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方法文章

造血器官中基质细胞的分离

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DOI：

10.3791/66231

⸱

2024年1月26日

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了可从鼠骨、骨髓、胸腺及人胸腺组织中分离基质细胞的实验方案，这些方案适用于单细胞多组学分析。

摘要

单细胞测序技术使得研究人员能够绘制造血器官基质中异质性细胞群体的图谱。这些方法为研究稳态下尚未解析的细胞异质性，以及由外界应激或衰老过程所诱导的细胞类型组成变化提供了有力工具。本文提供了从小鼠和人胸腺，以及小鼠骨骼和骨髓中分离高质量基质细胞群体的分步实验方案。通过这些方案分离得到的细胞适用于生成高质量的单细胞多组学数据集。文中讨论了样本消化、造血谱系细胞耗竭、流式细胞术分析/分选等步骤的影响，以及这些因素如何影响与单细胞测序技术的兼容性。通过展示流式细胞术图谱示例，说明了有效与低效解离的效果，并结合测序后分析中下游基质细胞得率，为使用者提供了可识别的操作提示。充分考虑基质细胞的特定需求，对于获得高质量且可重复的实验结果至关重要，这将推动该领域的科学认知不断深入。

引言

在健康成人中，血细胞的从头生成发生于骨髓和胸腺。这些部位的基质细胞对维持造血功能至关重要，但基质成分仅占组织的不到1%1,2,3,4。因此，获得支持造血功能的基质细胞的纯化分离物构成了重大挑战，特别是对于需要快速处理以获取高质量样本的单细胞多组学研究而言尤为如此。不同消化液组分可能干扰多组学分析中的某些步骤5,6。本文所述方案详细介绍了从骨髓和胸腺组织中分离多种类型基质细胞的方法。

骨髓和胸腺中基质成分的扰动会严重破坏血细胞发育，并可能导致恶性肿瘤7,8,9。造血支持性基质在细胞毒性预处理及骨髓移植后会受到损伤，导致维持造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的细胞因子和生长因子分泌减少2,10,11。此外，衰老会影响骨髓和胸腺的基质细胞，可能促进衰老相关的造血表型。胸腺是最早发生显著年龄相关性退变的器官。早在青春期开始时，脂肪组织和纤维化组织便开始取代支持T细胞发育的基质12,13。在骨髓中，随着年龄增长，脂肪细胞含量增加，血管壁龛和骨内膜壁龛也发生显著重塑14,15,16。

为了研究多种应激状态下支持造血功能的基质，以及人和小鼠胸腺组织中的此类基质，我们优化了先前发表的消化方案1,2,8,17,18。这些方案可高效且可重复地分离细胞，并适用于单细胞RNA测序（scRNAseq）及其他多组学分析技术。

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方案

所有涉及人体组织的工作均在获得麻省总医院机构审查委员会（IRB）批准后进行。所有动物实验均按照麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行。本研究使用了8至10周龄的C57Bl/6小鼠，包括雄性和雌性。实验动物来自商业来源（见材料表）。

