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原代小鼠视网膜胶质穆勒细胞的分离

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DOI：

10.3791/66237

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2024年8月30日

 ,  ,  ,  , 
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine

本文内容

摘要

本文描述了一种从小鼠眼球中分离视网膜胶质穆勒细胞的详细实验方案。该方案从小鼠眼球的摘除和解剖开始，随后进行穆勒细胞的分离、接种和培养。

摘要

视网膜的主要支持细胞是视网膜胶质穆勒细胞。它们覆盖整个视网膜表面，并与视网膜血管和视网膜神经元紧密相邻。由于其结构特点，穆勒细胞在健康的视网膜中执行多种关键功能，包括神经递质、视黄酸化合物以及离子（如钾离子 K⁺）的摄取与再循环。此外，它们还参与调节血流、维持血-视网膜屏障，并调控视网膜的代谢及营养供应。本文介绍了一种已建立的小鼠原代穆勒细胞分离方法。为了更好地理解各种小鼠眼病模型中涉及的分子机制，分离穆勒细胞是一种极佳的手段。本文详细描述了从小鼠中分离穆勒细胞的操作流程。从眼球摘除到细胞接种，整个过程耗时约数小时。接种后5至7天内不应更换培养基，以确保分离的细胞能够不受干扰地生长。接下来通过细胞形态学特征和特异性免疫荧光标记物对细胞进行鉴定。细胞传代次数最多为3至4次。

引言

Müller 细胞（MCs）是视网膜组织中主要且最丰富的胶质细胞。它们在维持视网膜结构完整性和代谢功能方面发挥关键作用1。Müller 细胞独特的结构贯穿整个视网膜厚度，从而为视网膜提供支撑。除了具有支架样特性外，它们还为视网膜神经元提供代谢支持，供应包括葡萄糖和乳酸在内的能量底物。这些功能对于维持神经元的正常功能至关重要。已有报道表明，Müller 细胞功能受损可导致多种视网膜疾病，包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变和青光眼2,3。Müller 细胞可作为视网膜再生治疗的内源性细胞来源1。它们在视网膜中占据显著比例，且有充分证据表明，在多种物种中，这些细胞可被诱导分化以替代缺失的神经元2。Müller 细胞与神经元协同作用，其呈锥形分支的终足密集包绕血管，连接视网膜的神经组分。为维持神经元发育和神经可塑性，Müller 细胞作为神经元的柔软基质，保护其免受机械性损伤3。此外，在病理条件下，Müller 细胞可能分化为神经前体细胞或干细胞，以复制或再生丢失的感光细胞和神经元2,3,4。Müller 细胞保留了视网膜干细胞的特性，具有不同程度的自我更新和分化潜能5,6。Müller 胶质细胞具有重要的视网膜谱系功能，可产生神经营养因子、摄取并回收神经递质、空间缓冲离子，并维持血-视网膜屏障，从而保持视网膜的稳态7,8,9。这凸显了Müller细胞在治疗视网膜变性相关疾病的细胞疗法中具有广阔的应用前景。Müller 细胞是分布于整个视网膜的主要胶质细胞，与神经元和血管均存在连接。它们发挥重要的保护作用，为维持视网膜细胞的存活和稳定性提供必要的结构与代谢支持。遗憾的是，目前文献中关于从视网膜分离原代Müller细胞的实验方案极为有限10,11。

我们提出了一种改进的方法，用于可靠地分离和培养小鼠原代 Müller 细胞。本课题组曾采用该方案从野生型 C57BL/6 小鼠及转基因小鼠中分离 Müller 细胞12,13。本实验适用年龄在 5 至 11 天之间、无性别偏好的小鼠。细胞最多可传代 4 次；然而，在第 4 代（P4）时，细胞停止贴壁，难以维持健康的培养状态。培养物常被视网膜色素上皮（Retinal Pigmented Epithelial, RPE）细胞污染，因此在对细胞系进行任何进一步实验之前，应至少传代一次。传代有助于进一步去除污染物。因此，本方案提供了一种快速且有效的方法来分离小鼠 Müller 细胞，可作为研究视网膜疾病治疗靶点和评估潜在疗法的可靠平台14。

