本方案描述了一种半自动化的途径，旨在提高对濒危珊瑚物种精子进行处理和冷冻保存的效率与能力，以保护遗传多样性并支持珊瑚礁修复工作。
本文内容
摘要
摘要
由于海洋变暖导致珊瑚白化事件的频率增加，珊瑚礁正面临危机，造成全球范围内珊瑚礁上珊瑚的大规模死亡。随之而来的遗传多样性和生物多样性的丧失可能削弱珊瑚适应气候变化的能力，因此保护现有生物多样性的努力对于最大限度地利用现有资源进行当前和未来的珊瑚礁修复至关重要。长期保存遗传资源最有效的方法是冷冻保存与生物样本库技术，该技术可将活体样本在液氮的深低温条件下无限期地冷冻储存。自2012年以来，珊瑚精子的冷冻保存已成为可能，但由于珊瑚繁殖具有季节性，生物样本库工作每年仅能在珊瑚产卵的几个夜晚进行。因此，提高珊瑚精子处理和冷冻保存流程的效率，对于充分利用这些有限的生物样本库机会至关重要。为此，我们致力于在现有技术基础上优化珊瑚精子的冷冻保存处理路径，建立一种半自动化的操作方法，以简化精子的评估、处理和冷冻保存流程。该流程结合了计算机辅助精子分析、条形码冻存管以及一系列可供多名用户同时编辑的关联式自动数据表，显著提升了野外样本处理和元数据管理的效率。通过与澳大利亚“珊瑚礁修复与适应计划”等跨领域研究项目相结合，冷冻保存技术可在大规模珊瑚礁修复项目中发挥关键作用，包括促进水产养殖种群的遗传管理、支持提高耐热性的相关研究，以及防止珊瑚物种灭绝。本文所述的操作流程将供全球各地珊瑚礁上的珊瑚冷冻保存与生物样本库实践人员使用，并为冷冻保存技术从科研实验室向大规模应用转化提供范例。
引言
由于气候变化导致海洋变暖和酸化，全球珊瑚礁正经历珊瑚物种、种群和遗传多样性的丧失，这削弱了这些关键栖息地的生存能力，并影响其所支持的物种1,2。长期保存遗传资源最有效的方法是冷冻保存与生物样本库技术，该技术可将活体样本在液氮的低温条件下无限期地冷冻储存3。2012年，珊瑚精子冷冻保存技术的建立4首次实现了对这些物种遗传物质的生物保藏，并促成了2012年全球首个珊瑚遗传资源库的建立5。此后，该冷冻保存方案得到进一步优化6，并已用于在全球范围内保存超过50种珊瑚的遗传物质，其中30种来自澳大利亚的大堡礁7。冷冻保存的珊瑚精子能够产生健康且发育正常的珊瑚个体，并已被用于在澳大利亚8和加勒比海地区9开展辅助基因流实验。尽管目前仍在研发可实现复杂组织类型（如幼体10和成体珊瑚组织11,12）冷冻保存的技术，但珊瑚精子的冷冻保存仍是当前可用于常规珊瑚遗传资源保藏的最成熟技术。
随着对珊瑚种群的影响日益加剧，多个国家已启动大规模项目，以支持珊瑚礁恢复与适应（例如澳大利亚的珊瑚礁恢复与适应计划 [RRAP]13），或保护现存濒危的珊瑚种群（例如美国的佛罗里达珊瑚救援计划14）。在这些项目的背景下，冷冻保存可被视为一项支撑性技术，不仅有助于研究和大规模珊瑚繁育，还能保存现有的遗传多样性并防止物种灭绝。珊瑚精子的冷冻保存可实现对地理上或时间上隔离的种群之间繁殖过程的更好控制，并允许对亲本群体进行遗传管理，以筛选出如耐热性或抗病性等优良性状8。迄今为止，珊瑚精子生物库的建设仅在较小规模上开展，主要用于支持生物多样性管理7；因此，若要在更大规模的珊瑚礁恢复项目中充分发挥其潜力，需对生物库建设进行一定程度的扩增。与所有基于珊瑚繁殖的珊瑚礁恢复工作一样，扩大生物库建设的主要障碍在于珊瑚配子可获取的时间极为有限，因为大多数造礁珊瑚的产卵时间集中在春末夏初的满月期间15，这意味着每年仅有数个夜晚可获得用于冷冻保存和生物库建设的配子。此外，在发生大规模同步产卵的区域（例如大堡礁），通常在同一晚或相隔数小时内，多个物种会同时或相继产卵15。因此，有必要优化精子冷冻保存的技术流程，以提高处理规模和效率，从而在每年短暂的产卵窗口期内最大化生物库的储存能力，同时确保样本及其相关元数据的完整性。