1. 小鼠胸腺组织的制备

  1. 准备以下缓冲液和溶液。
    1. 含 2% (v/v) 胎牛血清 (FBS) 的 Medium 199 (M199)（参见材料表）。
    2. 小鼠组织解离混合液：在 M199 + 2% FBS 中加入 0.5 WU/mL Liberase TM 和 6.3 U/mL DNase I（参见材料表）。
    3. 含 2% (w/v) 牛血清白蛋白 (BSA) 的 M199。
      注意：为提高 RNA 质量，可将含 FBS 的培养基替换为含 BSA 的培养基。
  2. 进行小鼠胸腺解剖
    1. 按照机构批准的规程，通过 CO2 窒息法处死小鼠，并将其仰卧放置。用 70% 乙醇喷洒胸部毛发使其湿润，然后打开胸腔。
    2. 使用手术剪在肋骨下方做一横向切口，小心地解剖胸腺。沿小鼠两侧肋骨剪至锁骨处，然后剪断膈肌，使胸壁松开。用镊子抬起肋骨以暴露胸腔。
      1. 胸腺为位于胸腔顶部、心脏上方的白色双叶状器官。用镊子夹住胸腺，轻轻剪断固定胸腺的结缔组织。将解剖得到的胸腺组织放入盛有冰上预冷的 M199 + 2% FBS 的 6 孔板孔中。
        注意：当处理老龄鼠、经辐射处理的小鼠或具有胸腺缺陷的突变品系时，胸腺可能非常小，需使用解剖显微镜才能可靠地切除该器官。
    3. 在解剖显微镜下，使用钝头镊子和微型弹簧剪去除所有非胸腺组织。
  3. 进行小鼠胸腺组织的酶解解离（每 10 分钟一次，共 30 分钟）
    1. 将清洗后的胸腺置于 15 mL 离心管盖中，用无菌手术剪将其充分剪碎。
      注意：在即将用于消化反应的离心管盖中进行组织剪碎，可最大限度减少因转移组织导致的损失。这一点在处理老龄鼠、经辐射处理的小鼠或具有胸腺缺陷的突变品系时尤为重要。在这些情况下，胸腺体积较小，必须尽可能减少材料损失。
    2. 向 15 mL 离心管中加入 2 mL 小鼠组织解离混合液，将装有胸腺碎片的管盖拧紧，倒置混匀 5 次，确保组织充分重悬于解离液中。
    3. 为防止泄漏，用石蜡膜包裹管盖，然后将离心管水平置于 37 °C 水浴中，以 250 rpm 振荡，孵育 10 分钟。
      注意：消化步骤的成功依赖于在 37 °C 条件下并伴随振荡进行孵育。本方案已使用振荡水浴优化。若无此设备，其他可在加热条件下实现振荡的方法也可能适用，但我们建议先针对具体条件优化该方案。
    4. 将 15 mL 离心管放入试管架中，静置使组织碎片沉降。小心吸出上清液，并通过 70 µm 细胞筛滤入预冷的 50 mL 离心管中。
    5. 重复步骤 2–4 两次，共完成 3 轮消化。最后一次孵育结束时，组织应基本完全解离。
    6. 向收集的细胞悬液中加入 20 mL M199 + 2% FBS，于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟。
    7. 弃去上清液，用适量体积的 M199 + 2% FBS 重悬细胞，随后进行细胞计数。
      注意：重悬所用 M199 + 2% FBS 的体积取决于胸腺状态。对于 6–10 周龄的小鼠，建议使用 3–4 mL M199 + 2% FBS 重悬组织；而对于使用老龄鼠、经辐射处理的组织或具有胸腺缺陷的突变品系的实验，因胸腺体积较小，所需体积应为 0.1–1 mL。
    8. 将细胞悬液用 0.4% (w/v) 台盼蓝溶液按 1:2 比例稀释，取样加入血细胞计数板，在明场显微镜下计数。统计未染色细胞以确定每毫升活细胞数量，并统计蓝色染色细胞以评估样品活力。
  4. 进行小鼠胸腺基质细胞的荧光激活细胞分选（FACS）
    1. 于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟收集细胞。将细胞重悬于含 25 U/mL Protector RNase 抑制剂（参见材料表）的 M199 + 2% FBS 中，调整细胞浓度至 5 × 107 个细胞/mL。
    2. 加入小鼠 Fc 封闭抗体（参见材料表），终浓度为 2 µg/mL，于 4 °C 孵育 10 分钟。
    3. 于 4 °C 用以下抗体标记细胞 30 分钟：CD45-PE/Cy7（4 µg/mL）、Ter119-PE（4 µg/mL）、CD31-BUV737（2 µg/mL）和 EpCam-BV711（2 µg/mL）（参见材料表）。
    4. 用 M199 + 2% BSA 洗涤样品，于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟。
    5. 弃去上清液，将细胞重悬于含活力染料（如 DAPI，0.5 µg/mL 或 7-AAD，1 µg/mL）（参见材料表）的 M199 + 2% BSA 中。随后按照既定方案进行胸腺基质细胞的 FACS 分离19。

