第23天开始时加入。第1、8和22天的细胞计数低于检测限。直接细胞计数的有效检测限为1 × 10⁶ 个细胞/mL。缩写：b.d.l. = 低于检测限。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：生物反应器高通量测序结果。 操作分类单元（OTU）以堆叠柱状图形式展示，表示生物反应器研究各时间点中归属于不同唯一OTU的测序读段所占百分比。每个唯一OTU均被归类至对应的分类学属水平，属水平“其他”定义为在各时间点中测序读段占比低于10%的所有属。图中总计展示506,358条DNA测序读段，各时间点对应的读段数量标注于柱状图顶部。接种物于第23天开始时加入。缩写：OTU = 操作分类单元（Operational Taxonomic Unit）。请点击此处查看该图的放大版本。

化合物	土壤混合培养用量	钻孔混合培养用量	钻孔分离产甲烷菌用量
蒸馏水	1000.0 mL	1000.0 mL	1000.0 mL
HEPES	3.600 g	-	-
MOPS	-	-	2.000 g
MgCl2 ∙6 H2O	0.400 g	0.400 g	0.400 g
KCl	0.500 g	0.250 g	0.500 g
NH4Cl	0.268 g	0.268 g	0.268 g
Na2SO4	-	0.284 g	1.500 g
Na2HPO4 ∙2 H2O	-	-	0.356 g
1 M KH2PO4（pH 6）	1.0 mL	1.0 mL	-
1 M H3BO3（pH 9.4）	1.0 mL	1.0 mL	1.0 mL
微量元素	1.0 mL	-	1.0 mL
维生素	-	-	1.0 mL
1 mg/mL 刃天青钠	0.4 mL	0.3 mL	0.4 mL
调至 pH	-	7.0	7.0
用于 pH 调节的试剂	-	NaOH	KOH
培养温度	25 °C	60 °C	47 °C

表1：培养基成分。 各培养基所含化合物及物理参数列表。所列出的培养基为基本培养基，不含碳源和能源，因为这些成分可能因读者所研究的微生物及其环境而异，需根据具体情况添加。有关可能的碳源和能源添加建议，请参见讨论部分。

补充文件 1：气体管路装置。 请点击此处下载该文件。

讨论

本实验方案的培养基制备部分（第1节）在结构上借鉴了Miller和Wolin改良的Hungate技术¹⁷，自发表以来已被广泛使用。该扩展方案的实用性源于其描述性特点以及与之配套的 原位 微生物的获取。已使用含有环境信息指导配制的模拟培养基的培养瓶，成功培养出以下微生物 原位-获得的前任成员 "微生物暗物质"：厌氧地下细菌 Thermoanaerosceptrum fracticalcis 菌株 DRI13¹⁸, Caldiatribacterium inferamans 菌株SIUC1（登录号MT023787；论文在准备中），以及 Anaerothermus hephaesti 菌株SIUC3（登录号MK618647；论文在准备中），以及未表征的地下厌氧细菌菌株DRI14（登录号KR708540）。

本方案的一个重点在于其高度可适应于各种地表和地下厌氧环境及微生物。首先，建议调整培养基成分，以反映目标环境的实际组成。例如，在模拟钠离子（Na⁺）和氯离子（Cl^-）浓度均为 3,000 mg/L 的环境时，可在配方中添加 3,000 mg/L 的 NaCl；在模拟砂岩与页岩体积比为 1:1 的环境时，可在生物反应器中加入 650 mL 砂和 650 mL 页岩。其次，可修改培养基成分以促进特定目标微生物的生长。特别是像本文所述的三种基础培养基这类初始培养基，其设计本身就预设并依赖于此类调整。碳源和能源的示例包括延胡索酸¹⁸、蛋白胨¹⁸、含纤维素的有机物¹⁹、乙酸盐²⁰、酵母提取物^19,20、木糖醇（菌株 SIUC1）、甲酸盐（菌株 SIUC3），以及其他潜在来源如 H₂/CO₂、柠檬酸盐和葡萄糖。最后，可根据研究目的调整培养基成分。例如，代表性结果部分所描述的研究主要关注典型的地下厌氧微生物对一种独特的混合有机浆料（经OHD^13,14处理的玉米芯浆料）的响应；因此，其配方中采用了该碳源，而非更常规的选择。其他针对特定研究的潜在添加物包括：为生物修复研究添加塑料、酸类、重金属或其他异生物质；为高附加值解聚产物研究添加难降解碳聚合物（如纤维素和塑料）；以及为小规模堆肥或其他农业研究添加粪肥和植物废弃物。