珊瑚精子的冷冻保存与生物样本库建设涉及多个关键步骤，从繁殖期配子的采集，到样本入库及进入生物样本库和数据库的编目管理图1）。该过程首先将精子与卵子分离（在雌雄同体物种中）或从水体中收集精子（在雌雄异体物种中），随后评估精子的活力与浓度。接着将精子与冷冻保护剂（终浓度为10% v/v，二甲基亚砜，DMSO）在过滤海水（FSW）中混合，并使用定制设计的降温装置以−20 °C/min的速率进行冷却4早期的该流程版本依赖于对精子活力和浓度的目视评估 通过 相差显微镜与血细胞计数板计数，样品进行冷冻保存时的打印与标记试管，手工移液精子样品至冻存管，以及在特制的漂浮架上冷却16计算机辅助精子分析（CASA）的应用17 以及3D打印冷却装置的开发6 提高了珊瑚精子冷冻保存的效率和可靠性，但自该技术建立以来，精子样本的处理流程基本保持不变。尽管该方法适用于在产卵夜晚处理中等数量的群体和物种样本，但对于大量样本和众多群体（例如，来自多个群体的独立样本） >一次处理10个菌落），在冷冻保存过程中存在瓶颈，阻碍了样本在规定时间内（即精子释放后2小时内）及时处理，从而可能导致样本生育潜力下降。尽管已有适用于冻存管的大规模液体处理系统（例如 Thomas 等人）。18），它们通常设计用于大批量处理（例如，多 racks 的冻存管），不适合在野外运输和使用，因此在此应用中不具备成本效益。因此，本研究旨在通过在处理流程的关键步骤引入便携式、低成本的自动化设备和方法，提高珊瑚精子冷冻保存的效率，以最大化在一次产卵夜晚中能够有效冷冻保存的样本数量。
方案
本文所述方法可用于处理和冷冻保存雌雄同体及雌雄异体珊瑚物种的精子。有关这两种繁殖模式的珊瑚产卵及用于精子冷冻保存的配子采集的总体介绍与基础指南，可参见史密森尼国家动物园的相关资料。 & 保护生物学研究所 珊瑚冷冻保存培训课程19所述方法主要利用配子开发而成 Acropora millepora 从澳大利亚大堡礁的沃帕布拉海区（Woppaburra Sea Country）凯佩尔群岛和宾达尔海区（Bindal Sea Country）戴维斯礁采集的珊瑚群体。所有珊瑚及配子的采集与使用均获得了相关海区传统守护者的自由、事先和知情同意。本研究所用试剂和设备列于下文 材料表.
1. 产卵前——系统检查及精子激活液与冷冻稀释液的制备
- 确认条形码扫描仪已充电、处于激活状态，并设置为以横向单元格输入模式输入电子表格数据。请参考条形码阅读器的用户手册以自定义此设置。
- 为计算机辅助精子分析（CASA）准备珊瑚精子激活用浓缩储备液。
注意：配制激活溶液时，操作化学品应佩戴一次性手套。- 通过将1.5 g牛血清白蛋白（BSA）溶于4 mL无菌纯化组织培养用水中制备30% BSA储备液（5 mL），可使用设定为37 °C的试管加热器或用手掌握住试管辅助溶解，并定期轻轻旋转混匀（切勿振荡试管）。
- 溶解后，用组织培养用水定容至最终体积（5 mL），在试管上标注日期，并标记为“30% BSA in H2O”。
- 置于冰箱（4 °C）中保存，最多可保存2周。
- 通过将0.2913 g咖啡因溶于24 mL过滤海水（FSW）中制备60 mM咖啡因储备液（25 mL）。
- 溶解后，用FSW定容至最终体积（25 mL），在试管上标注日期，并标记为“60 mM caffeine in FSW”。
- 置于冰箱中保存，最多可保存1个月。
注意：咖啡因在FSW中的最大溶解度约为71 mM。
- 为精子样本（浓度约为109 精子/mL）配制精子激活工作液（含0.9% BSA和12 mM咖啡因的FSW溶液）。
- 配制10 mL工作液：将2.0 mL 60 mM咖啡因储备液 + 0.3 mL 30% BSA储备液 + 7.7 mL FSW混合。
- 在试管上标注日期及“精子激活工作液 - 0.9% BSA + 12 mM caffeine”。
- 每日现配现用，室温（19–30 °C）保存，当日使用结束后丢弃未用完的溶液。
- 配制冷冻保护剂溶液（冷冻稀释液）。操作冷冻保护剂DMSO时应佩戴一次性手套。
注意：FSW中冷冻保护剂的浓度根据样本初始精子浓度及所需冻存分装液的最终精子浓度而调整。配制冷冻稀释液时，应先将FSW分装至50 mL离心管中，再加入DMSO。- 在珊瑚产卵前，从珊瑚养殖的水箱系统中采集原海水（盐度约35 ppt）。
- 使用连接真空泵的瓶顶过滤系统，配合0.2 µm无热原膜滤器对原海水进行过滤。
- 当精子浓度 ≥2 × 109 精子/mL时，在50 mL离心管中将10 mL DMSO与40 mL FSW混合，配制20% DMSO in FSW溶液。