2. 人胸腺组织的制备

  1. 准备以下缓冲液和溶液。
    1. 含 2% (v/v) FBS 的 Medium 199 (M199)。
    2. 含 1.5% (w/v) BSA 的 M199。
    3. 人组织解离混合液：在 M199 + 1.5% BSA 中加入 1 mg/mL Collagenase IV、2 mg/mL Dispase 和 6.3 U/mL DNase I（参见材料表）。
      注意：人胸腺组织制备过程中的最后一步消化包含胰蛋白酶（trypsin）。因此，在此之前的所有操作步骤必须使用含 BSA 的缓冲液进行，因为 FBS 会抑制胰蛋白酶的活性。
  2. 进行人胸腺组织的分离
    1. 将人胸腺组织（按照先前已发表的方法19获取）置于适量 M199 + 1.5% BSA 中，并在冰上保存直至开始处理。
    2. 操作人胸腺组织时，应视其具有潜在感染性，所有操作均需在组织培养生物安全柜中进行，并遵循美国疾病控制与预防中心（CDC）指南中的标准防护措施20。
    3. 将组织放入盛有 10 mL 冰冷 M199 + 1.5% BSA 的 10 cm 培养皿中。使用无菌镊子和剪刀，小心去除在器官摘取过程中受损的胸腺外脂肪或其他组织。
    4. 使用手术剪和镊子将胸腺剪切成约 1 cm3 的小块，然后用 10 mL 注射器的活塞轻轻按压组织块，以释放部分正在发育的胸腺细胞，从而减少待消化的组织体积。
      注意：若需后续分析胸腺细胞的发育阶段，请保存释放出的造血细胞组分。但切勿将此组分与酶解过程中产生的基质细胞组分混合。观察发现，合并这两部分会显著增加细胞悬液中堵塞的风险，最终降低基质细胞的得率。在轻柔压碎组织的过程中，仅有极少量基质细胞损失。
  3. 进行人胸腺组织的酶解分离（共 90 分钟，分 30 分钟为一轮）
    1. 将约 5 mg 经轻微压碎的胸腺组织碎片转移至 50 mL 锥形管的管盖中，然后使用无菌手术剪将组织进一步剪碎。
    2. 向 50 mL 锥形管中加入 8 mL 人组织解离混合液，将装有剪碎人胸腺组织的管盖盖上，轻轻倒置混匀 5 次，确保所有组织均与酶混合液充分接触。
    3. 用石蜡膜密封管盖以防止泄漏，将锥形管水平置于 37 °C、振荡（250 rpm）的水浴中孵育 30 分钟。
    4. 将 50 mL 锥形管置于试管架中，静置使人胸腺组织碎片沉降，然后小心移除上清液，并通过 70 µm 细胞滤筛转移至另一个置于冰上的新 50 mL 管中。
    5. 重复步骤 2.3.2–2.3.4，共进行两轮人组织解离混合液的消化。
    6. 第二轮消化完成后，向剩余组织中再加入 8 mL 人组织解离混合液，并同时向组织解离管中加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶。在 37 °C、250 rpm 振荡条件下继续孵育 30 分钟。
      注意：人组织的消化时间必须至少达到 90 分钟，因为更短的孵育时间会导致基质细胞得率显著降低。
    7. 最后一次孵育结束后，将细胞悬液和残留的组织碎片与此前收集的上清液合并，通过 70 µm 细胞滤筛过滤。向样品中加入 3 mL FBS 以终止胰蛋白酶反应，并将样品置于冰上。
    8. 按照步骤 1.3 所述方法进行细胞计数。
  4. 进行人胸腺基质细胞的荧光激活细胞分选（FACS）
    1. 将人胸腺细胞悬液离心沉淀，重悬于含 25 U/mL Protector RNase 抑制剂的 M199 + 2% FBS 中，调整细胞浓度至 5 × 107 个细胞/mL。
    2. 在 4 °C 条件下，加入人 Fc 封闭剂（5 µg/mL）（参见材料表），孵育 10 分钟。
    3. 在 4 °C 条件下，用以下抗体对样品染色 30 分钟：CD45-BV711（2.5 µg/mL）、CD235a-BV711（2.5 µg/mL）、Lineage-cocktail-FITC（3.76 µg/mL）、CD66b-FITC（20 µL/100 µL 样品）、CD8-APC/Cy7（5 µL/100 µL 样品）、CD4-BV605（5 µL/100 µL 样品）、CD31-PE/Dazzle594（10 µg/mL）和 EpCam-BV421（2.5 µg/mL）（参见材料表）。
    4. 用 M199 + 1.5% BSA 洗涤样品，并在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。
    5. 弃去上清液，将细胞重悬于含活率染料（如 DAPI，0.5 µg/mL 或 7-AAD，1 µg/mL）的 M199 + 1.5% BSA 中。随后按照既定方案19进行胸腺基质细胞的 FACS 分离。

