通过荧光显微镜优化活体秀丽隐杆线虫中内源性货物轴突运输的可视化

Summary

该论文描述了荧光显微镜采集参数的优化，以可视化活线虫中内源性标记货物在单神经元分辨率下的轴突运输。

Abstract

轴突运输是将轴突蛋白从神经元细胞体内的合成位点递送到轴突中的目的地的先决条件。因此，轴突运输的丢失会损害神经元的生长和功能。因此，研究轴突运输可以提高我们对神经元细胞生物学的理解。随着 CRISPR Cas9 基因组编辑的最新改进，轴突货物的内源性标记已经变得触手可及，从而能够超越基于异位表达的运输可视化。然而，内源性标记通常以低信号强度为代价，并且需要优化策略来获得可靠的数据。在这里，我们描述了一种通过讨论采集参数和漂白方法来优化轴突运输可视化的方案，以改善弥漫细胞质背景上内源性标记货物的信号。我们应用我们的方案来优化由绿色荧光蛋白 （GFP） 标记的 RAB-3 标记的突触小泡前体 （SVP） 的可视化，以强调微调采集参数如何改善 秀丽隐杆线虫 （C. elegans） 中内源性标记轴突货物的分析。

Introduction

在整个生命中，神经元依靠轴突运输将蛋白质、脂质和其他分子从细胞体输送到它们在轴突中的最终目的地。因此，轴突运输受损与神经元功能丧失有关，并且通常与神经退^{行性疾病的}病理学有关^1,2。因此，了解轴突运输的基础机制非常有趣。

几十年来对轴突运输的研究揭示了对介导这种运输的分子机制、它们的组成以及调节机制的许多重要见解。长距离轴突运输发生在微管细胞骨架上，微管细胞骨架由部分重叠的微管聚合物组成，这些微管聚合物通常在轴突中以正端为导向³。因此，顺行运输是由运动蛋白介导的，这些运动蛋白走到微管的正端，即驱动蛋白，而逆行运输取决于负端定向动力蛋白运动。尽管已经揭示了运输的许多方面，但对于许多轴突蛋白，它们如何被装载到运输机械中，各个运输包裹是如何组织的，以及这种运输是如何调节的，仍然不清楚³。

轴突运输最初是在放射性标记实验中研究的，其中放射性标记的氨基酸被注射到体细胞区室中，在那里它们被掺入新生的内源性蛋白质中，并且可以通过放射自显影在轴突区室中随着时间的推移进行追踪⁴。尽管放射性标记实验允许研究体内内 源性蛋白质的轴突转运，但它不允许直接跟踪单个货物的行为以获得机制见解⁴。使用荧光显微镜克服了这一限制。然而，轴突转运通常不是在内源性蛋白质上可视化的，而是通过荧光标记拷贝的表达来实现的。特别是对于低表达蛋白质，过表达提供了更高的信号强度，这使得可视化成为可能，最好是具有单个神经元分辨率。此外，荧光标记蛋白的异位表达规避了基因组编辑的需求和挑战。相反，有人认为异位表达的货物的行为可能与内源性货物的行为不同⁵。

基因组编辑的最新改进使内源性标记策略更容易获得。因此，较低的信号强度已成为通过异位表达而不是内源性标记来研究货物轴突运输的主要限制。仔细考虑内源性标记策略并优化采集条件可以克服这一挑战。

线虫为研究 体内 轴突运输提供了一个很好的研究模型，因为它们具有透明度和易于遗传操作。在该协议中，我们描述了一种研究策略，以可视化活秀 丽隐杆线虫 中具有单神经元分辨率的内源性蛋白质的轴突转运。我们使用 Jorgensen 实验室⁶ 产生的菌株可视化突触小泡前体的轴突转运，其中囊泡相关的 RAB GTP 酶 RAB3 在运动神经元 DA9 中用 GFP 内源性标记。通过询问不同采集参数和光漂白的微小适应如何改善单个传输事件的可视化，该协议提供了有关如何优化成像条件的想法。

Protocol

有关如何维护和准备用于活细胞成像的线虫的详细方案，请参阅 S.Niwa ⁷ 的工作。

1. 蠕虫菌株产生

除了生成线虫菌株外，Caenorhabditis 遗传学中心 （CGC）⁸ 还包含越来越多的线虫菌株，这些线虫菌株具有内源性荧光标记的蛋白质，可以直接从其网页获得。