- 当精子浓度 <2 × 109 精子/mL时，在50 mL离心管中将15 mL DMSO与35 mL FSW混合，配制30% DMSO in FSW溶液。
- 在试管上标注日期及DMSO浓度，例如“30% DMSO”或“20% DMSO”。
- 每日现配现用，室温（19–30 °C）保存，每日使用结束后丢弃未用完的溶液。
注意：DMSO与FSW混合会产生放热反应，因此冷冻稀释液应提前配制，使其充分冷却至室温。为抵消产热，可将FSW预先储存在4 °C环境中用于配制冷冻稀释液。
- 准备热电偶数据记录仪。
- 为测量每次冻存过程的大致冷却速率，将一个装有10% DMSO in FSW并插入热电偶探针（探针穿过管盖）的冻存管，与精子样本一同放入冻存架的样本槽中。
- 制作热电偶冻存管时，用针刺或熔化法在条形码冻存管盖上开一个小孔，将K型或T型热电偶探针穿过小孔插入。将探针尖端推至适当位置，确保其在冻存管填充后位于样本中央，并保持探针居中，避免接触管壁内侧。用热熔胶密封管盖并固定热电偶探针。
- 佩戴一次性手套，向条形码冻存管中加入与待冻存精子样本体积相等的10% DMSO in FSW溶液。
- 每日新鲜配制10% DMSO in FSW溶液，并每日更换热电偶冻存管中的液体。
2. 精子制备与评估
- 对于雌雄同体物种（例如， 鹿角珊瑚 物种），使用3 mL移液管从水面收集配子团块，放入已标记的50 mL离心管中，配子团块与海水的比例为5 mL配子团块加5 mL海水（总体积10 mL）。
- 对于雌雄异体物种，使用3 mL移液管从接近珊瑚虫口部的位置收集精子，并将样本放入已标记的50 mL离心管中，随后直接进入步骤2.8。
注意：收集和处理配子样本时无需使用一次性手套，但可根据个人偏好选择佩戴。 应彻底洗手 用淡水冲洗，或在每次操作之间更换手套 配子样品以避免交叉污染。 - 对于雌雄同体物种，通过手动轻轻旋转样品，使精卵团块摇动直至分散开。
注意：某些 蒙特普拉 某些物种的卵子含有毒素，因此必须让其在最少搅动的情况下缓慢分解，以避免损伤精子。 - 让样本在试管架中静置2分钟，使卵子上浮至液面，精子沉降到底部（卵子将在液面形成一层粉红色/棕色的膜，单个卵子可见；参见 图 1i).
- 使用干净的3 mL移液管，从管底轻轻抽吸精子，以分离精子并去除污染的卵子。
- 将精子样本转移至100 µ将m细胞筛置于新的无菌50 mL离心管上。样品应能顺利通过滤膜。轻敲滤膜以促进样品滤过，如有必要，可用干净的移液管从滤膜下方收集残留样品。移除滤膜后，将管盖轻轻盖上，以允许气体交换。
- 用菌落编号标记过滤后的精子样本，并将样本转移至精子评估工作站。
- 打开珊瑚生物库自动化数据表文件（补充文件 1在精子评估标签页中，输入珊瑚群体的元数据（A-H列）。
- 准备精子以进行计算机辅助精子分析（CASA）评估。
- 充分混匀精子样品，取出10 µ将L分装至一个空的1.8 mL微量离心管中。
- 立即在10–20秒内逐滴加入0.390 mL精子激活工作液，轻轻混匀使精子充分分散于溶液中。此操作得到1:39（精子:溶液，v/v）的稀释比例（即稀释倍数为40），可提供适用于CASA分析的适宜浓度（约50） × 106/毫升），若原始精子浓度约为2 × 109 精子/mL。在打开管盖前，将离心管颠倒5次，并轻弹管盖，使溶液沉降至管底。
注意：用于计算机辅助精子分析（CASA）的精子浓度应在 8–50 范围内 × 106/mL，以实现精确的精子追踪17必要时可向原始精子分装液中添加更多精子激活工作液以降低浓度。重新计算稀释倍数，并将该数值输入电子表格中。当需同时处理大量样本时，可预先在1.8 mL微量离心管中加入0.390 mL精子激活工作液，并与10 µ将一份精子样品直接加入其中，然后通过倒置试管10次充分混匀× 并在打开管盖前轻弹管盖。
- 使用计算机辅助精子分析（CASA）评估激活样本的精子活力和浓度，方法见Zuchowicz等人的描述。17 通过放置4 µ在Makler计数室中加入L量的激活精子悬液20 或通过相差显微镜下的目视评估和血细胞计数板计数，如 Hagedorn 等人所述。4.
