原代小鼠视网膜神经胶质 Müller 细胞的分离

Müller 细胞 （MCs） 是在视网膜组织中发现的主要和最丰富的神经胶质细胞。它们是在视网膜内提供结构完整性和代谢功能的关键参与者¹。MC 的战略结构分布在整个视网膜厚度上，从而为视网膜提供支持。除了支架状特性外，它们还具有视网膜神经元的代谢功能，为它们提供能量底物，包括葡萄糖和乳酸。这些功能对于维持健康的神经元功能至关重要。据报道，受损的 MC 会导致各种视网膜疾病，包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和青光眼 ^2,3。MC 可以是视网膜再生治疗的内源性细胞来源¹。它们也构成了视网膜的很大一部分，强有力的证据表明，在几个物种中，这些细胞可以被刺激以替代缺失的神经元²。它们与神经元有益地合作，圆锥形分支的 Müller 细胞末端密集地展开血管并连接视网膜的神经成分。为了维持神经元发育和神经元可塑性，Müller 细胞充当神经元的软基质，保护它们免受机械损伤³。此外，在病理情况下，Müller 细胞可能会分化为神经祖细胞或干细胞，复制或再生丢失的光感受器和神经元 ^2,3,4。Müller 细胞保留了视网膜干细胞的特性，包括不同程度的自我更新和分化潜力 ^5,6。Müller 神经胶质细胞具有重要的视网膜谱系，可产生神经营养因子、摄取和回收神经递质、在空间上缓冲离子并维持血视网膜屏障，以保持视网膜处于体内平衡 ^7,8,9。这凸显了 Müller 细胞作为治疗视网膜变性相关疾病的细胞疗法中一种有前途的工具的潜力。Müller 细胞是分布在整个视网膜中的原代神经胶质细胞，与神经元和血管相连。它们起着至关重要的保护作用，提供必要的结构和代谢支持，以维持视网膜细胞的活力和稳定性。遗憾的是，在文献中发现的从视网膜中分离原代 Müller 细胞的方案很少 ^10,11。

我们提出了一种可靠的分离和培养小鼠原代 Müller 细胞的增强方法。我们小组使用该方案从野生型 C57BL/6 小鼠和转基因小鼠中分离 Müller 细胞^12,13。年龄在 5 至 11 天之间，无性别偏好的小鼠用于该方案。细胞已传代多达 4 次;然而，在 P4 时，它们不再粘附在培养瓶上，因此很难培养出健康的培养物。培养物通常被视网膜色素上皮 （RPE） 细胞污染，因此在对细胞系进行任何其他实验之前，细胞应至少传代一次。传代允许进一步分离污染物。因此，提出的方案提供了一种快速有效的方法来分离小鼠 Müller 细胞，然后可以将其用作研究治疗靶点和评估视网膜疾病潜在治疗方法的可靠平台¹⁴。

所有动物实验均符合 ARVO 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明，并按照动物护理和使用研究所委员会 （IACUC） 和奥克兰大学政策（协议编号 2022-1160）批准的动物协议进行

1. 培养基和溶液制备

1. 通过在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，材料表中的详细信息）中补充 1：1000 稀释的青霉素/链霉素来制备 Müller 细胞眼溶液。例如，对于 10 mL 的 DMEM，添加 10 μL 青霉素/链霉素。
   注意：这是一种制备的简单无血清培养基。此外，在用于细胞培养工作之前，将完全培养基在 37 °C 水浴中加热。
2. 通过在 DMEM 中补充 10% 胎牛血清（FBS，热灭活）和 1% 青霉素/链霉素，制备完整的原代 Müller 细胞生长培养基。例如（500 mL DMEM 培养基 + 50 mL FBS + 5 mL 青霉素/链霉素）。
3. 用浓度为 200 U/mL 的胶原酶 IV 制备 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液（胰蛋白酶-EDTA 用于溶解计算量的胶原酶 IV 粉末以达到所需浓度）。

2. 眼球摘除术

1. 按照 IACUC 指南使用 CO₂ 吸入对小鼠进行道德安乐死。
   1. 简而言之，将动物置于 CO₂ 室中，以腔室体积/分钟的 30-70% 填充率引入 100% CO_{2，以达到} 2-3 分钟内快速失去知觉的目标，对小鼠的痛苦最小。
   2. 由于小鼠年龄较小 （~10 天），因此将颈椎脱位作为辅助方法，以确保适当的安乐死。
2. 用 70% 乙醇对工作区域消毒后，将鼠标放在无菌垫上。
3. 将镊子的臂放在眼睛后部，轻轻地从眼眶区域拉出，然后用 5/45 式镊子对眼眶区域施加压力以引起眼球突出，从而取出眼睛。
   注意：解剖前用 70% 乙醇消毒解剖工具，然后用磷酸盐缓冲盐水消毒。
4. 通过缓慢包裹眼睛，确保视神经仍然连接到眼睛。确保将视神经（视觉识别为白索）拉到眼睛后面。
   注意：此步骤不需要在显微镜下进行，可以在灭菌的工作台上进行。