1. 荧光标记策略的选择
   1. 使用含有 rab-3（ox699） 等位基因⁶ 的线虫菌株MTS1161在 DA9 运动神经元中可视化内源性 GFP 标记的 RAB-3（菌株将沉积在 CGC 处）。为了可视化其他轴突蛋白，使用 Mello Lab⁹ 的 CRISPR Cas9 编辑方案生成具有内源性标记蛋白的线虫菌株 9.
      注:MTS1161利用重组方法用 GFP 标签⁶ 特异性地标记 RAB-3 内源性。一种常见的替代方法是基于分裂荧光蛋白的重构，建议用于特别低表达的蛋白质，因为它通过使用多个分裂荧光拷贝来增加每个内源性蛋白的荧光拷贝数¹⁰。拷贝数最初可以根据 CenGen 网页 （https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/） ¹¹ 中的转录组数据集进行估计。
2. 选择神经元来可视化轴突运输
   1. 在菌株MTS1161中，可视化运动神经元 DA9 中的 RAB-3（参见 图 1）。对于其他轴突货物，尤其是低表达蛋白质，使用 CenGen 网页确定分析蛋白质表达水平最高的神经元。
      注:CenGen 项目 （cengen.org） 提供了一个很好的在线资源，可以根据涵盖秀丽隐杆线虫神经系统所有 302 个神经元的大型转录组数据集来估计线虫许多神经元中感兴趣蛋白质的表达水平^12,13。

2. 蠕虫处理和成像准备

1. 将线虫维持在线虫生长培养基平板上的细菌（菌株:OP50）草坪上，并在20°C下生长至1日龄至成年期进行成像。
   注意:在确定的年龄阶段测量轴突运输很重要，因为运输速率随着不同轴突货物、神经元类别和生物体的衰老而持续下降 14,15,16,17,18-线虫在幼虫阶段 L4 或成年后 1 天已被用于大多数论文，因此提供了最大的数据集进行比较。
2. 准备用于活细胞成像的线虫:使用立体显微镜执行所有后续步骤，以观察和处理蠕虫。
   1. 使用铂丝镐将线虫转移到 0.5 mM 左旋咪唑的液滴中，并将线虫在液滴中孵育 20 分钟。
   2. 使用发镐将左旋咪唑液滴中的 10-20 条线虫小心地封印在载玻片上的 10% 琼脂糖（溶于 M9 培养基）贴片上的 12 μL M9 培养基液滴中。有关如何制备 10% 琼脂糖贴剂的详细程序，请参阅 S.Niwa⁷ 的方案。
      注意:安装少量线虫就足够了，因为在动物开始缺氧之前，每张载玻片只会对少数动物进行成像。
   3. 将盖玻片放在液滴顶部（22 mm x 22 mm 或 18 mm x 18 mm）。为了在 DA9 轴突中成像运输，将轴突放置在靠近盖玻片的位置。为此，将盖玻片放在琼脂贴顶部后将盖玻片旋转 45°，以将动物卷到背上。
   4. 用粘性凝胶（如凡士林）密封盖玻片和载玻片之间的空间。这将防止琼脂糖贴片干燥，这会导致线虫漂出成像视野。
      注意:尽可能温柔地对待动物至关重要。过高浓度的左旋咪唑或对蠕虫的物理损伤会损害轴突运输。在成像过程中尾巴的轻微抽搐是动物保持健康状态的好兆头。动物保持健康，甚至可以在成像后从琼脂糖斑片中恢复。

3. 活细胞显微镜

注意:显微镜之间的确切采集参数值可能不同。但是，每个采集参数的趋势应与所使用的显微镜无关。在该方案中使用了配备有单独激光线用于漂白的旋转盘共聚焦显微镜（有关显微镜的详细信息，请参见 材料表 ）。绿色荧光由 488 nm 激光激发，发射由 ET525/36 发射滤光片过滤。使用 488 nm 激光线进行漂白。