注意：每次取样之间，必须使用70%乙醇彻底清洁Makler计数室和盖玻片，然后用蒸馏水冲洗，并用无絮擦拭纸擦干。 - 输入用于CASA分析的精子稀释倍数，并将CASA输出的精子浓度（百万/mL）、总活力（%）和前向活力（%）录入自动数据表。
注意：可根据需要在自动数据表中额外包含计算机辅助精子分析（CASA）的其他参数，如平均路径速度（VAP）、直线速度（VSL）和曲线速度（VCL），或在后续从保存的CASA文件中提取这些数据。 - 将精子浓度标注在过滤后的精子样本管上，并按照解离和处理的相同顺序将样本转移至冷冻保存工作站。
3. 精子稀释与冷冻保护剂平衡
- 在冷冻保存工作台处，打开与精子评估工作台所使用的同一珊瑚生物样本库自动数据表文件，并选择 冷冻保存 选项卡。核对精子样本管标签，并通过查看群体编号（C列）确认对应条目。若各工作台未同时访问同一自动数据表文件，则需手动将群体编号（C列）和精子浓度（F列）数据输入自动数据表中。
- 使用刻度移液管，通过将样本吸入移液管后重新排回原管的方式测量精子样本体积，并将数值填入E列。
- 查看自动计算的I列，获取所需的冷冻保护剂浓度，以及H列中需添加的冷冻稀释液体积（表1）。
- 启动10分钟计时器，并立即使用刻度移液管逐滴加入冷冻稀释液，同时持续轻柔混匀样本，操作过程中须佩戴一次性手套以处理二甲基亚砜（DMSO）。
- 在P列记录冷冻稀释液的添加时间。
| 精子浓度 | 冷冻稀释液 | 稀释比例（精子:冷冻稀释液） | 精子样本中DMSO的终浓度（%） |
| < 2 × 109/mL | 30% DMSO in FSW | 2:1 | 10% |
| ≥ 2 × 109/mL | 20% DMSO in FSW | 1:1 | 10% |
表1：基于待冻存样品总精子浓度评估的珊瑚精子冻存用冷冻稀释剂浓度及稀释比例。
4. 精子冷冻保存
- 查看第 K 列以确定需要填充的冻存管数量。该数量由精子总体积和每管所需体积（大多数情况下为 1 mL）自动计算得出。在 10 分钟孵育期间，继续执行步骤 4.2 至 4.6。
- 打开无菌条形码冻存管的管盖，并将管盖放置在洁净/无菌的表面上。
- 可选：使用永久性记号笔在每支冻存管上标注运行编号；这有助于在样本入库生物库时快速识别。
- 使用刻度移液管和设定为所需样本体积（1 mL）的分液移液器，将样本分装至未加盖的条形码冻存管中，然后盖上管盖。
- 将一支热电偶管和所有装满样本的冻存管置于室温下的空冻存架上 。确保所有冻存管的条形码面朝外。
- 如有必要，在冻存架的空位中加入额外的含 10% DMSO 的 FSW 假管，以确保所有位置均被占据。
- 将运行编号输入自动数据表（第 U 列），并将冻存架序列号（二维码）扫描至第 V 列。
- 将光标置于第 Z 列的正确单元格中，依次扫描热电偶管以及所有装载在架上的冻存管（从第 AA 列开始）。扫描时避免将冻存架侧放，以防样本进入管口螺纹。
- 扫描过程中，需核对数据是否正确录入对应单元格，并确认所有冻存管均已扫描一次。
- 将已完成装载和扫描的冻存架暂放一旁，继续完成剩余的冷冻保护剂平衡过程，同时准备用于冷冻保存的降温容器。
- 向冻存架降温容器中加入液氮，达到预先设定的适当液位，以实现约 −20 °C/min 的降温速率。
注意：液氮仅可在通风良好的区域使用，以防窒息风险。操作液氮时必须穿戴包趾鞋、护目镜/面罩及低温手套。有关液氮操作和使用的具体信息，请参阅机构相关指南。 - 在 10 分钟冷冻保护剂平衡期结束时，将热电偶探头连接至数据记录仪并开始记录，然后轻柔地将装满样本的冻存架放入降温容器中，并盖上盖子。
- 在第 Q 列记录开始时间。
- 当数据记录仪显示热电偶管温度达到 −80 °C 或更低时，通过将冻存架插入物转移至另一个容器（如聚苯乙烯箱）中的液氮浴中，对样本进行液氮速冻。
- 从冻存架中取出冻存管，并将其转移至干式运输罐，运往生物样本库。
结果
本方案所述步骤基于Hagedorn等人4最初描述的珊瑚精子冷冻保存方法，并结合Zuchowicz等人6后续的优化，对精子处理流程进行了关键性改进，以提高冷冻保存和生物样本库建设的效率。使用条形码冻存管和分液自动移液器，可省去打印和手工标记冻存管的步骤，同时减轻大量样本手工移液的操作负担。尤为重要的是，这些改进将冷冻保存前的样本制备时间从原来的约8至10分钟缩短至5分钟以内。结合计算机辅助精子分析系统（CASA）的使用，这些改进显著减少了高效开展珊瑚精子生物保藏所需的人力，从原始方法所需的4至6人减少到目前方案仅需两人。此外，条形码冻存管的使用使每支冻存管均具有唯一标识符，因而可在数据库中实现比以往采用批量打印标签方法更高精度的样本追踪。
2022年澳大利亚大堡礁珊瑚繁殖季期间，针对该方案在两次产卵事件中进行了实地测试，由两名操作人员（一人负责CASA，一人负责冷冻保存）成功对5个物种共57个珊瑚群体的389份样本进行了冷冻保存和生物保藏，另有一名人员根据需要协助进行精束分离和精子分离。2022年11月，在澳大利亚昆士兰州科诺米岛（北基珀尔岛）的繁殖事件中，两名操作人员在2小时内完成了24个鹿角杯形珊瑚（Acropora millepora）群体共150份样本的冷冻保存。能够高效地处理并冷冻保存如此大量珊瑚群体的样本，主要得益于样本制备时间的显著缩短，以及不同工作站之间元数据传递的简化流程。
2023年12月繁殖季节期间对工作流程的进一步测试确定，对于珊瑚精子而言，Makler计数板相较于商业化的固定盖玻片一次性计数载片（通常与CASA系统联用）能够提供更准确的活力和浓度数据。使用已知浓度的商用乳胶微珠、4 µL样本体积以及珊瑚精子常用的标准化CASA设置17，对Makler计数板在CASA系统中的应用进行了验证。分析结果显示计数结果一致且变异度低（44.5 ± 0.7 million/mL），处于制造商提供的预期浓度范围之内（46.0 ± 7.0 million/mL）（图2）。对使用Makler计数板和固定盖玻片计数载片采集的Acropora millepora的CASA数据进行比较，发现两种计数室类型的精子浓度计数存在显著差异（P = 0.002；图2），其中固定盖玻片计数载片测得的浓度不足Makler计数板测得浓度的一半。该趋势在另外两种珊瑚物种的精子样本中也观察到（数据未显示）。2023年12月的测试还发现，使用1:1稀释比例加20% DMSO或1:2稀释比例（精子：冷冻稀释液）加30% DMSO进行冷冻保存的样本，其解冻后总精子浓度、活动精子浓度及前向活动精子浓度之间均无显著差异（图3）。