方案

所有动物实验均遵循ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用的规定，并根据奥克兰大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案以及奥克兰大学相关政策进行（方案编号2022-1160）

1. 培养基与溶液的配制

  1. 通过在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，详见材料表）中添加青霉素/链霉素（稀释比例为 1:1000）来制备 Müller 细胞眼溶液。例如，对于 10 mL 的 DMEM，加入 10 µL 青霉素/链霉素。
    注意：这是一种简单的无血清培养基。此外，在用于细胞培养前，需将完全培养基在 37 °C 水浴中预热。
  2. 通过在 DMEM 中添加 10% 胎牛血清（FBS，热灭活）和 1% 青霉素/链霉素，制备完全的原代 Müller 细胞生长培养基。例如（500 mL DMEM 培养基 + 50 mL FBS + 5 mL 青霉素/链霉素）。
  3. 制备含胶原酶 IV 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，其中胶原酶 IV 浓度为 200 U/mL（使用胰蛋白酶-EDTA 溶解计算量的胶原酶 IV 粉末以达到所需浓度）。

2. 去核

  1. 使用 CO 对小鼠实施安乐死2 根据IACUC指南进行吸入处理。
    1. 简而言之，将动物放入 CO2 腔室以引入100% CO2 以30-70%的腔室体积/分钟的填充速率通入CO2 在2-3分钟内实现小鼠快速无意识，同时将其不适感降至最低。
    2. 由于小鼠年龄较小（约10天），需采用颈椎脱位作为辅助方法，以确保正确实施安乐死。
  2. 用70%乙醇对工作区域进行消毒后，将小鼠置于无菌垫上。
  3. 使用镊子夹住眼球后部，轻轻从眼眶区域牵拉，再用5/45型镊子对眼眶区域施加压力，使眼球突出，从而摘除眼球。
    注意：解剖前，先用70%乙醇对解剖工具进行灭菌，再用磷酸盐缓冲液处理。
  4. 确保在缓慢摘除眼球时视神经仍与眼球相连。操作时务必向后牵拉位于眼球后方的视神经（肉眼识别为一条白色细索）。
    注意：此步骤无需在显微镜下操作，可在无菌台面上进行。

3. 去核眼球的处理

  1. 用铝箔包裹一个15 mL离心管，并向管中加入10 mL Müller细胞眼组织溶液。
  2. 将解剖好的眼球放入装有Müller细胞眼组织溶液的15 mL离心管中，在室温下静置过夜，约18小时。
  3. 18小时后，倾去眼组织溶液，用2–3 mL预热（37 °C）的磷酸盐缓冲液（PBS）短暂冲洗眼球。
  4. 倾去PBS，将眼球转移至一个含有10 mL胰蛋白酶溶液的100 mm培养皿中（该溶液按步骤1.3制备）。
    注意：胰蛋白酶作用于完整摘除的眼球，作为解离剂，有助于在解剖过程中使视网膜各层细胞分离。解剖所得的视网膜含有多种细胞，包括视网膜色素上皮（RPE）细胞，这类细胞具有黏附性，最可能污染Müller细胞培养物14。显微观察明确显示，在分离培养5天后（首次更换培养基时），RPE细胞从培养板上脱落并死亡13。用于RPE细胞分离的培养基为DMEM/F-12，其成分与用于Müller细胞分离的DMEM不同，含有丙酮酸钠和低浓度葡萄糖。
  5. 将培养皿放入培养箱，在37 °C、5% CO2条件下孵育1.5至2小时。
  6. 孵育结束后，将眼球转移至一个含有约5 mL完全原代Müller细胞生长培养基的60 mm培养皿中。

4. 解剖

注意：此操作必须在无菌培养罩内进行。因此，使用70%酒精彻底消毒培养罩表面、所有工具以及解剖显微镜至关重要。需要注意的是，视频为在培养罩外录制，以便获得更好的可见性和更清晰的演示效果。