3. 小鼠骨组织和骨髓组织的制备

注意：为了获得最高纯度的基质细胞并实现组织的最佳解离，骨组织和骨髓组分需分别进行两次独立的消化反应。在消化步骤完成后，可将样品合并，作为单一的基质细胞组分进行分选。

  1. 准备以下缓冲液和溶液。
    1. 含 2% (v/v) 胎牛血清（FBS）的 M199 培养基。
    2. 小鼠骨与骨髓（B&M）解离混合液：在 M199 + 2% FBS 中加入 Stemxyme（2 mg/mL）、Dispase（1 mg/mL）和 DNase I（10 U/mL）（参见材料表）。
      注意：B&M 解离混合液需新鲜配制，并在使用前置于冰上保存。
    3. 含 0.5% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的 M199 培养基。
    4. 含 0.5% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）。
    5. 含 2% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA 的 M199 培养基。
      注意：为提高 RNA 质量，可将含 FBS 的培养基替换为含 BSA 的培养基。
  2. 进行小鼠骨髓分离
    1. 按照机构批准的程序，通过 CO2 窒息法处死小鼠，并用 70% 乙醇喷洒以润湿毛发。
    2. 小心取出双侧股骨、胫骨、骨盆和肱骨，放入盛有 M199 + 2% FBS 的培养皿中，并置于冰上21,22。
    3. 用组织擦拭纸去除所有肌肉、韧带和软骨组织，以尽量减少对骨骼的损伤并保留骨膜层。将骨骼转移至另一新培养皿中，加入 M199 + 2% FBS 并置于冰上。
    4. 使用解剖刀切开长骨的生长板，去除骨骺，并将其放入盛有 M199 + 2% FBS 的 10 cm 培养皿中，置于冰上。
    5. 用 28 G 针头和装有 10 mL M199 + 2% FBS 的 10 mL 注射器冲洗骨髓，直至骨骼呈淡白色。将冲洗液收集至置于冰上的 15 mL 离心管中。将冲洗后的骨骼放入含骨骺的 10 cm 培养皿中。
      注意：彻底冲洗骨髓以实现组织的完全分离，有助于获得更高质量的样本。
  3. 进行小鼠骨髓组织的酶解解离（总共 30 分钟，分三次，每次 10 分钟）
    1. 将 15 mL 离心管直立放置于冰上，待骨髓沉降至管底后，缓慢用移液器吸除 10 mL M199 + 2% FBS。
    2. 向 15 mL 管中加入 4 mL B&M 解离混合液，置于 37 °C 水浴中（不振荡）孵育 10 分钟。
    3. 5 分钟后，将管子轻轻倒置混匀三次，再放回水浴中。
    4. 第一个 10 分钟结束后，确认细胞沉淀位于管底，将上清液通过 70 µm 细胞筛过滤，收集至预冷的 50 mL 管中。向剩余的骨髓沉淀中加入 2 mL 新鲜 B&M 解离混合液，重新放回水浴中。
    5. 使用 1 mL 移液器剧烈吹打，解离任何残留的骨髓组织碎片。将所得细胞悬液全部收集至与前一步相同的离心管中。向收集的细胞悬液中加入 20 mL M199 + 0.5% BSA + 2 mM EDTA。
      注意：在步骤 3.3.5 中，最终消化样本后加入的缓冲液含有 EDTA，有助于抑制进一步的酶活性。
  4. 进行小鼠骨髓组织中造血细胞的去除。
    1. 在 4 °C 条件下，以 500 x g 离心 5 分钟。弃上清后，用含生物素标记抗体（5 mg/mL）的 500 µL PBS + 0.5% BSA 重悬细胞，抗体靶向 CD45、Ter119、CD11b、Gr1、B220 和 CD3（参见材料表）。转移至带盖的圆底离心管中。
