在活体Caenorhabditis elegans中通过荧光显微镜优化内源性货物轴突运输的可视化

摘要

本文描述了优化荧光显微镜成像参数的方法，以在活体线虫中以单神经元分辨率观察内源性标记货物的轴突运输过程。

摘要

轴突运输是将轴突蛋白从神经元胞体内的合成部位运送至其在轴突中目的地的先决条件。因此，轴突运输功能的丧失会损害神经元的生长与功能。研究轴突运输有助于加深我们对神经元细胞生物学的理解。随着CRISPR Cas9基因组编辑技术的近期进展，对轴突运输货物进行内源性标记已成为可能，从而能够突破基于异位表达的运输可视化方法的局限。然而，内源性标记常伴随信号强度较低的问题，因而需要优化策略以获得可靠的数据。本文介绍了一种通过讨论成像参数和漂白方法来优化轴突运输可视化的实验方案，以增强内源性标记货物的信号，降低弥散性胞质背景的干扰。我们以绿色荧光蛋白（GFP）标记的RAB-3标记突触小泡前体（SVPs）为例，应用该方案优化Caenorhabditis elegans (C. elegans)中内源性标记轴突货物的可视化效果，阐明精细调整成像参数如何提升对内源性标记轴突货物的分析质量。

引言

在生物体的一生中，神经元依赖轴突运输将蛋白质、脂质及其他分子从胞体运送至轴突内的最终目的地。因此，轴突运输功能的受损会导致神经元功能丧失，并常参与神经退行性疾病的病理过程^1,2。因此，阐明轴突运输背后的机制具有重要意义。

数十年来对轴突运输的研究揭示了介导该过程的分子机制、其组成成分以及调控机制的许多重要见解。长距离轴突运输发生在微管细胞骨架上，微管细胞骨架由部分重叠的微管多聚体构成，这些微管在轴突中通常以正端朝外的方式排列³。因此，顺向运输由朝向微管正端运动的马达蛋白——驱动蛋白（kinesins）介导，而逆向运输则依赖于朝向微管负端运动的驱动动力蛋白（dynein）。尽管运输的许多方面已被阐明，但对于许多轴突蛋白而言，它们如何被装载到运输机制中、单个运输囊泡如何组织，以及该运输过程如何被调控，目前仍不清楚³。

轴突运输最初通过放射性标记实验进行研究，其中将放射性标记的氨基酸注入胞体区室，使其整合到新生的内源性蛋白质中，随后可通过放射自显影技术在轴突区室中随时间追踪这些蛋白质⁴尽管放射性标记实验允许研究内源性蛋白质的轴突运输 体内，无法直接追踪....

方案

有关如何培养和制备线虫用于活细胞成像的详细实验方案，请参考 S.Niwa 的研究⁷。

1. 线虫品系的构建

除了构建线虫品系外，秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）⁸ 还拥有一个不断扩增的线虫品系库，其中包含内源性荧光标记蛋白的品系，可直接从其网站获取。

1. 荧光标记策略的选择
   1. 使用线虫品系 MTS1161，该品系含有 rab-3(ox699) 等位基因⁶，以在 DA9 运动神经元中可视化内源性 GFP 标记的 RAB-3 蛋白（该品系将提交至 CGC）。若需可视化其他轴突蛋白，可使用 Mello 实验室的 CRISPR Cas9 编辑方案⁹构建表达内源性标签蛋白的线虫品系。
      注意：MTS1161 利用一种重组方法，在特定细胞中以内源性方式用 GFP 标签标记 RAB-3⁶。另一种常用方法是基于分裂荧光蛋白的重组，对于表达水平特别低的蛋白推荐使用该方法，因为它利用多个分裂荧光蛋白拷贝，使每个内源性蛋白对应的荧光信号拷贝数增加

结果

模型系统与测量步骤概述
为了可视化突触小泡前体的轴突运输过程，我们追踪了内源性GFP标记的RAB-3。本文使用了一种近期构建的GFP::Flip-on::RAB-3品系⁶，该品系在细胞特异性启动子（glr-4p）驱动下表达重组酶Flippase，从而对DA9运动神经元中的内源RAB-3进行标记。DA9是一种双极性运动神经元，其胞体位于动物腹侧后部，靠近肛门区域（图1A）。该神经元具有一条较短的树突，沿腹侧神经索向前延伸；另有一条较长的轴突，向后延伸，形成一条连合支，随后沿背侧神经索向前走行，在此沿途形成突触，支配背侧肌肉和VD神经元^22,23,24。我们在非突触区域观察轴突运输过程；大多数运输事件可通过单一焦平面捕捉（图1A）。.......

讨论

该方法的局限性及替代方法
在本实验方案中，我们优化了成像参数，以观察内源性标记的 RAB-3 的轴突运输过程，该蛋白与突触小泡前体相关。为了实现 RAB-3 的可视化，我们采用了近期发表的 FLIP-on::GFP::RAB-3 菌株⁶，并在细胞特异性启动子（glr-4p）驱动下表达重组酶 Flippase²⁵。该策略使我们能够使用单个 GFP 荧光蛋白对 RAB-3 进行标记。由于 RAB-3 表达水平较高，并且在突触小泡前体上高度富集，因此其信号较强，个体运输事件可在较低的细胞质背景信号之上清晰可见，因而较易观察。其他轴突蛋白可能需要在显微成像参数之外进一步优化标记策略，才能实现运输事件的可视化。特别是对于低表达蛋白，分裂 GFP（split-GFP）系统提供了一种极佳的替代方案。在该系统中，将 GFP₁₁ 插入目标蛋白的内源基因位点，同时由细胞特异性启动子驱动表达 GFP_1-10。该系统的一大优势在于，所需插入基因组的 DNA 修复模板尺寸较小（约.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539
盖玻片（22 mm × 22 mm，No.1）；Gold Seal 盖玻片	Thomas Scientific	6672A14
左旋咪唑	ChemCruz	sc-205730
显微镜：Nikon Ti2 倒置显微镜，Yokogawa CSU-W1 SoRa 扫描头，Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS 相机，Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA 油浸物镜，Nikon 488 nm 光刺激扫描系统，配备 ET525/36 发射滤光片	尼康		转盘共聚焦显微镜
NIS-elements AR	尼康		尼康 Ti2 软件
普通预清洁显微镜载玻片	赛默飞世尔科技	420-004T
<强>线虫品系	标识符	来源
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II)；shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2；odr-1p::RFP) (II)	Park 等（DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052）	MTS1161	将存入 CGC（https://cgc.umn.edu/）