图 1：用于珊瑚精子半自动化处理以进行冷冻保存的工作流程，以及野外使用的移动设备示例。（A）以5 mL配子团与5 mL FSW的比例收集珊瑚配子团，并将其分散以分离卵子和精子（i）。将群体元数据录入自动数据表（ii），并使用计算机辅助精子分析系统（CASA）评估分离出的精子样本（iii）。将精子质量参数输入自动数据表，以计算在FSW中添加20%或30% DMSO的量（iv），然后将稀释后的样品分装至带条形码的冷冻管中（v）。将冷冻管装载到冷冻架上，并扫描录入自动数据表（vi），随后以−20 °C/min的速率降温至−80 °C（vii）。接着将样品浸入液氮中快速冷却，并转移至干式运输罐，运送到塔龙加冷冻多样性库（viii）。（B）在科诺米环境教育中心教室内的偏远野外站点设置的CASA（左侧）和冷冻保存（右侧）工作站示例。（C）在澳大利亚海洋科学研究所国家海模拟器中建立的基于实验室的高通量冷冻保存工作站示例，可同时运行多个冷冻架。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：两种不同计数板用于珊瑚精子浓度测量的比较。（A）利用Makler计数室与市售固定盖玻片计数板对Acropora millepora（n = 3个个体）进行总精子浓度测量的比较。柱状图表示均值 ± 标准误（SEM）；星号表示存在显著差异（P = 0.002）。（B）使用已知浓度的市售乳胶微球及珊瑚精子的标准CASA参数对Makler计数室进行验证。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：冻融后冷冻保存样本中总精子、活动精子及前向运动精子的浓度。 使用 FSW 中的 20% 或 30% DMSO 配制终浓度为 10% DMSO 的冷冻保护剂，对冻融后的总精子、活动精子和前向运动精子浓度进行比较。来自 n = 3 个个体的样本各分为两份，其中一份以 1:1 比例加入 20% DMSO 进行冷冻保存；另一份先用 FSW 稀释至 <2 × 109/mL，再以 1:2 比例（精子:冷冻稀释液）加入 30% DMSO 进行冷冻保存。柱状图显示均值 ± 标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件 1：珊瑚生物库自动数据表文件。 请点击此处下载该文件。
讨论
本方案中描述的半自动化处理流程可高效地处理和冻存珊瑚精子，以保存濒危物种的遗传资源，并支持珊瑚礁恢复与适应性保护工作。开发本方案的动因在于，现有的系统无法满足珊瑚精子冻存所需的通量要求，且普遍使用冻存管；而高通量精子冻存系统通常基于0.25 mL或0.5 mL法国细管进行样本包装21,22。相比之下，冻存管通常仅用于小规模低通量处理（例如，为科研目的冻存实验室样本23,24），或在工业级高通量处理系统中使用昂贵且不可移动的设备处理大批量样本（例如，工业级细胞培养处理18,25）。我们还探索了使用自动脱盖系统以简化冻存管盖的移除与更换过程，但现有系统仅适用于单个冻存管或整架冻存管，无法提供具有成本效益的解决方案。目前，全球已有多个研究团队正在采用Hagedorn等人4 开发的冻存方案来保存珊瑚的遗传多样性，这一工作亟需持续扩展至全球更多珊瑚礁区域。因此，在制定本方案时的一个重要考量是，必须采用经济高效且易于获取的技术，使其他团队能够便捷地实施，同时避免对希望开展珊瑚精子冻存的新团队造成过高的经济负担。
所述方案的一个关键组成部分是改进的样本元数据处理方法 通过 在 Microsoft Excel 中链接的电子表格。数据输入通常较为直接，但需注意：对自动数据表中的信息进行编辑时，应通过删除后重新输入的方式完成，而不应使用快捷功能（如 Ctrl + C、Ctrl + V）修改数据，因为此类操作可能影响其他用户的同步输入，并导致电子表格之间数据链接出现问题。一个重要的元数据组成部分是唯一标识符（即菌落 ID），该标识符与供体菌落相关联，并在样品处理全过程的各个阶段附着于样品上。在采集样本束时，必须清晰地标记样品管上的菌落 ID，并在样品转移至新试管时（例如在过滤以分离卵子和精子，或添加冷冻稀释液过程中）准确誊录该信息。尽管本方案支持将样品质量信息从 CASA 操作员自动传输至冷冻保存工作站，但在互联网或 Wi-Fi 信号不佳时可能会遇到问题。若出现数据传输延迟，建议两个工作站离线操作，分别维护各自的自动数据表，待后续再进行数据核对。冷冻保存操作员所需的关键信息为菌落 ID 和样品浓度，因此建议 CASA 操作员将样品浓度手写在样品管上作为备份，以确保在计算机间元数据上传或下载延迟时，该信息仍可随时用于冷冻保存前的准备工作。
本方案所使用的条形码扫描仪和带条形码的冻存管可根据预算和产品供应情况进行选择；但在选型时应考虑一些关键因素。条形码扫描仪应具备自定义设置功能，特别是能够更改数据输入格式和输入方向。本方案所用的自动数据表采用横向输入方式，但在某些情况下（例如样本入库至生物样本库或其他实验室用途）可能需要纵向输入，因此该功能的可定制性至关重要。尽管本方案可兼容一维码和二维码，但仍建议所选冻存管包含可人工识读的信息（例如一维码通常包含唯一编号），以便在冷冻保存过程中核对样本录入信息。除样本录入外，条形码扫描仪还可通过在繁殖前预先生成并打印重复信息（如物种名称、日期和珊瑚礁位置）的二维码，实现部分元数据字段的自动输入。此外，通过为每个冻存架和热电偶探头粘贴序列号条形码，还可将每次冷冻保存操作与数据库中的特定设备组关联，这有助于质量控制，并识别需要维修或更换的组件。
处理过程中的限制因素通常是等待精荚解聚所花费的时间，以及在进行CASA分析和冷冻保存之前过滤并分离精子与卵子所需的时间。在条件允许的情况下，建议按照精荚解聚的顺序处理样本；然而，通过战略性地管理样本处理顺序，还可进一步提高效率。例如，如果由于样本体积较小（即每个群体的精子体积少于3 mL）或精子浓度过低需要以2:1比例加入冷冻稀释液（即浓度低于2 × 109/mL），导致每个群体仅需5个或更少的冻存管时，则建议同时向两个群体的样本中添加冷冻稀释液，使其能够在同一个冷冻架上同时处理（每个冷冻架总共有11个插槽），而不是分别运行并在空位插入占位管。此外，只要确保所有操作能在10分钟的冷冻稀释液平衡时间内完成，就可以同时运行多个冷冻架（适用于体积大于>6 mL的样本），从而进一步提高样本处理通量。然而，在同时运行多个冷冻架或将多个群体的样本合并至同一冷冻架时，必须特别注意在自动数据表中将冷冻保存的元数据正确分配给对应的样本，尤其是在样本的冷冻保存顺序与其CASA分析顺序不一致的情况下。