    2. 在室温避光条件下，于旋转摇床上孵育 10 分钟。
    3. 充分涡旋磁珠，向管中加入 25 µL 磁珠。
    4. 在室温避光条件下，于旋转摇床上孵育 5 分钟。
    5. 将离心管置于配套磁架上 2–3 分钟，收集上清液至新离心管中。
      注意：此步骤后，骨髓可与骨组织部分合并或分别保存。若谱系清除成功，所得细胞悬液中应无红细胞。
  5. 进行小鼠骨组织的酶解解离。
    1. 在 10 cm 培养皿中，用 50 mL 离心管的平头盖将骨骼压碎成更小的碎片。将上清液通过 70 µm 细胞筛过滤，以分离筛内残留的骨碎片。
      注意：也可使用研钵和研杵进行骨组织破碎。但此方法通常会产生更多碎片，且当骨骼被研磨而非压碎时，基质细胞的存活率较低。基质细胞仍附着于骨组织中，而含造血细胞的上清液应被弃去。
    2. 使用剪刀剪碎细胞筛中的骨碎片，以增加表面积，提高酶解效率。用 5 mL M199 + 2% FBS 洗涤骨组织。
    3. 将骨组织部分转移至新 50 mL 离心管中，加入 5 mL 小鼠 B&M 解离混合液（参见材料表）。
    4. 为防止泄漏，用石蜡膜包裹管盖。然后将离心管水平置于 37 °C 水浴中，以 120 rpm 振荡 30 分钟。
    5. 消化完成后，加入 25 mL M199 + 0.5% BSA + 2 mM EDTA，将含基质细胞的上清液通过 70 µm 细胞筛过滤至预冷的 50 mL 离心管中。
      注意：应观察确认消化后骨碎片明显减少。在步骤 3.5.5 中，最终消化样本后加入的缓冲液含有 EDTA，有助于抑制进一步的酶活性。
  6. 进行小鼠骨与骨髓基质细胞的荧光激活细胞分选（FACS）。
    1. 在 4 °C 条件下，以 500 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。
    2. 用含 10 µg/mL 小鼠 Fc 封闭剂的 PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA 重悬细胞，在 4 °C 孵育 10 分钟。
    3. 对细胞进行染色（最多 1000 万个细胞/100 µL 总染色体积），使用以下抗体：CD45-PE/Cy7（1 µg/mL）、Ter119-PE/Cy7（1 µg/mL）、CD31-BV421（0.66 µg/mL）、CD140a-APC（2 µg/mL）、Sca1-AF700（0.66 µg/mL）、CD51-PE（2 µg/mL）、CD105-PE/dazzle（2 µg/mL）（参见材料表）。
    4. 将 Calcein-AM 平衡至室温，用 50 µL DMSO 重悬。每次使用前新鲜配制，重悬后置于室温保存。在加入已用抗体染色混合液重悬的样本前，先用 PBS 将 Calcein 预稀释至 0.1 mg/mL，然后按 20 µg/mL 加入样本中，避光于 4 °C 孵育 20–30 分钟。
    5. 用 PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA 洗涤样本，在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟。
    6. 弃上清，用 PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA 重悬细胞。按照既定方案进行骨与骨髓基质细胞的 FACS 分离19。