1. 确保房间的温度或温控舞台（如果有）设置为恒定温度。对于线虫，将温度设置为 20 °C。
2. 安装载玻片并使用放大倍数为 4x-20 倍的物镜定位载玻片上的线虫并记住位置。切换到 63 倍放大倍率镜头进行图像采集。
3. 拍摄单张图像以检查初始采集参数。使用采集软件的强度直方图跟踪视野中的信号强度。强度值应覆盖摄像机可以检测到的最大信号的最低三分之一。避免像素饱和。如果信号强度太低，请增强激发激光的强度。
   注意:不要使用太高的激发激光强度，因为它会在延时过程中漂白荧光蛋白。
4. 在此处更改采集参数和步骤以优化荧光信号检测。
   1. 实施漂白步骤:使用 488 nm 激光（功率:15 mW）线漂白要分析的轴突区域进行漂白步骤。目标是至少 90% 的漂白效率。通过比较漂白步骤前后区域的信号强度来确定漂白效率。
      注:漂白通过降低来自静止颗粒的信号以及来自背景中蛋白质的细胞质部分的信号来增强移动颗粒的信号。膜货物，例如突触小泡前体上的 RAB-3 具有较低的细胞质分数，因此漂白步骤仅温和地改善了细胞质背景上运输包的信号（图 2A，D）。然而，漂白改进了对较长距离的单个运输事件的追踪，并允许量化暂停时间（图 2A）。
   2. 像素合并:使用 2 x 2 像素合并来增强单个走带控制事件的信号强度。像素合并将像素数组合并为一个较大的像素。这将降低空间分辨率，但增强单个传输事件的信号强度，并且对暗淡的粒子特别有用（图 2B、D）。
   3. 曝光时间:增强曝光时间以增强信号强度。增强曝光时间会增加样本的信号强度，从而为传输事件获得较低的时间分辨率。对于这里的实验，在连续时间点（100-500 毫秒曝光时间）之间使用 300 毫秒到 700 毫秒的时间分辨率来跟踪 RAB-3 的单个运输事件。（图 2C，D）
5. 延时记录:根据蛋白质的信号强度以及单个运输事件的频率，至少进行 1-3 分钟的延时摄影。记录到延时后，移动到下一只动物。载玻片上的动物成像时间不应超过 30 分钟，以确保记录的动物处于健康状态。
   注意:在录制过程中，动物尾巴的轻微抽搐表明动物还活着。

4. 分析轴突传输数据

注意:使用 ImageJ/Fiji¹⁹ 进行后续图像分析步骤。斐济能够通过所有常见的显微镜软件包读取数据。

1. Kymograph 生成
   1. Import data（导入数据）:将延时数据文件导入 Fiji。如果无法将数据导入斐济，请从软件包中将时间记录导出为 tiff 文件，然后加载到斐济。
   2. 漂移校正:检查动物/轴突段在图像采集过程中是否移动或轻微漂移。通过运行插件 StackReg²⁰ 来纠正动物移动或漂移。运行插件时，选择 Rigid Body （刚体 ） 变换。
   3. 手动生成运动记录仪: 图 3 提供了详细的分步过程。利用漂移校正电影生成运动图。使用分割线工具，通过在分割线图标上双击鼠标左键来调整线宽以匹配轴突直径，以沿将要分析的轴突段绘制一条线。运行 ImageJ/Fiji 插件 Kymoreslicewide 以生成 kymograph 并在其参数设置中使用整个线宽的最大强度值。
      注意:保持画线方向的一致性（例如，始终靠近远端轴突或反向）简化了运动记录仪中向后移动方向的追踪。
2. 传输参数分析
   1. 按照后续步骤，从 kymograph 计算传输参数:事件编号、速度、运行长度和暂停持续时间。
      1. 在 Kymograph 中跟踪传输事件:使用 Straight Line 工具跟踪 Kymograph 上的单个传输事件。将每条线保存到 ROI 管理器中，并跟踪 kymograph 中的所有传输事件。在 ImageJ/Fiji 中选择以下测量参数:面积、边界矩形、平均灰度值、费雷特直径。
      2. 计算传输参数:将结果表粘贴到电子表格中，并使用结果部分的以下列进行计算:
         运行长度:将宽度（以像素为单位）乘以相机的分辨率（例如，x μm/pxl）以确定以 μm 为单位的运行长度。
         Velocity:运行长度/运行持续时间。要确定移动事件的持续时间（以秒为单位），请将高度（以像素为单位）乘以连续时间点之间的采集时间（例如，x s/像素）。
         暂停时间:在速度为 0 的两个连续动作之间运行持续时间。
         事件编号:事件总数可以标准化为运动量计的总长度，以确定每分钟的事件数和轴突长度段。事件可进一步分为顺行和逆行运输事件。要确定每个移动事件的方向性，请使用 Feret Angle 工具。在最初通过绘制从近端到远端的分段线生成的运动记录仪中，运动记录仪中的顺行运输事件是从右向左指向的，90° 的费雷特角<表示顺行，>90° 表示逆行事件，否则相反。