除了半自动化工作流程的开发外，本实验方案还提供了两项与精子浓度相关的方法学比较，旨在改进精子分析和冷冻保存的效果。通常，将5 mL配子团块收集到5 mL海水之上（总体积为10 mL）所获得的精子浓度将达到或超过2 × 109 个细胞/mL；但由于物种差异或收集过程中团块破裂，有时精子浓度可能较低。使用较高浓度的DMSO冷冻稀释液（30% v/v）可减少精子稀释倍数，从而有助于降低冷冻管间精子浓度的批间差异。重要的是，使用30% DMSO以达到最终DMSO浓度，并不会影响解冻后的精子浓度或运动参数，如图3中的代表性数据所示。第二项方法学比较为通常用于CASA分析的一次性固定盖玻片腔室载片提供了一种替代方案。使用市售载片分析珊瑚精子的主要问题是，精子可能黏附于载片涂层，从而影响运动能力评估的准确性。尽管在多数样本中可通过激活液克服这一问题，但并非所有样本均有效，因此仍建议使用普通载片进行独立的CASA运动分析，以确保结果的可靠性和一致性。使用Makler计数板可避免分别测定浓度和运动能力的需求，并可能提高浓度测量的准确性（图2），因此推荐在本方案中使用。鉴于浓度测定结果存在此类差异——此前已有报道20——在数据库中记录精子质量数据的同时，必须始终注明所用载片的具体信息，并尽可能保持所用腔室载片类型的统一，以减少批间差异，并确保受精过程中精子与卵子比例计算的可靠性。
本文所述的半自动化流程为濒危珊瑚物种精子的冷冻保存和生物样本库建立提供了标准化且高效的途径，同时确保了样本的生物安全性和质量。该方案易于推广，且在全球范围内实施成本相对较低，适用于各国开展利用冷冻保存技术保护现有珊瑚多样性的项目。这一技术对于防止物种灭绝、以及最大限度地为当前和未来的珊瑚礁修复工作提供资源至关重要。
披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
我们感谢昆诺米（Konomie）的传统所有者——沃帕布拉（Woppaburra）人民，允许我们在2022年11月于当地开展本文所述系统的繁殖试验；同时感谢昆诺米环境教育中心提供其设施的使用。我们还要感谢澳大利亚海洋科学研究所的工作人员和科学家，他们协助在国家海洋模拟器内完成了珊瑚群体的采集与产卵工作。本研究是珊瑚礁修复与适应计划中低温保存子项目（RRAP-CP-01）的一项活动，该计划由澳大利亚政府珊瑚礁信托基金与大堡礁基金会合作开展，并得到塔龙加保护协会澳大利亚分会、塔龙加保护科学倡议以及支持塔龙加基金会的其他慈善人士的额外资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ovation ALI-Q 2 VS 移液控制器 - 分液移液管 | Vistalab | 2100-1005 | 液体操作 – 精确测量精子体积、添加冷冻保护剂溶液、将样品分装至冻存管 |
| 5 mL 血清移液管（散装） | Thermo Scientific | Nunc 170355 | 液体操作 – 精确测量精子体积、添加冷冻保护剂溶液、将样品分装至冻存管 |
| 10 mL 血清移液管（散装） | Thermo Scientific | Nunc 170356 | 液体操作 – 精确测量精子体积、添加冷冻保护剂溶液、将样品分装至冻存管 |
| P2 0.2–2 µL 移液器 | Gilson | F144054M | 精子激活溶液的配制及用于浓度和活力评估的精子样品处理 |
| P10 1–10 µL 移液器 | Gilson | F144055M | 精子激活溶液的配制及用于浓度和活力评估的精子样品处理 |
| P20 2–20 µL 移液器 | Gilson | F144056M | 精子激活溶液的配制及用于浓度和活力评估的精子样品处理 |
| P200 20–200 µL 移液器 | Gilson | F144058M | 精子激活溶液的配制及用于浓度和活力评估的精子样品处理 |
| P1000 100–1000 µL 移液器 | Gilson | F144059M | 精子激活溶液的配制及用于浓度和活力评估的精子样品处理 |
| 真空泵 | Millipore | WP6122050 | 用于溶液配制前过滤海水的制备 |
| 可重复使用的瓶顶过滤系统 | Thermo Scientific | DS0320-5045 | 用于溶液配制前过滤海水的制备 |
| 0.22-µm 混合纤维素酯滤膜圆片 | Merck Millipore | GSWP04700 | 用于溶液配制前过滤海水的制备 |
| 过滤海水 | N/A | – | 精子激活溶液和冷冻保护剂溶液的基础培养基 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D4540 | 用作冷冻保护剂化学品，在过滤海水中终浓度为10%（v/v），用于精子冷冻保存 |
| 咖啡因 | Sigma-Aldrich | C0750 | 用于激活精子运动能力 |
| BSA 热激组分 | Sigma-Aldrich | A9647 | 用于减少精子在CASA检测板上的黏附 |
| 15-mL 带架离心管 | Thermo Scientific | 339651 | 用于精子激活溶液的配制 |
| 50-mL 带架离心管 | Thermo Scientific | 339653 | 用于收集配子团块和过滤后的精子样品 |
| 移液吸头 | Thermo Scientific | Samco 202PK | 辅助从水面收集配子团块 |
| 100-µm 过滤篮 | Fisher Scientific | 22363549 | 在分离精子样品时排除卵子 |
| Eppendorf 管架 | Interpath | 511029 | 用于精子稀释和激活，以进行浓度和活力评估 |