  1. 在培养皿中放置一小块灭菌的实验级纸巾，以帮助在解剖过程中稳定眼球。将眼球置于解剖显微镜下，开始解剖操作。
    注：使用实验级纸巾有助于在充满液体（完全培养基）的培养皿中灵活移动眼球，确保解剖操作的精确性。
  2. 使用Vannas剪刀和M5S型镊子去除结缔组织、眼外肌和视神经。
    1. 用M5S型镊子夹住眼球，用Vannas剪刀或注射器针头在锯齿缘部位做切口。
      注：眼球前部与后部之间有一条浅蓝色的环形线，称为锯齿缘，可作为解剖过程中精确定位的解剖标志。
    2. 用M5S型镊子夹住切口，将角膜从前部眼球向后部撕离。应分小步轻柔操作，以确保视网膜结构的完整性不受破坏。
      注：这些步骤旨在将眼球前部（角膜、虹膜和晶状体）从前部眼杯（神经视网膜和色素视网膜）中完整分离。
    3. 为保持视网膜各层的完整性，应轻柔牵拉，将视网膜色素上皮层从神经视网膜上分离。神经视网膜应无任何黑色斑点，以尽可能确保分离的纯度，因为RPE层通常具有黏性，易附着于神经视网膜。
    4. 在将神经视网膜收集至培养板前，将其剪成小块，以确保细胞在培养板上均匀分布。
  3. 将神经视网膜接种至含有4 mL完全原代Müller细胞生长培养基的T25培养瓶中。
  4. 最后，将培养瓶放入培养箱，在37 °C、5% CO2条件下进行培养。

5. 原代穆勒胶质细胞的培养

  1. 请勿移动烧瓶，持续 3-5 天以促进细胞生长。
  2. 第五天后更换培养基，之后每隔一天更换一次，直至细胞融合度达到 90%。

6. 原代 Müller 胶质细胞的传代

  1. 吸去 Müller 细胞培养基，加入 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，随后吸除 PBS。加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1x），或足量以覆盖培养皿底部。
  2. 在室温下孵育 5–10 分钟。
  3. 在显微镜下确认细胞已从培养皿上脱落。然后收集细胞悬液，并向收集管中加入 4 mL 预热（37 °C）的完全初级 Müller 细胞生长培养基（按步骤 1.2 配制）。
  4. 以 300 ×g 离心 7 分钟。吸除上清液后，将沉淀重悬于 10 mL 完全初级 Müller 细胞生长培养基中。由于细胞数量可能因解剖眼数目的不同而有所差异，因此建议在接种和孵育前进行细胞计数。推荐的接种密度为每 T75 培养瓶接种 3.0 × 106 个细胞。
    注意：细胞可传代 4–5 次。然而，最稳定的实验结果通常在传代 1–2 次后获得。

7. 免疫荧光

注意：使用免疫荧光方案 对 Müller 细胞特异性进行染色和验证。以下是免疫荧光方案的简要概述。此步骤在第一次传代后进行12。

  1. 将细胞接种至细胞培养腔室载玻片中（8孔腔室载玻片每孔接种30,000个细胞）。
  2. 在37 °C、5% CO2条件下，使用完全Müller细胞培养基（步骤1.2中配制）对分离的细胞进行24–48小时的培养。
  3. 当细胞融合度达到80–90%时，吸除培养基，并用250–300 μL的1× PBS对每个孔进行清洗。
  4. 每孔加入250–300 μL的4%多聚甲醛，固定10–15分钟，随后用PBS/TX-100洗涤（每次5分钟，共3次）。
  5. 加入封闭缓冲液，在37 °C孵育1小时（参见材料表）。
  6. 吸除封闭液，然后加入针对Müller细胞的特异性一抗，使用谷氨酰胺合成酶和波形蛋白抗体来验证分离细胞的纯度5,12。在37 °C孵育3小时（抗体稀释比例为1:100–1:200，溶于150–200 μL/孔的封闭缓冲液中）。用PBS/TX-100洗涤载玻片（分别洗涤5分钟和10分钟，各一次）。
    注意：选择这些抗体是因为它们是鉴定Müller细胞的标志性分子，可确保Müller细胞培养的成功性和纯度。
  7. 加入二抗（抗体稀释比例为1:1000，溶于150–200 μL/孔的封闭缓冲液中），在37 °C孵育1小时。然后用PBS/Triton X-100洗涤三次（每次5–10分钟）。
  8. 在盖玻片覆盖载玻片前，滴加一滴DAPI封片液以标记细胞核。放置盖玻片时避免产生气泡。
  9. 使用荧光显微镜检查载玻片并采集图像（参见材料表）。
    注意：使用DAPI在激发/发射波长359/461 nm、10倍物镜下定位细胞；更高倍数物镜可用于拍摄细胞图像。其他荧光通道的波长取决于所选荧光染料：绿色（GFP）激发/发射波长为488/510 nm；红色（Cy3）激发/发射波长为555/569 nm。