Results

模型系统和测量程序概述
为了可视化突触小泡前体的轴突转运，我们追踪了内源性 GFP 标记的 RAB-3。在这里，我们利用了最近生成的 GFP::Flip-on::RAB-3 菌株⁶，其中重组酶 Flippase 在细胞特异性启动子 （glr-4p） 下的表达标记了 DA9 运动神经元中的内源性 RAB-3。DA9 是一种双极运动神经元，其细胞体位于动物腹侧的后部，靠近肛门（图 1A）。它包含一个沿腹侧神经索向前延伸的短树突和一个向后延伸的长轴突，形成一个连合，然后沿着背神经索向前延伸，在那里它形成支配背肌和 VD 神经元的突触 22,23,24。我们可视化突触区域的轴突运输;大多数传输事件可以用单个焦平面捕获（图 1A）。实施初始光漂白步骤以减少该区域中静止囊泡的背景，这些囊泡通常倾向于在该区域暂停（图 1B）。在 3 分钟内录制延时视频，并将沿突触区域的 RAB-3 信号绘制到运动记录仪中以提取单个运输事件（图 1C）。

调整采集参数以优化轴突传输可视化
为了克服许多内源性荧光标记蛋白的低信号强度，需要优化显微镜的采集参数。为了对运输事件进行稳健的定量分析，单个运输事件的信号强度需要在细胞质背景或暂停的静止货物上尽可能明亮。突触小泡前体通常在不同囊泡池中的突触区域暂停，这会干扰对新进入囊泡的检测，并使其难以跟踪其运输轨迹⁷。

单个初始荧光漂白步骤可以强烈减少来自囊泡池的荧光信号，以增强对新进入囊泡的运动检测（图 2A）。漂白步骤仅略微增强了 RAB-3 囊泡在细胞质背景强度上移动的信号，这可能是因为 RAB-3 的细胞质分数非常低（图 2D）。

使用像素合并提供了一个额外的层，通过将像素数组合并为单个像素来改善单个传输事件背景上的信号。2 x 2 像素合并将使空间分辨率减半（此处从 108.33 nm/像素到 216.7 nm/像素），这仍然足以追踪单个 RAB-3 传输粒子（图 2B），但大大提高了单个囊泡的信号强度（图 2D）。除非需要非常高的空间分辨率，否则还可以应用分箱来可视化许多其他轴突货物。

接下来，我们询问了曝光时间的变化如何提高单个传输事件的信号强度。我们特别在分析中包括了曝光时间，以证明长达 500 毫秒的曝光时间，后续成像时间点之间为 700 毫秒，仍然可以提供可以跟踪突触小泡前体的时间分辨率（图 2C，D）。