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结果

这些方案可从胸腺和骨髓中获得适用于流式细胞分析以及单细胞多组学（如单细胞RNA测序）的可重复的基质细胞类型。小鼠胸腺组织在应激因素（如骨髓移植前的细胞毒性预处理或自然衰老过程）下会发生显著重塑。因此，在上述两种情况下，胸腺细胞数量均显著减少（图1A）。一只8周龄野生型小鼠的胸腺约含有1亿个细胞，而2岁小鼠胸腺的细胞数量可能仅为前者的一半，骨髓移植后4天的胸腺细胞数甚至可低至500,000个（图1A）。

细胞毒性预处理将优先清除造血细胞，从而使基质细胞组分相对富集（图1B）。然而，由于总体细胞数量较低，分离获得足够数量的胸腺基质细胞仍具有挑战性。因此，可能需要合并多只动物以获取适用于下游多组学分析的细胞数量，并尽可能减少样本损失。为了对胸腺基质细胞进行多组学分析，需通过荧光激活细胞分选（FACS）分离活的、单个的、CD45-Ter119-细胞（图1C

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讨论

造血器官中的基质细胞对正常的血液生成至关重要，而造血基质的紊乱可能导致造血功能维持及应激反应出现严重障碍9,23,24。深入了解造血基质细胞对于认识血液系统疾病7,9,10,24以及开发治疗这些疾病的疗法25,26具有重要意义。然而，可重复地将造血基质与实质组织分离仍是一项挑战，尤其是在单细胞多组学技术发展的背景下，该技术要求高质量的样本制备，同时最大化基质细胞的得率和多样性。本文所述方案已优化，可兼容大多数下游多组学应用，并能有效应对造血基质细胞分离中的各项挑战

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披露

D.T.S. 是 Agios Therapeutics 和 Editas Medicines 的董事兼股东；是 Magenta Therapeutics 和 LifeVault Bio 的创始人、董事、股东及科学顾问委员会成员；是 Fate Therapeutics 和 Garuda Therapeutics 的股东及创始人；是 Clear Creek Bio 的董事、创始人及股东；并担任 FOG Pharma、Inzen Therapeutics 和 VCanBio 的顾问，同时获得住友迪艾普制药（Sumitomo Dainippon）的资助研究经费。D.T.S. 和 K.G. 是专利 US20220143099A1 的发明人。

致谢

我们得到了马萨诸塞州总医院HSCI-CRM流式细胞术实验室和哈佛大学Bauer核心实验室提供的专业技术支持。T.K. 和 K.G. 得到了瑞典研究理事会的资助，C.M. 得到了德国研究基金会的资助。我们感谢Sergey Isaev和I-Hsiu Lee在单细胞RNA测序数据分析方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD（7-氨基放线菌素 D）BD Biosciences559925
抗人谱系抗体混合物 3-FITCBD Biosciences643510
牛血清白蛋白Millipore SigmaA9647
C57Bl/6 小鼠Jackson664雄性或雌性，8–12 周龄
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
胶原酶 IVMillipore SigmaC5138
Corning 无菌细胞筛，白色，孔径：70 µmFisher Scientific08-771-2
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
脱氧核糖核酸酶 I 溶液Thermo Fisher Scientific90083 2500 U/mL
Easysep 小鼠链霉亲和素 RapidSpheres 分离试剂盒StemCell Technologies19860
胎牛血清GibcoA31605-01合格一次性产品
人 Fc 封闭剂BD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001研究级
Medium 199Gibco12350
小鼠抗人 CD235a-BV77BD Biosciences740785
小鼠抗人 CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
小鼠抗人 CD45-BV77Biolegend304050
小鼠抗人 CD4-BV605BD Biosciences562658
小鼠抗人 CD66b-FITCBD Biosciences555724
小鼠抗人 CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
小鼠抗人 EpCam-BV421Biolegend324220
Protector RNase 抑制剂Millipore Sigma3335402001
大鼠抗小鼠 CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
大鼠抗小鼠 CD11b-生物素Biolegend101204
大鼠抗小鼠 CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭剂）BD Biosciences553142
大鼠抗小鼠 CD31-BUV737BD Biosciences612802
大鼠抗小鼠 CD31-BV421Biolegend102424
大鼠抗小鼠 CD3-生物素Biolegend100244
大鼠抗小鼠 CD45.2-生物素Biolegend109804
大鼠抗小鼠 CD45-PE/Cy7Biolegend103114
大鼠抗小鼠 CD45-PE/Cy7Biolegend103114
大鼠抗小鼠 CD45-PE/Cy7Biolegend103114
大鼠抗小鼠 CD45R/B220-生物素Biolegend103204
大鼠抗小鼠 CD51-PEBiolegend104106
大鼠抗小鼠 EpCam-BV711BD Biosciences563134
大鼠抗小鼠 Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
大鼠抗小鼠 Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-生物素Biolegend108404
大鼠抗小鼠 Ter119-生物素Biolegend116204
大鼠抗小鼠 Ter119-PEBiolegend116208
大鼠抗小鼠 Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme Worthington BiochemicalLS004107

参考文献

  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
  3. Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
  4. Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
  5. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  6. Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830(2023).
  7. Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
  8. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  9. Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  10. Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
  11. Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
  12. Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
  13. Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
  14. Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
  15. Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
  16. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  17. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  18. Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951(2013).
  19. Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
  20. Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html (2023).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936(2016).
  22. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  23. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
  24. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  25. Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
  26. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  27. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).
  28. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224(2018).

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