| Eppendorf 1.5-mL 离心管 | Eppendorf | 30120086 | 用于精子稀释和激活，以进行浓度和活力评估 |
| 18x18 mm 玻璃盖玻片 | Brand | 4700 45 | 使用相差显微镜评估精子浓度和活力 |
| 普通载玻片，预清洁，75x25 mm | Corning | 2947 | 使用相差显微镜评估精子浓度和活力 |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 1492 | 使用相差显微镜评估精子浓度和活力 |
| CASA 检测板（Leja 20-µm 4 孔，SC-20-01-04-B） | IMV Technologies | 025107 | 使用计算机辅助精子分析（CASA）评估精子浓度和活力 |
| Makler 精子计数室（CASA） | IVFStore | SM-373 | 使用计算机辅助精子分析（CASA）评估精子浓度和活力 |
| accu-bead® 计数微珠 | Hamilton-Thorne | 710111 | 使用计算机辅助精子分析（CASA）评估精子浓度和活力 |
| CASA 系统 + 笔记本电脑 | Hamilton Thorne | Ceros II | 使用计算机辅助精子分析（CASA）评估精子浓度和活力 |
| 护目镜 | 通用型 | – | 操作 DMSO 和液氮时的个人防护装备 |
| 实验服 | 长袖、全长 | – | 操作 DMSO 和液氮时的个人防护装备 |
| 冷冻手套（成对） | Tempshield | 中臂长度 | 操作 DMSO 和液氮时的个人防护装备 |
| 中型镊子 | 通用型 | – | 用于从冻存架中取出冷冻保存样品，并在液氮中操作样品 |
| 条形码扫描仪（支持二维码） | Zebra | DS2278 | 用于读取冻存管上的一维和二维条形码，实现样品管理 |
| 2.0-mL 冻存管，外螺纹，预盖帽，带 2D SafeCode（DataMatrix/ECC200），线性和人可读格式 | Eppendorf | 30079434 | 带条形码的冻存管，用于精子样品的冷冻保存 |
| 冻存管架 | Simport | T315 | 用于放置冻存管的架子，带锁定底座，可单手开盖和盖盖 |
| 冷冻架 | 定制 | – | 专为珊瑚精子冷冻保存设计的定制系统，采用3D打印和现成组件。零件清单和组装说明详见 Zuchwicz 等，2021（doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005） |
| 冷冻架盖 | 定制 | – | 专为珊瑚精子冷冻保存设计的定制系统，采用3D打印和现成组件。零件清单和组装说明详见 Zuchwicz 等，2021（doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005） |
| 冷冻保温瓶 – 1.5 升 18/8 不锈钢双层真空食品容器 | Isosteel | VA-9683 | 专为珊瑚精子冷冻保存设计的定制系统，采用3D打印和现成组件。零件清单和组装说明详见 Zuchwicz 等，2021（doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005） |
| 实验室计时器 | 通用型 | – | 用于冷冻保存前冷冻保护剂平衡时间的计时 |
| 9L 氮气浴 | BelArt | M16807-9104 | 用于冷冻保存过程中样品的淬灭，以及样品分选和操作期间的存放 |
| 多通道热电偶数据记录仪 | Omega | HH520 | 冷冻保存过程中的温度监测，用于确定冷冻速率和终点 |
| 热电偶探头 – K 型 | Omega | 5SC-TT-K-30-36 | 冷冻保存过程中的温度监测，用于确定冷冻速率和终点 |
| 冷冻笔/彩色永久性记号笔 | Staedtler Lumocolor | 318 | 可选，用于标记冻存管盖，辅助样品管理 |
| 干式运输罐 - 已充液氮 | Taylor Wharton | CXR100 或 CX500 | 用于将冷冻保存的样品从野外/采集点转运至生物样本库进行长期储存 |
参考文献
- Eakin, C. M., Sweatman, H. P. A., Brainard, R. E. The 2014-2017 global-scale coral bleaching event: Insights and impacts. Coral Reefs. 38 (4), 539-545 (2019).
- Anthony, K., et al. New interventions are needed to save coral reefs. Nature Ecology & Evolution. 1 (10), 1-3 (2017).
- Wildt, D. E. Genome resource banking for wildlife research, management, and conservation. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 41 (4), 228-234 (2000).
- Hagedorn, M., et al. Preserving and using germplasm and dissociated embryonic cells for conserving Caribbean and Pacific coral. PLoS ONE. 7 (3), e33354(2012).
- Hagedorn, M., et al. First frozen repository for the Great Barrier Reef coral created. Cryobiology. 65 (2), 157-158 (2012).
- Zuchowicz, N., Daly, J., Lager, C., Williamson, O., Hagedorn, M. Freezing on the beach: A robust coral sperm cryopreservation design. Cryobiology. 101, 135-139 (2021).