使用 Fiji 生成和分析运动量计
要生成 kymograph 并分析单个传输事件，请按照 图 3 中的步骤进行操作。

图 1:可视化内源性荧光 RAB-3 轴突转运的模型系统概述。 （A） 上面板:线虫概述，指示后-前轴和腹-背轴。运动神经元 DA9 标记为蓝色。中间面板:放大上面板中显示的框状区域，并指示 DA9 区间。En passant 突触以绿色表示，* 表示肛门。请注意，轴突继续在背神经索中，直到它通过外阴。红框表示突触区的区域。下图:单焦平面中近端轴突中内源性 GFP 标记的 RAB-3 的共聚焦显微镜图像。请注意，突触区域存在较长暂停 RAB-3 的囊泡汇，尽管大多数 RAB-3 信号簇位于突触区域。突触区用红色框括起来。比例尺:20 μm。（B） 用于可视化轴突运输的延时记录的代表性图像。为了增强单个传输粒子在静止粒子上的可追溯性，突触区域最初被光漂白。紫色框区域中的下面板显示了顺行（橙色箭头）和逆行（蓝色箭头）运动事件的示例。面板从上到下表示连续的时间点。（C） （B） 中的延时记录绘制为动态图（时间与位置的关系的 2D 表示）。对角线表示移动事件，其中斜率表示速度。垂直线显示静止事件。紫色框是运动记录仪的放大部分，用于突出显示 （B） 中也显示的运输事件，并跟踪顺行（橙色）和逆行（蓝色）运输事件。垂直虚线表示暂停事件。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:优化采集步骤和参数以提高内源性轴突货物的可视化。 内源性 GFP::RAB-3 在 DA9 轴突的突触区可视化，在共聚焦转盘显微镜上拍摄单焦平面的图像。采集运动记录仪以可视化顺行 （从右到左） 和逆行 （左到右） 方向 （A-C） 的单个运输事件。（A） 运动图显示 RAB3 运输事件，没有（左运动图）或有集成漂白步骤。请注意，漂白步骤改进了连续传输事件（橙色箭头）之间暂停事件（由黄色箭头指示）的可视化效果。（B） 实施 2 x 2 像素合并有助于提高微弱 RAB3 传输事件的信号强度。图像以 300 毫秒的曝光时间采集，并且 （C） 曝光时间的增量增加（从最左侧的 100 毫秒到最右侧的 500 毫秒）有助于提高单个传输事件的信号强度。图像以 2 x 2 像素合并并使用初始光漂白步骤采集。所有运动记录仪显示 3 分钟的总持续时间，并以相同的比例绘制，因此由于连续成像点之间的时间间隔较长而具有较少采集时间点的运动记录仪具有较短的运动记录仪总长度。（D） 在 （A-C） 中从运动量计中减去背景荧光后每个运输事件的信号强度的量化。请注意，像素合并和照片漂白步骤是在 300 毫秒的曝光时间内获得的。使用 n 个事件进行 100 毫秒（n_个事件 = 27，n 个_动物= 2）、200 毫秒（n_个事件 = 30，n_个动物= 2）、300 毫秒（n_个事件 = 88，n_个动物= 6）、500 毫秒（n_个事件 = 12，n_个动物= 1），300 毫秒，无（w.o.）分档（n_个事件 = 31，n_只动物= 3），300 毫秒，有 （w） 分档（n_个事件 = 88，n_只动物= 6）和 300 毫秒， 2 x 2 分档，带漂白（n_个事件 = 88，n_只动物 = 6），无漂白。每个数据点代表在沿其轨迹的单个时间点随机选择的背景（轴突细胞质）减去后单个 RAB-3 转运事件的信号强度。使用 Kruskal-Wallis 检验比较曝光时间，然后使用 Dunn 多重比较，使用成对 Mann-Whitney 检验比较分箱和照片漂白。误差线表示标准偏差。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:生成运动记录仪并测量单个传输事件的分步程序。 （A） 将视频记录加载到斐济后，使用分段线工具沿着要分析的轴突段的长度跟踪一条线。（B） 使用 Kymoreslicewide 插件生成 kymograph（右面板），其参数如左面板所示。（C） 使用线性线工具跟踪单个传输事件，并将其存储到 ROI 管理器中。右侧面板显示用于生成结果表的测量设置。（D） 表中的结果用于计算传输参数。框表示协议的 methods 部分中描述的重要参数。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

方法和替代方法的局限性
在该协议中，我们优化了采集参数以可视化内源性标记的 RAB-3 的轴突转运，它与突触小泡前体相关。为了可视化 RAB-3，我们利用了最近发表的 FLIP-on::GFP::RAB-3 菌株⁶，并在细胞特异性启动子 （glr-4p） 下表达重组酶 Flippase25。这种策略允许我们用单个 GFP 荧光团标记 RAB-3。RAB-3 相对容易可视化，因为它在突触小泡前体上高度表达和高度富集，因此单个转运事件在来自细胞质背景的低信号上具有明亮的信号强度。其他轴突蛋白可能需要显微镜设置之外的额外优化策略，以实现运输事件的可视化。特别是对于低表达蛋白，分流 GFP 系统提供了很好的选择。在该系统中，GFP₁₁ 插入目标蛋白的内源性基因座，GFP_1-10 由细胞特异性启动子表达。该系统的一大优点是需要基因组插入的 DNA 修复模板体积小（约 70 个核苷酸），与插入整个荧光标签的 ORF 相比，这使得同源重组更有效^26,27。由于其体积小，可以将多个 GFP₁₁ 片段插入到内源性蛋白质中，从而放大每个蛋白质重组的 GFP 荧光团的数量，从而增强内源性蛋白质的荧光信号，从而增强运输包的荧光信号²⁸。