3. 眼摘除的治疗

1. 用铝箔覆盖 15 mL 离心管，并在试管中加入 10 mL Müller 细胞眼溶液。
2. 将解剖的眼睛放入含有 Müller 细胞眼溶液的 15 mL 试管中，让它们在室温下放置过夜或约 18 小时。
3. 18 小时后，倒出眼液，并用 2-3 mL 温热 （37 °C） 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 短暂冲洗眼睛。
4. 倒出 PBS 并将眼睛移至含有 10 mL 胰蛋白酶溶液的 100 mm 培养皿中。（在步骤 1.3 中准备）。
   注：胰蛋白酶用于整个去核眼，作为解离剂，在解剖过程中促进细胞与视网膜层分离。解剖的视网膜有许多细胞，包括 RPE 细胞，这些细胞很粘，最有可能污染 Müller 细胞培养^{物 14}。显微镜检查清楚地表明，分离 5 天后（第一次更换培养基期间），RPE 细胞从板中分离并死亡¹³。用于 RPE 分离的培养基是 DMEM/F-12，其成分与 DMEM（用于 Müller 细胞分离）不同，含有丙酮酸钠和低葡萄糖。
5. 将培养皿放入培养箱中，在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 1.5 至 2 小时。
6. 孵育后，将眼睛转移到含有大约 5 mL 完整原代 Müller 细胞生长培养基的 60 mm 培养皿中。

4. 解剖

注：此程序必须在培养罩的无菌环境中进行。因此，必须用 70% 的酒精对通风橱表面以及所有工具和解剖显微镜进行彻底消毒。值得注意的是，该视频是在引擎盖外录制的，以便更好地看到和更清晰的演示目的。

1. 在培养皿中放入一小块消毒的实验室级组织，以帮助在解剖过程中稳定眼睛。将眼睛放在解剖显微镜下开始解剖。
   注：使用实验室级组织有助于在充满液体的培养皿（完全培养基）中操纵眼睛，确保精确解剖。
2. 使用 Vannas 剪刀和 M5S 式镊子去除结缔组织、眼外肌和视神经。
   1. 用 M5S 风格的镊子抓住眼睛，然后用 Vannas 剪刀或注射器针头在 ora 锯齿切片上切开。
      注意：眼睛的前部和后部之间有一条浅蓝色的圆线，称为 ora serrata，可以用作解剖过程中准确方向的标志。
   2. 用 M5S 式镊子抓住切口，从眼睛后部拉出或撕裂角膜。以小增量拉动以确保视网膜的完整性保持完整。
      注意：这些步骤是从眼罩的后部（神经和色素视网膜）中去除眼睛的前部（角膜、虹膜和晶状体）。
   3. 为了保持视网膜层的完整性，轻轻拉动并从神经视网膜上去除视网膜色素上皮。神经视网膜应没有任何黑色斑点，以尽可能确保分离的纯度，因为 RPE 层通常是粘性的并附着在神经元视网膜上。
   4. 将解剖的神经视网膜切成小块，然后再将其收集到板中，以确保细胞在板上均匀分布。
3. 将神经视网膜接种在含有 4 mL 完整原代 Müller 细胞生长培养基的 T25 培养瓶中。
4. 最后，将培养瓶放入培养箱中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。

5. 原代 Müller 神经胶质细胞的培养

1. 3-5 天内不要移动培养瓶，以促进细胞生长。
2. 第五天后更换培养基，此后每隔一天更换一次，直到细胞达到 90% 汇合。

6. 原代 Müller 神经胶质细胞的传代

1. 吸出 Müller 细胞培养基，然后在 PBS 中洗涤 2 mL，然后吸出 PBS。加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA （1x） 或足以覆盖板。
2. 在室温下孵育 5-10 分钟。
3. 确保在显微镜下将细胞从板上分离。然后，收集细胞悬液，并向收集管中加入 4 mL 预热 （37 °C） 完全原代 Müller 细胞生长培养基（在步骤 1.2 中制备）。
4. 以 300 x g 离心 7 分钟。吸出上清液后，将沉淀重悬于 10 mL 完整的原代 Müller 细胞生长培养基中。因为细胞数量可以根据解剖的眼睛数量而变化，因此，最好在接种和孵育之前对细胞进行计数。推荐的接种密度为 3.0 x 10⁶ 个细胞，溶于 T75 培养瓶中。
   注：细胞最多可传代 4-5 次。然而，最一致的实验结果是在 1-2 代后发现的。