结果

分离穆勒细胞特异性、纯度及屏障功能的验证
为确认分离所得穆勒细胞的活性、形态及特异性特征，使用光学显微镜对细胞进行观察，并记录了P0和P1代细胞的图像（图1A）。为检测分离的穆勒细胞是否被视网膜色素上皮（RPE）细胞污染并验证其纯度，采用针对RPE细胞标志物RPE65的特异性抗体进行免疫荧光染色（IF）。人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）作为阳性对照。RPE65染色阳性的RPE细胞（细胞核染为红色和蓝色）如图1B（下图）所示。RPE65特异性抗体未对分离的穆勒细胞产生染色信号（图1B，上图）。RPE65可染色ARPE-19细胞（红色），但不染色分离细胞，这一结果表明所分离的细胞并非RPE细胞。培养基中含有丙酮酸且葡萄糖浓度较低，这种条件不利于RPE细胞的生长。因此，即使存在RPE细胞污染，这些细胞最终也会从培养瓶中脱落。

此外，为了确认分离细胞的身份，采用针对 Müller 细胞特异性标志物的免疫荧光染色来验证 Müller 细胞成功分离。使用了细胞骨架中间丝蛋白——波形蛋白（vimentin）12,13。此外，谷氨酰胺合成酶（GS）也被用于鉴定，该酶催化谷氨酸与氨缩合生成谷氨酰胺，是视网膜胶质 Müller 细胞的关键功能蛋白5。

总体而言，分离的细胞对RPE65呈阴性染色（红色，图1B），对波形蛋白（vimentin，绿色， 图1C）和谷氨酰胺合成酶（GS，绿色，图1D）呈阳性染色。免疫荧光染色结果证实了所分离的Müller细胞的分离效果良好（纯度和特异性）。图1E 为波形蛋白（上图）和GS（下图）的阴性对照，验证了抗体的特异性。

细胞培养显微镜系列；RPE65、波形蛋白（Vimentin）、GS 标记物染色；分化分析。
图1：穆勒细胞分离的验证（纯度与特异性）。（A）传代零代（P0）和一代（P1）的明场显微镜图像，显示细胞形态。（B）RPE65 免疫荧光染色结合 DAPI 核染色。（C）波形蛋白（Vimentin）免疫荧光染色结合 DAPI 核染色，高倍放大。（D）相同高倍放大下的 GS 免疫荧光染色。（E）阴性对照，用于验证波形蛋白和 GS 抗体染色的特异性。比例尺 = 300 μm、300 μm、50 μm、20 μm、20 μm、50 μm、50 μm（依次对应）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本实验室此前已记录从小鼠中分离原代视网膜色素上皮细胞（RPE）的方法。本文描述了一种详细的原代 Müller 细胞分离演示方案。该流程包括小鼠眼球摘除、处理、解剖、细胞收集、接种、培养以及从小鼠眼睛中分离的 Müller 细胞的鉴定。该方法基于先前发表文献中已成功使用的方案 以及我们在近期发表文章中改进后的方案12，13。尽管各步骤较为直接，但成功的 Müller 细胞分离需要严格遵守特定限制条件和关键要求。经过多次反复试验以优化该方案后，我们确定了多个影响其成功率的关键因素。