如果需要对培养基进行还原后的分析，例如测定pH、氧化还原电位（ORP）和溶解氧（DO），则可通过牺牲适量的培养基瓶来可靠地了解该批次的特性。在将密封的培养基瓶暴露于空气后，强烈建议在打开后1分钟内完成ORP和DO的测定。非依赖氧气的测定项目（如pH）可在初次打开后非紧急地进行。专性厌氧微生物通常要求ORP值< -200 mV才能生长。如果培养基的ORP值> -200 mV 和/或 DO值> 0.40 mg/L，则可添加额外的Na₂S（0.1–0.2 g/L）或其他还原剂（如柠檬酸钛、L-半胱氨酸、抗坏血酸）进一步还原培养基。

刃天青常被用作氧气指示剂（如此实验方案中所示）；然而，更准确地说，它是一种氧化还原指示剂²¹，通过氧气改变溶液的氧化还原电位，间接指示氧气的存在。刃天青溶液最初呈蓝色。当接触还原剂时，溶液会不可逆地转变为粉红色。当溶液进一步被还原时，则可逆地变为无色，并在氧化时恢复为粉红色。作者曾观察到一些情况：含刃天青的还原培养基由蓝色变为粉红色后，未能进一步转变为无色。然而，作者也发现，此类培养基在高压灭菌后通常会转变为无色，且延长煮沸和通气时间通常有助于在加入还原剂后使刃天青完全转变为无色形式。如有需要，可使用溶解氧探头测定培养基中的氧气浓度。

运行这些生物反应器所需的全部材料以及定制的玻璃生物反应器本身，成本均未超过约5000美元（此估算假设水浴锅、泵、培养箱等辅助设备已具备）。与商业化的自动生物反应器相比，这些厌氧培养技术具有较高的经济性，而商业化自动生物反应器的价格通常起始于 >10,000美元。此外，许多商用生物反应器正在转向一次性使用的反应容器，这改变了比较的基准，对于规模较小的研究实验室或大学而言，持续更换此类容器并不经济。同时，商用系统可能存在由所用塑料、垫圈/接头上的润滑脂或经化学处理的水引入的化学偏差，从而影响难培养微生物的培养成功率。低成本、可定制性以及能够采集厌氧环境样品的灵活性，结合合理设计的培养基进行接种以获得富集培养物用于研究，显著提高了获得独特微生物的可能性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
通用材料
1 L 硼硅酸盐玻璃瓶	Fisher Scientific
1 mL 带滑动接头的注射器	Fisher Scientific
10 mL 玻璃移液管	Fisher Scientific
100 mL 培养瓶	Fisher Scientific
20 mm 手动压接钳	Fisher Scientific
23 G 针头	Fisher Scientific
500 mL 硼硅酸盐玻璃瓶	Fisher Scientific
铝制密封盖	Fisher Scientific
导管，31.5 cm 长度	Fisher Scientific
导管，6 cm 长度	Fisher Scientific
取芯器	Giddings Machine Company		由公司部件组装而成
气体歧管	Swagelok		由多个不同部件组装而成
打火机	Lowe's
N2 气体	Airgas
腈类手套	Fisher Scientific
橡胶塞（用于 GL45 瓶）	Glasgeratebau OCHS
橡胶塞（用于培养瓶）	Ace Glass
搅拌加热板	Corning
微量元素	ATCC
维生素	ATCC
生物反应器专用材料
#10 橡胶塞	Ace Glass
#7 橡胶塞	Fisher Scientific
1 mL 带鲁尔锁接头的注射器	Fisher Scientific
1/4" 软管接头球阀	Amazon
10 mL 带鲁尔锁接头的注射器	Fisher Scientific
3.5 L 硼硅酸盐玻璃瓶	Fisher Scientific
5/16" - 1/4" 软管接头转换接头	Amazon
60 mL 带鲁尔锁接头的注射器	Fisher Scientific
8 L 硼硅酸盐玻璃大瓶	Allen Glass
GL14 开口顶盖用弯头软管连接器	Ace Glass	7623-20
气球	Party City
硼硅酸盐玻璃生物反应器	Allen Scientific Glass		按需定制
电钻	Lowe's
鲁尔锁母接头耦合器	Amazon
GL14 开口顶盖	Ace Glass	7621-04
GL18 开口顶盖	Ace Glass	7621-08
GL45 开口顶盖	Ace Glass
GL14 开口顶盖用聚四氟乙烯包覆硅胶隔垫	Ace Glass	7625-06
GL18 开口顶盖用聚四氟乙烯包覆硅胶隔垫	Ace Glass	7625-07
铁架台	Fisher Scientific
铁架台链条夹	Amazon
铁架台夹	Fisher Scientific
硅胶管；内径 1/4"，外径 1/2"	Grainger	55YG13
硅胶管；内径 3/16"，外径 3/8"	Grainger
GL14 开口顶盖用直型软管连接器	Ace Glass	7623-22
三通旋塞阀	Amazon
二通旋塞阀	Amazon
超低流量可调微型泵	VWR
水浴锅	Fisher Scientific
白色橡胶隔垫（适用于外径 13–18 mm 的管）	Ace Glass	9096-49
金属丝	Lowe's
扎带	Lowe's