7. 免疫荧光

注：使用免疫荧光方案对 Müller 细胞特异性进行染色和验证。以下是免疫荧光实验步骤的简要概述。此步骤在第一次传代¹² 后执行。

1. 将细胞接种到细胞培养室载玻片中（8 孔室载玻片每孔 30,000 个细胞）。
2. 将分离的细胞在完整的Müller细胞培养基（在步骤1.2中制备）中于37°C和5%CO₂下培养24-48小时。
3. 当细胞汇合 80-90% 时，吸出培养基并在每个孔上用 250-300 μL 1x PBS 洗涤腔室载玻片。
4. 在每个孔中用 250-300 μL 4% 多聚甲醛固定载玻片 10 至 15 分钟，然后用 PBS/TX-100 洗涤（每个 5 分钟/3 次）。
5. 在 37 °C 下加入封闭缓冲液 1 小时（参见 材料表）。
6. 吸出封闭溶液，然后添加对 Müller 细胞具有特异性的一抗，以使用谷氨酰胺合成酶和波形蛋白 ^5,12 确认分离细胞的纯度。在 37 °C 下孵育 3 小时（使用 1：100-1：200 的抗体浓度在封闭缓冲液中，体积为 150-200 μL/玻片）。用 PBS/TX-100 洗涤剂洗涤载玻片（各 5 分钟和 10 分钟）。
   注：选择这些抗体是因为它们是识别 Müller 细胞和确保 Müller 细胞培养成功和纯度的标志。
7. 加入二抗（抗体浓度范围为 1：1000，溶于 150-200 μL/玻片的封闭缓冲液中）并在 37 °C 下孵育 1 小时。 然后，用 PBS/Triton X-100 洗涤 3 次（每次 5-10 分钟）。
8. 滴一滴 DAPI 封固剂以标记细胞核，然后用盖玻片覆盖载玻片。放置盖玻片时避免气泡。
9. 使用荧光显微镜检查载玻片并捕获图像（参见 材料表）。
   注：用 ex/em 359/461 处的 DAPI 以 10 倍放大倍率定位细胞以定位细胞;更高的放大倍数可以捕获细胞。其他波长将取决于所选颜色。绿色 （GFP） - ex/em 488/510。红色 （Cy3）- ex/em 555/569。

验证分离的 Müller 细胞的特异性、纯度和屏障功能
为了确认分离的 Müller 细胞的活力、形态和独特品质，在光学显微镜下检查了这些细胞。记录 P0 和 P1 图像（图 1A）。为了检查分离的 Müller 细胞是否受到 RPE 细胞的污染并确认其纯度，使用对 RPE 细胞标志物 RPE65 具有特异性的抗体进行免疫荧光染色 （IF）。人视网膜色素细胞 （ARPE -19） 用作阳性对照。RPE65 染色的 RPE 细胞（红色和蓝色用于核染色）如图 1B 所示（下图）。RPE65 特异性抗体未对分离的 Müller 细胞进行染色（图 1B，上图）。RPE65 对 ARPE-19 细胞（红色）进行染色而没有对分离的细胞进行染色，这一事实表明分离的细胞不是 RPE 细胞。培养基中丙酮酸和低葡萄糖的存在为 RPE 细胞的生长创造了不利条件。因此，即使在 RPE 细胞污染的情况下，它们最终也会从培养瓶中分离。

此外，为了确认分离细胞的身份，使用 Müller 细胞特异性标志物的 Müller 细胞免疫荧光染色来确认 Müller 细胞的成功分离。使用了称为波形蛋白的细胞骨架中间丝蛋白12,13。此外，还使用了谷氨酰胺合成酶 （GS），它催化谷氨酸和氨的缩合反应形成谷氨酰胺，作为视网膜神经胶质 Müller 细胞的关键功能5。

总的来说，分离的细胞对 RPE65 染色阴性（红色，图 1B），波形蛋白阳性（绿色，图 1C）和 GS（绿色，图 1D）。IF 染色证实了分离的 Müller 细胞的成功分离（纯度和特异性）。图 1E 是波形蛋白（上图）和 GS（下图）的阴性对照，证实了抗体的特异性。

图 1：Müller 细胞分离的验证（纯度和特异性）。 （A） 传代的光学显微镜图像：传代零 （P0） 和 （P1） 形态。（B） RPE65 免疫染色联合 DAPI 核染色。（C） 高倍率 DAPI 核染色的波形蛋白免疫染色。（D） 相同高放大倍率下的 GS 免疫染色。（E） 阴性对照，以确认波形蛋白和 GS 抗体染色的特异性。比例尺 = 分别为 300 μm、300 μm、50 μm、20 μm、20 μm、50 μm、50 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

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