根据我们的实验观察，为了使分离的细胞能够传代培养至四代，理想的小鼠日龄应在5至11天之间。培养效果还受到分离并培养的眼球数量的影响。对于单次分离操作，至少需要两个眼球才能获得足够数量的细胞以实现生长和增殖。另一个重要方面是摘除眼球到接种细胞之间的时间间隔；因此，该步骤需相对较快地完成。观察发现，对眼组织进行长时间操作会对细胞贴壁及增殖能力产生不利影响。为确保分离后的细胞之间距离足够近以促进增殖，我们建议使用T25培养瓶。在完成第一代传代后，可将细胞接种于T75培养瓶中。此外，在细胞分离和接种后，至少5天内不应干扰细胞，包括将组织培养瓶从培养箱中取出或更换培养基。最后，细胞通常只能传代约四次，之后便不再贴壁。尽管该实验流程简单且易于操作，但仍存在一些局限性，例如小鼠的日龄要求、细胞可传代次数有限等。

目前关于穆勒细胞分离的实验方案并不多，但本方案与现有方案之间存在一些显著差异5,14。首先，摘除眼球至开始分离之间的时间间隔存在明显不同。其他方案建议在摘除眼球后尽快进行解剖，通常在10分钟内完成；而本方案建议至少静置18小时，因为在此方案中该处理获得了最佳的分离效果。本方案与其他方案之间的另一重要差异在于酶处理眼睛组织的时机。在本方案中，酶处理是在任何解剖操作之前进行的，甚至在去除结缔组织和眼外肌之前就已实施；而其他方案则是在酶处理前先将视网膜从眼球中分离出来。此外，所用酶的配方也不同。本方案中的酶溶液由胰蛋白酶和IV型胶原酶组成，而类似方案则使用木瓜蛋白酶和DNase进行组织消化。另外，培养容器也不同：本方案建议首次传代后先在T25培养瓶中培养，再转移至T75培养瓶；而其他方案通常使用培养皿或多孔板。最后，本方案建议在培养初期（5–7天内）不要扰动培养瓶，以促进细胞生长；而其他方案则通常在培养24小时后即进行换液。

披露

作者声明不存在与本文内容相关的利益冲突。

致谢

本工作由美国国家眼科研究所（National Eye Institute, NEI）资助，项目编号为 R01 EY029751-04。我们谨向 Sylvia B. Smith 博士致谢，本实验方案是在她建立的穆勒细胞分离方案基础上修改而成。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
烧杯：100 mLKIMAX14000
胶原酶 IV Worthington LS004188
一次性刻度移液管：3.2 mL，无菌13-711-20
DMEM (1X) Thermo Scientific11885084用于培养Müller细胞的培养基 
胎牛血清 (FBS)gibco26140079用于完全Müller细胞培养基
谷氨酰胺合成酶Cell signalling80636
Heracell VISO 160i CO2 培养箱Thermo Scientific50144906
Kimwipes 擦镜纸Kimberly-Clark34155
带针鲁尔锁注射器，21 G × 1 1/2 英寸，无菌，一次性使用，3 mLB-D309577
微量离心管：2 mLGrainger11L819
青霉素-链霉素溶液 (Pen Strep)gibco15140-122用于完全Müller细胞培养基
磷酸盐缓冲液 (PBS)Thermo ScientificJ62851.AP
正向作用镊子，型号 5/45Dumont72703-DZ
标准直头虹膜剪，11.5 cmGARANA INDUSTRIES2595
Sorvall St8 离心机ThermoScientific75007200
Stemi 305 体视显微镜Zeissn/a
手术刀片，#11，不锈钢Bard-Parker371211
悬浮培养皿，60 mm × 15 mm 型Corning430589
组织培养皿：100 mm × 20 mm 型Corning353003
Tornado 管：15 mLMidsciC15B
Tornado 管：50 mLMidsciC50R
镊子 5MS，8.2 cm，直头，尖端尺寸 0.09×0.05 mmDumont501764
正向作用型镊子，型号 5，生物学用途，Dumostar，抛光表面，总长 110 mmElectron Microscopy Sciences Dumont50-241-57
中等吸收性垫巾：23" × 36"McKesson4033
Vannas 弹簧剪，切割刃 2.5 mmFST15000-08
波形蛋白 (Vimentin) invitrogenMA5-11883
Zeiss AxioImager Z2Zeissn/a
Zeiss Zen Blue 2.6Zeissn/a

参考文献

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