除了用分裂 GFP 或 GFP 方法标记蛋白质外，还可以利用其他基因编码的荧光团，这些荧光团在其光化学特性方面具有独特的优缺点，最近已经进行了比较²⁹。此外，通过使用 HALO 或 SNAP 标签³⁰ 内源性标记目标蛋白质，可以使用具有更多光稳定性的化学荧光团。

特别是对于在整个轴突中丰富的细胞质蛋白，可能需要条件标记方法。我们最近通过荧光显微镜使用时间控制标记来可视化这样一种货物，即内源性血影蛋白，以仅可视化新型合成的血影蛋白。对于具有单神经元分辨率的条件标记，我们将热休克驱动的重组酶表达与分裂 GFP 系统相结合³¹。

如果研究目标旨在了解细胞器的运输，那么与细胞器相关的蛋白质结构域的表达可以提供异位表达全长蛋白质的替代方案。

协议中的关键步骤
根据预期的表达水平优化蛋白质的可视化以及选择最佳标记策略的仔细准备对于内源性标记蛋白质的成功可视化尤为重要。许多神经元中大多数蛋白质的表达水平可以根据 Cengen¹³ 的转录组数据集进行估计。通过连接荧光团的多个拷贝，可以改善低表达或细胞质蛋白的转运事件的预期低信号强度。但请注意，对于任何标记实验，都必须注意不要破坏标记蛋白质的功能。如果相应突变体存在已知表型，则验证标记不会产生该表型非常重要。在没有已知表型的情况下，需要替代方法，这些方法会根据具体情况而有所不同。

轴突运输事件成像的一个关键步骤是动物的健康状况。在图像制备和成像过程中，应尽可能轻柔地对待动物（例如，使用发签而不是金属丝来转移瘫痪的动物，最大限度地减少在麻痹剂中的孵育时间，最大限度地减少成像时间以避免光毒性）。

修改和故障排除
虽然我们打算优化内源性蛋白质的轴突运输可视化，但采集参数的优化策略也适用于异位表达的蛋白质。特别是如果内源性表达水平太低而无法可视化转运事件，则蛋白质的异位表达可以提供另一种选择。

如果尽管内源性标记蛋白的信号强度很强，但无法记录到运输事件，则动物可能处于不健康状态。这可以通过在更温和的制备程序下准备动物进行显微镜检查来解决（例如，降低在麻痹剂中的孵育时间）。或者，传输事件可能很少见，并且 3 分钟的视频录制可能不足以捕获事件。通过延长视频录制的持续时间、增加成像动物的数量或通过在运输事件可能更频繁的不同发育阶段对动物进行成像，可以优化捕捉罕见的运输事件。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539
盖玻片（22 mm x 22 mm，No1）;金印盖玻片	Thomas Scientific	6672A14
左旋咪唑	ChemCruz	sc-205730
显微镜：尼康 Ti2 倒置显微镜、横河电机 CSU-W1 SoRa 扫描头、滨松 Orca-Fusion BT sCMOS 相机、尼康 CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA 油浸物镜、尼康 488nm 光刺激扫描仪，带 ET525/36 发射滤光片	尼康		转盘共聚焦显微镜
用于 Nikon Ti2 的 NIS-elements AR	Nikon		软件
普通预清洁显微镜载玻片	Thermo Scientific	420-004T
线虫菌株	标识符来源
rab-3（ox699[GFP：：flip-on：：rab-3]） （II）;shyIs43（glr-4p：：FLP-NLSx2;odr-1p：：RFP） （II）	Park et al. （DOI： 10.1016/j.cub.2023.07.052）	MTS1161	将存入 CGC （https://cgc.umn.edu/）