- Hobbs, R. J., et al. A decade of coral biobanking science in Australia - transitioning into applied reef restoration. Frontiers in Marine Science. , 9(2022).
- Daly, J., et al. Cryopreservation can assist gene flow on the Great Barrier Reef. Coral Reefs. 41, 455-462 (2022).
- Hagedorn, M., et al. Assisted gene flow using cryopreserved sperm in critically endangered coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (38), e2110559118(2021).
- Daly, J., et al. Successful cryopreservation of coral larvae using vitrification and laser warming. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
- Daly, J., et al. The first proof of concept demonstration of nanowarming in coral tissue. Advanced Sustainable Systems. , (2023).
- Powell-Palm, M. J., et al. Cryopreservation and revival of Hawaiian stony corals via isochoric vitrification. Nature Communications. 14, 4859(2023).
- Reef Restoration and Adaptation Program. , Available from: https://gbrrestoration.org (2023).
- Florida Coral Rescue. , Available from: https://myfwc.com/research/habitat/coral/disease/rescue (2023).
- Harrison, P. L. Coral reefs: An ecosystem in transition. , Chapter 6 59-85 (2011).
- Hagedorn, M., Carter, V. L. Cryobiology: Principles, species conservation and benefits for coral reefs. Reproduction, Fertility and Development. 28 (8), 1049(2016).
- Zuchowicz, N., et al. Assessing coral sperm motility. Scientific Reports. 11, 61(2021).
- Thomas, D. Evaluation of an automated cryovial dispensing system for cell banking. Genetic Engineering & Biotechnology News. 37 (17), 22-23 (2017).
- Coral cryopreservation training course. , Available from: https://nationalzoo.si.edu/center-for-species-survival/coral-cryopreservation-training-course (2023).
- Bailey, E., et al. Validation of sperm counting methods using limits of agreement. Journal of Andrology. 28 (3), 364-373 (2007).
- Hu, E., Yang, H., Tiersch, T. R. High-throughput cryopreservation of spermatozoa of blue catfish (Ictalurus furcatus): Establishment of an approach for commercial-scale processing. Cryobiology. 62 (1), 74-82 (2011).
- Pickett, B. W., Berndtson, W. E. Preservation of bovine spermatozoa by freezing in straws: A review. Journal of Dairy Science. 57 (11), 1287-1308 (1974).
- Westbrook, C. E., Daly, J., Bowen, B., Hagedorn, M. Cryopreservation of the collector urchin embryo, Tripneustes gratilla. Cryobiology. 15, 104865(2024).
- Maria, A. N., et al. Use of cryotubes for the cryopreservation of Tambaqui fish semen (Colossoma macropomum). Cryobiology. 70 (2), 109-114 (2015).
- Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreservation & Biobanking. 21 (1), 106-110 (2023).
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